Name: production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors
Uploaded: 2019-01-29T14:00:00
Duration: 9 min 21 s
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M.R. es apoyado por un Fonds voor beca postdoctoral Wetenschappelijk Onderzoek Flandes (FWO) (133722/1204517N) y reconoce el apoyo continuo de la Fundación Cardiovascular de Colombia y el Departamento Administrativo de ciencia, Tecnología e innovación (Grant CT-FP44842-307-2016, código de proyecto 656671250485). M.M. es apoyado por una Beca doctoral FWO (1S48018N). M.G.H. fue apoyado por una beca institucional VIB y apoyo externo de la Fundación de Letrán de Thierry (SOD-VIP), la Fundación para la investigación de Alzheimer (SAO-FRA) (P #14006), FWO (Grant 1513616N) y el Consejo Europeo de investigación (CEI) (Starting Grant 281961 - AstroFunc; Prueba de concepto subvención 713755 - AD-VIP). Los autores reconocen Jeason Haughton por su ayuda con la cría de ratón, Stephanie Castaldo por su ayuda realizar las inyecciones de vena de la cola y Caroline Eykens para proporcionar las imágenes de células HEK293T transfected. M.G.H. reconoce Michael Dunlop, Peter Hickman y Dean Harrison.

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Los autores no tienen nada que revelar.

