Name: production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors
Uploaded: 2019-01-29T14:00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors at JoVE.com

M.R. stöds av en Fonds voor yrkesverksamma Onderzoek Vlaanderen (CVE) postdoktorsstipendium (133722/1204517N) och erkänner ett kontinuerligt stöd för Fundación hjärt-de Colombia administrativa Department of Science, Teknik och Innovation (Grant CT-FP44842-307-2016, Projektkod 656671250485). M.M. stöds av ett CVE doktorand stipendium (1S48018N). M.G.H. stöddes av en VIB institutionella grant och externt stöd från Thierry Latran Foundation (SOD-VIP), Stiftelsen för Alzheimerforskningen (SAO-FRA) (P #14006), FWO (Grant 1513616N) och den Europeiska forskningsrådet (ERC) (Starting Grant 281961 - AstroFunc; Bevis på konceptet Grant 713755 - AD-VIP). Författarna erkänner Jeason Haughton för hans hjälp med musen djurhållning, Stephanie Castaldo för hennes hjälp med att utföra svans ven injektionerna och Caroline Eykens för att ge bilder av transfekterade HEK293T celler. M.G.H. erkänner Michael Dunlop, Peter Hickman och Dean Harrison.

<ol>
	<li>Daya, S., Berns, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Therapy+Using+Adeno-Associated+Virus+Vectors.">Gene Therapy Using Adeno-Associated Virus Vectors.</a> Clinical Microbiology Reviews. 21 (4), 583-593 (2008).</li><li>Duque, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+Administration+of+Self-complementary+AAV9+Enables+Transgene+Delivery+to+Adult+Motor+Neurons.">Intravenous Administration of Self-complementary AAV9 Enables Transgene Delivery to Adult Motor Neurons.</a> Molecular Therapy. 17 (7), 1187-1196 (2009).</li><li>Bourdenx, M., Dutheil, N., Bezard, E., Dehay, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+gene+delivery+to+the+central+nervous+system+using+Adeno-associated+virus.">Systemic gene delivery to the central nervous system using Adeno-associated virus.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, (2014).</li><li>Kantor, B., McCown, T., Leone, P., Gray, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Applications+Involving+CNS+Gene+Transfer.">Clinical Applications Involving CNS Gene Transfer.</a> Advances in Genetics. 87, 71-124 (2014).</li><li>Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus:+The+First+Effective+In+Vivo+Gene+Delivery+Vector.">Adenovirus: The First Effective In Vivo Gene Delivery Vector.</a> Human Gene Therapy. 25 (1), 3-11 (2014).</li><li>Weinberg, M. S., Samulski, R. J., McCown, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+(AAV)+gene+therapy+for+neurological+disease.">Adeno-associated virus (AAV) gene therapy for neurological disease.</a> Neuropharmacology. 69, 82-88 (2013).</li><li>Henckaerts, E., Linden, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus:+a+key+to+the+human+genome?.">Adeno-associated virus: a key to the human genome?.</a> Future Virology. 5 (5), 555-574 (2010).</li><li>Howarth, J. L., Lee, Y. B., Uney, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+viral+vectors+as+gene+transfer+tools+(Cell+Biology+and+Toxicology+Special+Issue:+ETCS-UK+1+day+meeting+on+genetic+manipulation+of+cells).">Using viral vectors as gene transfer tools (Cell Biology and Toxicology Special Issue: ETCS-UK 1 day meeting on genetic manipulation of cells).</a> Cell Biology and Toxicology. 26 (1), 1-20 (2010).</li><li>Nathwani, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-Associated+Virus+Vector-Mediated+Gene+Transfer+in+Hemophilia+B.">Adenovirus-Associated Virus Vector-Mediated Gene Transfer in Hemophilia B.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (25), 2357-2365 (2011).</li><li>Carter, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+and+the+development+of+adeno-associated+virus+vectors:+a+historical+perspective.">Adeno-associated virus and the development of adeno-associated virus vectors: a historical perspective.</a> Molecular Therapy. 10 (6), 981-989 (2004).</li><li>Schambach, A., Zychlinski, D., Ehrnstroem, B., Baum, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosafety+Features+of+Lentiviral+Vectors.">Biosafety Features of Lentiviral Vectors.</a> Human Gene Therapy. 24 (2), 132-142 (2013).</li><li>Van Vliet, K. M., Blouin, V., Brument, N., Agbandje-McKenna, M., Snyder, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+the+Adeno-Associated+Virus+Capsid+in+Gene+Transfer.">The Role of the Adeno-Associated Virus Capsid in Gene Transfer.</a> Methods in Molecular Biology. 437, 51-91 (2008).</li><li>Rincon, M. Y., VandenDriessche, T., Chuah, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+cardiovascular+disease:+advances+in+vector+development,+targeting,+and+delivery+for+clinical+translation.">Gene therapy for cardiovascular disease: advances in vector development, targeting, and delivery for clinical translation.</a> Cardiovascular Research. 108 (1), 4-20 (2015).</li><li>Samulski, R. J., Muzyczka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-Mediated+Gene+Therapy+for+Research+and+Therapeutic+Purposes.">AAV-Mediated Gene Therapy for Research and Therapeutic Purposes.</a> Annual Review of Virology. 