La producción de vectores AAV recombinantes descritos aquí utiliza materiales y equipos comunes a la mayoría de los laboratorios de biología molecular e instalaciones de cultivo de células. Permite al usuario obtener vectores AAV grado puro, preclínica que se pueden utilizar para varios tipos de células y tejidos de destino a través de una gama de aplicaciones in vitro e in vivo . Una de las mayores ventajas de este protocolo, comparado con otros (es decir, basado en el CsCl purificación), es el más corto tiempo de trabajo necesario. Vectores AAV listo para su uso son obtenibles en un plazo máximo de 6 días hábiles después de la inicial de la transfección de células HEK293T.
Varios factores pueden influir negativamente el rendimiento final o la calidad de los vectores AAV. Eficiencia de transfección deficiente es una de las principales razones de bajo rendimiento viral33. Una recomendación importante es la utilización de células HEK293T que no han sido pasados más de 20 veces y no tienen una confluencia celular superior al 90% en el momento de transfección21. Además, el método de transfección seleccionado tiene un impacto importante en los resultados. Este protocolo se basa en el uso del PEI. El PEI es un polímero catiónico con la capacidad de entregar ADN exógeno en el núcleo de la célula a través de la generación de complejos de ácido nucleico, conocido como polyplexes, que son tomados por la célula y son objeto de trata a través de endosomas34y polímero. Basado en el PEI la transfección es fácil y rápido de realizar, en contraste con otros métodos utilizados, como la coprecipitación de ADN con fosfato de calcio35. También, basado en el PEI la transfección es mucho más barata comparado con otros métodos recién introducidas, como el uso de lípidos catiónicos y transfección mediada por el imán de36.
La estrategia de purificación desempeña un papel clave en el protocolo. En comparación con otros métodos, basado en el iodixanol purificaciones tienden a contienen un mayor porcentaje de partículas virales vacías (20%)20. Esto se compensa, en un grado, por el hecho de que base de iodixanol purificación resulta habitualmente en preparaciones de vector AAV con una proporción de partículas a la infectividad de menos de 100. Esto representa una mejora significativa en comparación con los procedimientos convencionales basados en CsCl, que substancial pérdida de infectividad de la partícula es reportado37. Otro método alternativo común para purificar los vectores AAV es purificación basados en cromatografía. Sin embargo, este método tiene el gran inconveniente que una columna específica se requiere para cada cápside de vector utilizado: por ejemplo, mientras que AAV2 es clásico aislados utilizando columnas de heparina, esta metodología no funciona con AAV4 y AAV5, que no poseen heparina sitios en su cápsida38. Teniendo en cuenta que la purificación cromatografía también es costosa, purificación de iodixanol es generalmente más conveniente para los laboratorios que deseen producir lotes de alta calidad de vectores AAV en una pequeña escala33,39, 40. sin embargo, para maximizar el rendimiento final y la pureza del vector, es necesario mucho cuidado al hacer los gradientes de iodixanol. Las diferentes fracciones de iodixanol deben transferirse al ultracentrifugación tubo con una pipeta Pasteur estéril cuya punta toca la pared del tubo: iodixanol debe ser expulsado de la pipeta lentamente y continuamente. Como las partículas de vector se acumulan en la capa de iodixanol 40%, cuidado debe ser tomado para asegurar que las interfaces de gradiente no mezclen20. Finalmente, la fracción que contiene el vector debe ser recuperada por la inserción de una aguja Roma de acero inoxidable con un calibre no mayor que 20 G. Para maximizar la recuperación del vector, la fracción claro deberá ser recuperada en su totalidad. Durante este paso, el tiempo es crítico. Para evitar comprometer la pureza de la preparación, es fundamental para detener la colección antes de otras fases (contaminantes) del degradado que se recogen.
Las diferencias en el título del vector obtenido pueden atribuirse también a la capacidad intrínseca del vector para producir partículas de envasados. Una comparación entre diferentes serotipos AAV mostró que algunos vectores AAV son más difíciles de producir en un título más alto que otros (por ejemplo, AAV2)41. Precipitación del vector, durante la etapa de desalación, puede ser una posible razón de un título menor y fácilmente prevenir evitando concentración33. Por otra parte, también es posible que la eficiencia de purificación basados en gradiente de iodixanol difiere ligeramente entre serotipos y, por lo tanto, se pueden observar discrepancias en el título obtenido con diferentes serotipos41.
Finalmente, debe señalarse que a pesar de qPCR es un método muy preciso de cuantificación de ADN se observa cierta variabilidad inherente en la técnica. Exactitud en la valoración depende principalmente de la pipeteo preciso y Vortex adecuada de las soluciones. Para garantizar el título más preciso de la lectura, se puede repetir la qPCR independientemente, y un promedio de los valores obtenidos. La elección de primers presentadas en este protocolo se basa en la secuencia del promotor CBA en el plásmido pTransgene utilizado en nuestro laboratorio. El promotor de la CBA es un fuerte promotor sintético que es ampliamente utilizado en el campo del vector a la expresión de la unidad a través de múltiples tipos de células. Incorpora varios elementos, incluyendo el elemento potenciador temprano del citomegalovirus (CMV); el promotor, primer exón y el primer intrón del gene del CBA; y el aceptador del empalme del gene del β-globin de conejo. Sin embargo, se pueden diseñar cartillas para prácticamente cualquier elemento ubicado en el casete de expresión (incluyendo el promotor transgénico y elementos reguladores). La comparación del título a través de lotes de también es posible, proporcionar cartillas se utilizan contra las regiones comunes a los vectores en cuestión.
En conclusión, este protocolo puede utilizarse para producir vectores AAV con una variedad de cápsida, configuraciones de genoma, promotor tipos y cargas de transgenes. Esto permitirá a los usuarios para adaptarse fácilmente a las características finales de sus vectores para satisfacer mejor las necesidades experimentales. En el ejemplo presentado en los resultados representativos, el uso de PHP. Cápside de B, que cruza eficientemente el BBB, dio expresión génica altamente eficiente en el SNC, la siguiente cola vena inyección32. La administración sistémica de vectores penetrantes del CNS tiene ventajas considerables en términos de posibles efectos secundarios2,17,32. Una posible alternativa a la inyección periférica, evitando las salvedades de técnicas invasivas, es la entrega intratecal, que consiste en entrega del vector AAV en el líquido cefalorraquídeo. Esta ruta de entrega ha demostrado para ser eficaz, mostrando expresión generalizada del transgen en el SNC, menos efectos off-target en órganos periféricos y bajos niveles de respuesta inmune42. Sin embargo, las inyecciones intratecales son mucho más difícil, ya que requieren mayores conocimientos técnicos que la inyección de la vena de la cola.
Desarrollo posterior de la cápside a perfeccionar esta tecnología será conducido por las oportunidades para el uso del vector AAV en usos de la terapia génica. Estos enfoques ofrecen atractivas posibilidades para tratar trastornos de CNS actualmente incurables, como la esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Alzheimer18.

En los últimos 30 años, tipo de aireación ha sido diseñados para crear vectores AAV recombinantes, que han demostrado para ser excepcionalmente útiles para la transferencia de genes en el CNS de1,2,3,4, 5,6 y gene terapia se acerca a la enfermedad (incluyendo terapias aprobadas por la FDA y EMA)4,7. Su idoneidad para el uso en el SNC deriva en gran parte de su capacidad de infectar las células no se dividen, poste-mitotic, suelen encontrarse en el CNS8. Sin embargo, los vectores de AAV tienen también la ventaja de permitir una expresión a largo plazo de cualquier transgen terapéutico dado4,9 , mientras que una respuesta inmune más suave en comparación con otros vectores virales7, 8,10,11,12.
Los elementos principales de cualquier vector AAV son el genoma y la cápside. Aireación de tipo salvaje es monocatenario (ss) virus de la DNA con un genoma de aproximadamente de 5 kilobases (kb)13. Para la producción de vectores AAV recombinantes, los genes rep y cap (necesarios para la replicación del genoma y el ensamblaje de la cápside viral) son eliminados del genoma de la AAV de tipo salvaje y proporcionados en el transporte, dejando espacio para un cassette de expresión que contiene el transgén14,15. Las secuencias repetición terminal invertidas (RTI) del genoma viral original son los únicos elementos retenidos en un vector AAV, ya que son esenciales para la replicación y embalaje3,10,14. Vectores AAV pueden diseñarse para mejorar la expresión del transgen; una mutación en uno de los ITRs conduce a la formación de un lazo de horquilla que efectivamente permite la generación de un complementario DNA filamento3,7,15. La principal ventaja de esta configuración, como un genoma de uno mismo-complementarios (sc), es que ignora la necesidad de síntesis del segundo filamento típico en el ciclo de vida convencional de aireación, aumenta considerablemente la velocidad y los niveles de expresión del transgen 1. sin embargo, el uso de un genoma de scAAV reduce la capacidad de carga del vector 2,4 kb aproximadamente. Esto incluye el transgen secuencias, así como cualquier secuencias reguladoras tales como promotores o sitios de unión de microARN, para limitar la expresión de tipos específicos de la célula16.
La cápside AAV determina la interacción de la célula de vector-host y confiere un grado de tropismo de tejido o tipo celular para un serotipo de la AAV, que también puede ser explotada para limitar la expresión del transgén a lugares específicos. Varios serotipos AAV se encuentran en la naturaleza, mientras que otros han sido producidos en laboratorios a través de enfoques recombinantes (es decir, PHP. B). Además, algunos cápsida también confiere otras características útiles, tales como la capacidad para cruzar el BBB, resultando en la entrega de los transgenes en el SNC después de la administración sistémica. Esto se ha demostrado para AAV9, así como el recientemente descrito PHP. B cápsida17. Como consecuencia, estos serotipos están demostrando para ser particularmente relevante para los nuevos enfoques de la terapia del gene para neurodegenerativas trastornos1,17,18.
El objetivo de este protocolo es describir un método rentable para la producción en pequeña escala de los vectores AAV con alto título y pureza. Aunque los resultados presentados aquí usan el PHP. Cápside de B y un cassette de expresión scAAV, el protocolo es conveniente para la producción de varios serotipos del vector AAV y configuraciones de genoma, lo que permite máxima flexibilidad experimental. Sin embargo, el rendimiento de vector y la pureza final pueden variar según el serotipo solicitado.
El protocolo sí mismo es una variante del método clásico tri-transfección para la producción de vectores virales e incorpora el uso de un gradiente de iodixanol para vector de limpiar, que, en comparación con el clásico uso de gradientes de cesio cloruro (CsCl), ha sido divulgado para producir vectores AAV de mayor pureza en una manera más eficiente19,20,21.
Los pasos de la transfección, la purificación y la concentración se pretenden realizarse según buenas prácticas de laboratorio (BPL) en un laboratorio de cultivo de tejidos para trabajo de vector viral. Cada tarea debe realizarse en cumplimiento de la legislación nacional y local relativas a la producción de vectores virales y utilizar. Trabajo debe realizarse bajo una campana de flujo laminar y en condiciones estériles. Dentro de las instalaciones de vector, se recomienda usar un delantal de laboratorio, además de la bata de laboratorio regular cultivo de tejidos. Por otra parte, un doble par de guantes y botas de plástico, se debe usar en todo momento.
Antes de comenzar la producción de vectores, asegurar todo el equipo necesario y los plásmidos son disponibles. 1) pCapsid plásmido contiene el gen rep que codifica cuatro proteínas no estructurales necesarias para la replicación, es decir, Rep78, Rep68, Rep52 y Rep40 y el gen de tapa que codifica tres proteínas estructurales de la cápside, a saber, VP1, VP2 y VP3. 2) pHelper plásmido contiene los genes E4, E2Ay VA de adenovirus, que facilitan la producción de AAV en células HEK293T. 3) pTransgene plásmido contiene el casete de expresión de transgenes, flanqueado por dos RTI. Estos plásmidos pueden ser sintetizados de novo en el laboratorio utilizando secuencias disponibles en línea22. Para plásmidos hacen de novo, especialmente aquellos que contienen transgenes novela, secuenciación es necesaria, para asegurarse de que el transgen y RTI es correctos. Alternativamente, premade plásmidos pueden adquirirse directamente a través de repositorios de plásmido en línea. Cuando sea necesario, plásmidos pueden ser amplificados y purificaron usando kits estándar, según las instrucciones23 el fabricante.
Título del vector y la pureza pueden afectar negativamente la capacidad de transducción de los vectores. Protocolos adicionales se suministran para evaluar la calidad del vector producido. Los vectores finales será útiles para estudios de la función de la célula del CNS en aplicaciones tanto in vitro e in vivo .