1 (1), 427-451 (2014).</li><li>McCarty, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-complementary+AAV+Vectors;+Advances+and+Applications.">Self-complementary AAV Vectors; Advances and Applications.</a> Molecular Therapy. 16 (10), 1648-1656 (2008).</li><li>Choi, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+AAV+expression+cassettes+to+improve+packaging+capacity+and+transgene+expression+in+neurons.">Optimization of AAV expression cassettes to improve packaging capacity and transgene expression in neurons.</a> Molecular Brain. 7, 17 (2014).</li><li>Deverman, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre-dependent+selection+yields+AAV+variants+for+widespread+gene+transfer+to+the+adult+brain.">Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 204-209 (2016).</li><li>Jackson, K. L., Dayton, R. D., Deverman, B. E., Klein, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Better+Targeting,+Better+Efficiency+for+Wide-Scale+Neuronal+Transduction+with+the+Synapsin+Promoter+and+AAV-PHP.B.">Better Targeting, Better Efficiency for Wide-Scale Neuronal Transduction with the Synapsin Promoter and AAV-PHP.B.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, (2016).</li><li>Lock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+Manufacturing+of+Recombinant+Adeno-Associated+Viral+Vectors+at+Scale.">Versatile Manufacturing of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors at Scale.</a> Human Gene Therapy. 21 (10), 1259-1271 (2010).</li><li>Strobel, B., Miller, F. D., Rist, W., LamLa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Analysis+of+Cesium+Chloride-+and+Iodixanol-Based+Purification+of+Recombinant+Adeno-Associated+Viral+Vectors+for+Preclinical+Applications.">Comparative Analysis of Cesium Chloride- and Iodixanol-Based Purification of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors for Preclinical Applications.</a> Human Gene Therapy Methods. 26 (4), 147-157 (2015).</li><li>Jungmann, A., Leuchs, B., Katus, H. A., Rommelaere, J., M&#252;ller, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+efficient+generation+and+characterization+of+adeno-associated+viral+(AAV)+vectors.">Protocol for efficient generation and characterization of adeno-associated viral (AAV) vectors.</a> Human Gene Therapy Methods. , (2017).</li><li>Tolmachov, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+Plasmid+Vectors.">Designing Plasmid Vectors.</a> Methods in Molecular Biology. 542, 117-129 (2009).</li><li>. QIAGEN Plasmid Purification Handbook Available from: <a target="_blank" href="https://www.qiagen.com/us/resources/download.aspx?id=46205595-0440-459e-9d93-50eb02e5707e&amp;lang=en">https://www.qiagen.com/us/resources/download.aspx?id=46205595-0440-459e-9d93-50eb02e5707e&amp;lang=en</a> (2018)</li><li>Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+Determination+of+Single-Stranded+and+Self-Complementary+Adeno-Associated+Viral+Vector+Genome+Titers+by+Droplet+Digital+PCR.">Absolute Determination of Single-Stranded and Self-Complementary Adeno-Associated Viral Vector Genome Titers by Droplet Digital PCR.</a> Human Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).</li><li>. ProteoSilver Silver Stain Kit (PROTSIL1) - Bulletin, ProteoSilver Available from: <a target="_blank" href="https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/protsil1bul.pdf">https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/protsil1bul.pdf</a> (2018)</li><li>Machholz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+Restraint+and+Common+Compound+Administration+Routes+in+Mice+and+Rats.">Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), e2771 (2012).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents.">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Puntel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+rat+brain+using+adenoviral+vectors.">Gene transfer into rat brain using adenoviral vectors.</a> Current Protocols in Neuroscience. 50 (1), (2010).</li><li>Bachman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+on+Freely+Floating+Fixed+Tissue+Sections.">Immunohistochemistry on Freely Floating Fixed Tissue Sections.</a> Methods in Enzymology. 533, 207-215 (2013).</li><li>Hordeaux, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Neurotropic+Properties+of+AAV-PHP.B+Are+Limited+to+C57BL/6J+Mice.">The Neurotropic Properties of AAV-PHP.B Are Limited to C57BL/6J Mice.</a> Molecular Therapy. 26 (3), 664-669 (2018).</li><li>Rincon, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+transduction+of+astrocytes+and+neurons+in+the+mouse+central+nervous+system+after+systemic+delivery+of+a+self-complementary+AAV-PHP.B+vector.">Widespread transduction of astrocytes and neurons in the mouse central nervous system after systemic delivery of a self-complementary AAV-PHP.B vector.</a> Gene Therapy. 25 (2), 83-92 (2018).</li><li>Crosson, S. M., Dib, P., Smith, J. K., Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helper-free+Production+of+Laboratory+Grade+AAV+and+Purification+by+Iodixanol+Density+Gradient+Centrifugation.">Helper-free Production of Laboratory Grade AAV and Purification by Iodixanol Density Gradient Centrifugation.