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Plasmid production</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTransgene plasmid</td>
			<td>De novo design or obtained from a plasmid repository</td>
			<td>N/A</td>
			<td>See step 1 of main protocol for further details</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCapsid</td>
			<td>De novo design or obtained from a plasmid repository</td>
			<td>N/A</td>
			<td>See step 1 of main protocol for further details</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHelper</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>240071</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Plus maxi kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12963</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV Helper-Free System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>240071</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Cell culture and transfection </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, no glutamine</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11960-044</td>
			<td>Supplement DMEM with FBS (1% or 10% v/v) and GlutaMAX 200 mM (1% v/v) then filter sterilize the medium using a 0.22 mm filter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10500-064</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX supplement</td>
			<td rowspan="2">GIBCO</td>
			<td rowspan="2">35050038</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(200 mM)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filter system</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430769</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (DPBS) with no calcium and no magnesium</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cells</td>
			<td>American Tissue Culture Collection</td>
			<td>CRL3216</td>
			<td>Upon receipt, thaw the cells and culture as described in the protocol. After a minimal number of passages, freeze a subfraction for future in aliquots.&#160;Always use cells below passage number 20. Once cultured cells have been passaged more than 20 times, restart a culture from the stored aliquots</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes</td>
			<td>Greiner Cellstar</td>
			<td>639160</td>
			<td>15 cm diameter culture dishes</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-904</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>23966-2</td>
			<td>PEI in powder form is dissolved at 1 &#181;g/&#181;L in deionized water (ddwater) at pH=2 (use HCl). Prepare in a beaker and stir for 2-3 h. When dissolved, bring the pH back to 7 with NaOH. Filter sterilize and store the resuspended stock solution in 1 ml aliquots at -20 &#176;C. PEI aliquots can freeze/thawed multiple times.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virkon solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9821357</td>
			<td>Disinfect any material that has been in contact with assembled viral particles with Virkon solution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutexi long-sleeve aprons</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11735423</td>
			<td>Wear an apron over the top of a regular lab coat</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand maximum protection disposable overshoes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15401952</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">AAV Purification and desalting</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optiprep density gradient medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Optiprep is a 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile). CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z627992</td>
			<td>Sterilize before use</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiSeal Polypropylene tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>361625</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase (250 U/&#181;L)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td>Supplied as a ready-to-use solution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodisc syringe filter</td>
			<td>Pall corporation</td>
			<td>4614</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnifix syringe (5mL)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4617053V</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt syringe needle</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z261378</td>
			<td>Stainless steel 316 syringe needle, pipetting blunt 90&#176; tip gauge 16, L 4 in. Referred to in the text as a blunt-end needle</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua Ecotainer</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>0082479E</td>
			<td>Sterile endotoxin-free water. Referred to as &#39;Ultrapure water&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon ultra-15 centrifugal filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td>These filters concentrate the final product by collecting the viral particles in consecutive centrifugation steps</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F68 (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>24040032</td>
			<td>Non-ionic surfactant. Dilute in sterile PBS to use at 0,01% (v/v)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps (2 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-374</td>
			<td>Use skirted tubes for easy handling</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">AAV Titration </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Restriction enzyme: StuI (10 U/&#181;L)</td>
			<td rowspan="2">Promega</td>
			<td rowspan="2">R6421</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I (1 U/&#181;L)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>EN0521</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3115852001</td>
			<td>Reconstitute in ultrapure water and use at a final concentration of 10 mg/ml. Solution can be stored at -20&#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyStrip Plus Tube Strips (with attached caps)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>AB2000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microtube 3810x</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z606340-1000EA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4707516001</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler Multiwell Plates, 96 wells</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729692001</td>
			<td>White polypropylene plate (with unique identifying barcode)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal &#39;A&#39; PCR Plate and PCR Tube Sealing Film</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>msa5001</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">AAV Purity control </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td>Reconstitute in ultrapure water to 10% (v/v). CAUTION. Use under laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base ULTROL Grade</td>
			<td>Merck</td>
			<td>648311</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16500-500</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotiphorese&#174; Gel 30 (37,5:1)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3029.3</td>
			<td>Aqueous 30 % acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ratio of 37.5:1. CAUTION. Use under laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serva Blue G</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6104-58-1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus prestained marker</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610374edu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Butanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B7906</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Immunohistochemistry</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GFP</td>
			<td>Synaptic System</td>
			<td>132002</td>
			<td>1:300 dilution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21206</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td>Comments</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Vector production lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotina 380 bench-top centrifuge *</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>1701</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN 80 ultracentrifuge *</td>
			<td>Beckmann Coulter</td>
			<td>A95765</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 50.2 Ti fixed-angle titanium rotor *</td>
			<td>Beckmann Coulter</td>
			<td>337901</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Entris digital scale *</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>2202-1S</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warm water bath *</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Set at 37&#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket *</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10146-290</td>
			<td>Keep material used in the vector production lab separate from that used in standard lab areas</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetboy pro *</td>
			<td>Integra</td>
			<td>156,400</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes: Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>606180</td>
			<td>Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes: Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>607180</td>
			<td>Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes: Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>760180</td>
			<td>Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co2 incubator CB150 *</td>
			<td>Binder</td>
			<td>9040-0038</td>
			<td>Set at 37&#176;C, 5% CO2 and 95% humidity</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuaire safety cabinet NU 437-400E *</td>
			<td>Labexchange</td>
			<td>31324</td>
			<td>Clean all the surfaces with 70% ethanol and Virkon before and after use</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Conventional lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 thermal cycler *</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 Instrument II *</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015278001</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer *</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>C 5382000015</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop *</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND 2000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Protean Tetra Cell*</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658001FC</td>
			<td>For use with handmade or precast gels</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteoSilver silver stain kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PROTSIL1</td>
			<td>High sensitivity protein detection with low background</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804 R *</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>B1_022628045</td>
			<td>High speed centrifuge for medium capacity needs (up to 250 ml)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>606180</td>
			<td>5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>607180</td>
			<td>5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>760180</td>
			<td>5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>750257</td>
			<td>2 &#181;l, 20 &#181;l, 200 &#181;l</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>738257</td>
			<td>2 &#181;l, 20 &#181;l, 200 &#181;l</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>771257</td>
			<td>2 &#181;l, 20 &#181;l, 200 &#181;l</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket with lid *</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10146-290</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini diaphragm vacuum pump, VP 86 *</td>
			<td>VWR</td>
			<td>181-0065</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144801</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123600</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123615</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123601</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123602</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">* Materials marked with an asterisk are expensive vpieces of equipment and are usually central infrastructure items shared between multiple labs. These items can also be replaced by equivalents if available. Note, when a different ultracentrifuge is used, care must be taken to select the correct rotor and centrifuge tubes.</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors

Herramientas de entrega genética basadas en virus adeno-asociados (AAVs) son una opción popular para la entrega de los transgenes a sistema nervioso central (SNC), incluyendo aplicaciones de terapia génica. Vectores AAV son capaces de infectar células divisorias y no dividir y dar expresión de transgenes a largo plazo, no replicar. Importantemente, algunos serotipos, como el PHP nuevamente descrito. B, puede cruzar la sangre-barrera hematoencefálica (BBB) en modelos animales, después de la entrega sistémica. Vectores AAV se pueden producir eficientemente en el laboratorio. Sin embargo, protocolos robustos y reproducibles se requieren para obtener los vectores AAV con suficientes niveles de pureza y los valores de titulación lo suficientemente altos como para aplicaciones en vivo . Este protocolo describe una estrategia eficiente y reproducible para la producción de vectores AAV, basada en una estrategia de purificación gradiente iodixanol. El método de purificación de iodixanol es adecuado para la obtención de lotes de los vectores AAV alto-título de alta pureza, en comparación con otros métodos de purificación. Además, el protocolo es generalmente más rápido que otros métodos descritos en la actualidad. Además, una cuantitativa de polimerasa de la cadena de reacción (qPCR)-estrategia por turnos se describe para que una determinación rápida y precisa de la titulación de vectores, así como un método de tinción de plata determinar la pureza del lote de vector. Finalmente, resultados representativos de la entrega del gene para el CNS, después de la administración sistémica de AAV-PHP. B, se presentan. Estos resultados deberían ser posibles en todos los laboratorios utilizando los protocolos descritos en este artículo.

AAV9 era considerado, hasta hace poco, que el serotipo más eficaz de vector AAV en cruzar el BBB y transducción de las células del SNC, después de la administración periférica. Se logró un avance significativo en el diseño de la cápside cuando Deverman reportaron el uso de un método de selección de cápside llamado Cre evolución basada en la recombinación de orientada a AAV (crear)17. Usando este método, se identificó una nueva cápside, llamada PHP. B, que informó como capaces de transducir la mayoría de los astrocitos y las neuronas en múltiples regiones de CNS, tras inyección sistémica17. En este punto, cabe señala que aunque PHP. B proporciona resultados positivos en ratones C57/Bl6 (que fue la cepa utilizada en los experimentos de aislamiento inicial), los informes preliminares sugieren que su eficacia puede variar de una manera dependiente de la cepa. Otros experimentos, sin duda, arrojará más luz sobre este tema31.
Sin embargo, a pesar de estos problemas, PHP. B ofrece interesantes posibilidades para la manipulación de la genética no invasiva en el SNC de ratones, incluyendo experimentos de terapia génica de prueba de concepto en modelos de la enfermedad. Como tal, decidimos evaluar la eficacia de la expresión del transgen mediante PHP. B versus AAV9, que ha sido el vector 'patrón oro' para la transducción de la CNS después de la administración periférica desde 20092. Para realizar una comparación directa de ambos serotipos, en condiciones óptimas para la expresión del transgen, usamos una sc genoma configuración32. Ambos vectores llevaron el transgen de la proteína verde fluorescente (GFP) bajo el control del promotor omnipresente pollo β-actina (CBA). Mujer ratones C57/Bl6 en día postnatal 42 (aproximadamente 20 g de peso) recibieron una dosis de 1 x 1012 vg por ratón de cualquier scAAV2/PHP. B-CBA-GFP o scAAV2/9-CBA-GFP. Administración de vector fue realizado mediante inyección en la vena la cola. Los experimentos fueron aprobados por el Comité de ética de la KU Leuven.
Postinjection de tres semanas, los ratones experimentaron transcardial perfusión con PBS helado, seguido por paraformaldehído al 4% (w/v) helado (PFA). Sus cerebros fueron cosechados y experimentaron más postfixation por una incubación durante la noche en el mismo fijador, antes de transferir al 0.01% (p/v) Na-azida/PBS para el almacenamiento hasta su análisis posterior. Después, los cerebros se seccionaron con un microtomo vibratorio y immunohistochemistry fue realizado en secciones gruesas de 50 μm.
Para evaluar los niveles de expresión del transgen, las secciones fueron teñidas con anticuerpos primarios contra GFP (conejo anti-GFP), con detección mediante anticuerpos secundarios conjugados a un colorante fluorescente (anti-conejo Alexa Fluor 488) (Figura 4A, B ). Las mediciones de intensidad de fluorescencia (en unidades arbitrarias [au]) confirmaron un aumento significativo en la expresión de GFP cuando un sc genoma y el PHP. Cápside de B fueron utilizados en relación con AAV9. Se observaron aumentos en la GFP en el cerebro (2105 ± 161 vs 1441 ± 99 au; p = 0.0032), cerebelo (± 196 2601 vs 1737 au ± 135; p = 0.0032) y el tronco encefálico (3082 ± 319 vs 2485 ± 88 au; p = 0.0038) (figura 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58960/58960fig4.jpg"> Figura 4: entrega sistémica de scAAV2/PHP. B-CBA-GFP conduce a una alta expresión de GFP en el SNC. scAAV2/PHP. B-CBA-GFP o scAAV2/9-CBA-GFP (1 x 1012 vg/ratón) fue administrado a ratones C57/Bl6 de 6 semanas de edad vía la inyección de la vena de la cola. GFP fue detectada usando immunohistochemistry en postinjection de 3 semanas de secciones coronales de cerebro. (A) el cerebro y (B) se muestran el cerebelo y el tronco encefálico. Barras de escala = 1 mm. (C) se realizó la cuantificación de la intensidad de fluorescencia relativa para determinar los niveles de señal GFP conseguido cada vector (10 secciones por ratón; tres ratones por grupo del vector). Se realizó una prueba ANOVA unidireccional, seguido de un Student dos colas t-prueba; los datos se expresan como media ± desviación estándar; p < 0.01; au. unidades arbitrarias. pCapsid, utilizado para la producción del vector AAV, contiene el gen rep de serotipo 2 y el gen cap de serotipo PHP. B o AAV9, por consiguiente. Esta figura ha sido modificada desde Rincon et al.32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58960/58960fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Producción, purificación y Control de calidad de vectores de base de Virus Adeno-asociado

Aquí, describimos una estrategia eficiente y reproducible para producir, título y lotes de control de calidad de vectores de virus adeno-asociado. Permite al usuario obtener una preparación de vector con alto título (≥1 x 1013 vector genomas/mL) y una alta pureza, para uso en vitro o en vivo .

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Siguiendo este protocolo, el usuario podrá producir vectores AAV de alta pureza y rendimiento adecuados para aplicaciones in vitro o in vivo. Este protocolo se puede utilizar para producir y purificar una gama de serotipos AAV con diferencias en las configuraciones. La combinación de estos dos elementos puede ser útil para obtener el tipo de célula y la expresión específica del tejido.La producción de algunos serotipos puede dar a un menor rendimiento. Se trata de una producción en la que hay serotipos cercanos y se debe evaluar de forma individual. Demostrando estos procedimientos estará Shelly Fripont, un técnico de nuestro laboratorio.Después de cultivar las células HEK, mezcle 360 microgramos de plásmido auxiliar, 180 microgramos de plásmido que codifican el cácapsido vectorial y 180 microgramos de plásmido que contienen el transgén en 18 mililitros de cloruro de sodio milimolar de 150 milivolares para preparar la mezcla de ADN. Distribuya esta mezcla en tres tubos cónicos de 50 mililitros. En un nuevo tubo cónico, mezcle 840 microgramos de PEI y seis mililitros de cloruro de sodio de 150 milimolar para preparar la mezcla de PEI para seis platos de cultivo celular.Luego, agregue seis mililitros de la mezcla PEI, gota a gota, a uno de los tubos cónicos que contienen la mezcla de ADN. Incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos. A continuación, retire seis platos de cultivo celular de la incubadora.En una capucha de flujo laminar, aspira completamente el medio de cada plato. Enjuague los platos con cinco mililitros de DPBS precalentó para eliminar los restos del medio. Incline suavemente cada plato para asegurarse de que DPBS se distribuye uniformemente por toda la superficie.A continuación, aspira suavemente el DPBS. Agregue 12 mililitros de DMEM uno a cada plato lentamente, con una pipeta colocada en el borde del plato. Mezclar la mezcla de PEI y ADN pipeteándola hacia arriba y hacia abajo de tres a cinco veces.Añadir dos mililitros de esta mezcla a cada uno de los seis platos de cultivo celular de una manera gota a gota, asegurándose de distribuir cuidadosamente sobre toda la superficie. Repita este proceso utilizando seis platos de cultivo celular a la vez hasta llegar a 18 platos de cultivo celular. Agitar suavemente los platos de cultivo celular para distribuir la mezcla de ADN PEI.Incubar las células trans infectadas a 37 grados centígrados con un 95 por ciento de humedad y un cinco por ciento de dióxido de carbono durante cinco horas. Después de esto, añadir 12 mililitros adicionales de DMEM 10 a cada uno de los 18 platos sin quitar el medio preexistente. Continuar incubando las células trans infectadas en las mismas condiciones.A las 72 horas después de la transfección, utilice un rascador celular para separar cuidadosamente las células de cada plato de cultivo. Recoger el medio y las células de dos platos de cultivo en un tubo cónico de 15 mililitros, mantenido en hielo. Centrifugar los tubos a 420 veces G y a cuatro grados Celsius durante 10 minutos con la aceleración y desaceleración de la centrífuga ajustada al máximo.Deseche cuidadosamente el sobrenadante de cada tubo vertiéndolo suavemente en un recipiente de eliminación de residuos. Luego, coloque los tubos que contienen los pellets celulares sobre el hielo. Suspendemos cada pellet en dos mililitros de tampón de lelisis y mezclamos pipeteando hacia arriba y hacia abajo de cinco a 10 veces.Tire del AAV de tres tubos, juntos. Para comenzar, congele las células re-suspendidas colocándolas en un cubo que contenga hielo seco mezclado con etanol. Luego descongela las células colocándolas inmediatamente en un baño de agua a 37 grados centígrados.Repita este ciclo de congelación y descongelación tres veces para anule las células y libere las partículas AAV. Después del tercer paso de descongelación, centrifugar a 1167 veces G y a cuatro grados centígrados durante 15 minutos. Transfiera cuidadosamente los sobrenadantes para limpiar los tubos cónicos de 50 mililitros.Añadir nucleasa a cada tubo a una concentración final de 50 unidades por mililitro de sobrenadante. Incubar a 37 grados centígrados durante 30 minutos, mientras se arremolinan los tubos cada 10 minutos para asegurarse de que la nucleasa se mezcle a fondo con el sobrenadante. Centrifugar a 13490 veces G y a cuatro grados Celsius durante 20 minutos para aclarar el sobrenadante.Después de esto, retire el émbolo de una jeringa de 10 mililitros, conecte un filtro de 0,45 micrómetros a la jeringa y colóquelo encima de un tubo cónico limpio de 50 mililitros. Llene cuidadosamente la jeringa con el sobrenadante clarificado. Utilice el émbolo para forzar el izado a través del filtro.A continuación, prepare cada una de las fracciones de yodoxanol en cuatro tubos cónicos separados de 50 mililitros, como se describe en la tabla uno del protocolo de texto. Pipeteo ocho mililitros de 15 por ciento de yodoxanol en cada uno de los tres tubos de ultracentrífuga. Pipetear 5,5 mililitros de 25 por ciento de yodoxanol en un tubo cónico limpio de 50 mililitros.Usando una pipeta Pasteur no graduada, capa cuidadosamente 5.5 mililitros de 25 por ciento de solución de yodoxanol por debajo de la solución de iodixanol al 15 por ciento. Agregue las soluciones del 40 por ciento y el 60 por ciento como se describe en el protocolo de texto. Las fracciones de iodixanol no deben mezclarse en capas.Usando una pipeta Pasteur, capa el lisato crudo en la parte superior del gradiente de iodixanol del 15 por ciento, gota a gota, para evitar perturbar la interfaz entre el lisato crudo y la solución de iodixanol. Llene cada tubo de ultracentrifugación con tampón de lysis hasta que el menisco alcance la base del cuello del tubo, para asegurarse de que el tubo no se derrumbe bajo las fuerzas muy altas generadas durante la ultracentrifugación. Cierre los tubos con las tapas adecuadas.Con una báscula digital, asegúrate de que los tres tubos de ultracentrifugación tengan el mismo peso. Ajustar el peso según sea necesario, añadiendo más tampón de lelisis en la parte superior del alisla bruta. Utilice un rotor de titanio de ángulo fijo para centrifugar los tubos a 301580 veces G y a 12 grados Celsius durante una hora y 40 minutos utilizando la máxima aceleración y desaceleración.A continuación, coloque una aguja en una jeringa de cinco mililitros. Retire el espaciador de los tubos del rotor y recupere los tubos después de la centrifugación. Aspirar sólo la fracción de yodoxanol del 40 por ciento que contiene las partículas vectoriales.O procesa la muestra o guárdala a cuatro grados centígrados. Aquí, se demuestra un protocolo que se puede utilizar para producir vectores AAV con una variedad de capsidos, configuraciones de genoma, tipos de promotores y cargas transgén. En este ejemplo, producimos y purificamos dos vectores AAV diferentes que expresan la proteína fluorescente verde a partir de un genoma autoconsuado.Los dos vectores se distinguen por diferentes capsids:PHPB y AAV9. Fueron entregados, a través de la inyección de la vena de la cola, en adultos C57 negros seis ratones. Para evaluar los niveles de expresión transgénica tres semanas después de la inyección, las secciones se tiñen con anticuerpos primarios contra la GFP con la detección mediante anticuerpos secundarios conjugados con un tinte fluorescente.Las mediciones de intensidad de fluorescencia muestran un aumento significativo en la expresión GFP cuando se utiliza el vector PHPB en relación con AAV9. Se observaron aumentos de la GFP en el cerebro, el cerebelo y en el tronco cerebral. La recopilación precisa del vector que contiene la fracción es crucial para este protocolo.En caso de que esto no se haga correctamente, el rendimiento del vector, así como la pureza del vector se ven afectados negativamente. Al ser capaz de producir vectores AAV, pequeños laboratorios estarán en condiciones de aprovechar numerosas posibilidades experimentales para entregar genes en el sistema nervioso central. Este protocolo requiere el uso de una ultracentrífuga y es importante recibir un entrenamiento adecuado antes de manejar esto para evitar accidentes.Además, los vectores AAV a menudo se clasifican como peligros biológicos y, por lo tanto, debe consultar las regulaciones locales antes de manipularlos y gestionarlos.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Inyección intracraneal de adeno-asociado vectores virales

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Investigación

Neurociencias

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

La producción de vectores lentivirales de células transductoras del Sistema Nervioso Central

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

Adenovirus Subagonal Asociado 9 (AAV9) Vector Entrega en Ratones Adultos

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction

Métodos y consejos para la administración intravenosa del Virus Adeno-asociado a las ratas y la evaluación de la transducción de señales del sistema nervioso Central

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Visualización y en proyección de imagen del Oligodendrocyte organelos en rebanadas de cerebro Organotypic mediante Virus Adeno-asociado y Microscopía Confocal

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

Un modelo de Ovo para probar compuestos de insulina-mimético

Elevated blood glucose levels in type 2 diabetes mellitus (T2DM), a complex and multifactorial metabolic disease, are caused by insulin resistance and ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Expresión de transgenes de mediada por Virus adeno-asociado en neuronas genéticamente definidas de la médula espinal

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

Directa de la inyección intratecal de virus Adeno-asociado recombinantes en ratones adultos

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images

Convección Mejorada Entrega de Vector Viral Asociado a Adeno Optogenético a la Corteza de Rhesus Macaque Bajo Guía de Imágenes de RMN en Línea

In non-human primate (NHP) optogenetics, infecting large cortical areas with viral vectors is often a difficult and time-consuming task. Here, we ...

WheelCon: A Wheel Control-Based Gaming Platform for Studying Human Sensorimotor Control

WheelCon: Una plataforma de juego basada en el control de ruedas para estudiar el control del sensor humano

Feedback control theory has been extensively implemented to theoretically model human sensorimotor control. However, experimental platforms capable of ...