</a> Molecular Therapy. Methods &amp; Clinical Development. 10, 1-7 (2018).</li><li>Merdan, T., Kunath, K., Fischer, D., Kopecek, J., Kissel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+processing+of+poly(ethylene+imine)/ribozyme+complexes+can+be+observed+in+living+cells+by+using+confocal+laser+scanning+microscopy+and+inhibitor+experiments.">Intracellular processing of poly(ethylene imine)/ribozyme complexes can be observed in living cells by using confocal laser scanning microscopy and inhibitor experiments.</a> Pharmaceutical Research. 19 (2), 140-146 (2002).</li><li>Meissner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+gene+expression:+recombinant+protein+production+with+suspension-adapted+HEK293-EBNA+cells.">Transient gene expression: recombinant protein production with suspension-adapted HEK293-EBNA cells.</a> Biotechnology and Bioengineering. 75 (2), 197-203 (2001).</li><li>Reed, S. E., Staley, E. M., Mayginnes, J. P., Pintel, D. J., Tullis, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+mammalian+cells+using+linear+polyethylenimine+is+a+simple+and+effective+means+of+producing+recombinant+adeno-associated+virus+vectors.">Transfection of mammalian cells using linear polyethylenimine is a simple and effective means of producing recombinant adeno-associated virus vectors.</a> Journal of Virological Methods. 138 (1-2), 85-98 (2006).</li><li>Zolotukhin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+adeno-associated+virus+purification+using+novel+methods+improves+infectious+titer+and+yield.">Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield.</a> Gene Therapy. 6 (6), 973-985 (1999).</li><li>Kaludov, N., Handelman, B., Chiorini, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+Purification+of+Adeno-Associated+Virus+Type+2,+4,+or+5+Using+Ion-Exchange+Chromatography.">Scalable Purification of Adeno-Associated Virus Type 2, 4, or 5 Using Ion-Exchange Chromatography.</a> Human Gene Therapy. 13 (10), 1235-1243 (2002).</li><li>Nass, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+Method+for+the+Purification+of+Recombinant+AAV+Vectors+of+Differing+Serotypes.">Universal Method for the Purification of Recombinant AAV Vectors of Differing Serotypes.</a> Molecular Therapy. Methods &amp; Clinical Development. 9, 33-46 (2017).</li><li>Qu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+adeno-associated+virus+type+2+empty+particles+from+genome+containing+vectors+by+anion-exchange+column+chromatography.">Separation of adeno-associated virus type 2 empty particles from genome containing vectors by anion-exchange column chromatography.</a> Journal of Virological Methods. 140 (1-2), 183-192 (2007).</li><li>Holehonnur, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+viral+serotypes+produce+differing+titers+and+differentially+transduce+neurons+within+the+rat+basal+and+lateral+amygdala.">Adeno-associated viral serotypes produce differing titers and differentially transduce neurons within the rat basal and lateral amygdala.</a> BMC Neuroscience. 15, 28 (2014).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+spinal+cord+transduction+by+intrathecal+injection+of+rAAV+delivers+efficacious+RNAi+therapy+for+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Widespread spinal cord transduction by intrathecal injection of rAAV delivers efficacious RNAi therapy for amyotrophic lateral sclerosis.</a> Human Molecular Genetics. 23 (3), 668-681 (2014).</li></ol>

Författarna har något att avslöja.

Produktionen av rekombinant AAV vektorer beskrivs här använder material och utrustning som är gemensamma för de flesta molekylär biologi labs och cell kultur faciliteter. Det tillåter användaren att få ren, preklinisk grade AAV vektorer som kan användas för att rikta flera celler och vävnad typer inom en rad olika in vitro- och in-vivo -program. En av de största fördelarna med detta protokoll, jämfört med andra (dvs CsCl-baserade rening), är den korta arbetstiden som behövs. Ready-to-use AAV vektorer kan erhållas i högst 6 arbetsdagar efter den inledande transfection av HEK293T celler.
Flera faktorer kan negativt påverka den slutliga avkastningen eller kvaliteten på AAV vektorn. Stackars transfection effektivitet är en av de främsta orsakerna till en låg viral avkastning33. En stor rekommendation är att använda HEK293T celler som inte har varit anpassade mer än 20 gånger och har inte en cell sammanflödet större än 90% vid tidpunkten för transfection21. Transfection vald metod har dessutom stor inverkan på resultaten. Detta protokoll baseras på användning av PEI. PEI är en katjoniska polymer med förmåga att leverera exogent DNA till cellkärnan genom generering av komplex av polymer och nukleinsyra, känd som polyplexes, som tas upp av cellen och trafikerade via endosomes34. PEI-baserade transfection är lätt och snabbt att utföra, i motsats till andra allmänt använda metoder, såsom samfällning av DNA med kalciumfosfat35. PEI-baserade transfection är också mycket billigare jämfört med andra nyligen införda metoder, såsom användning av katjoniska lipider och magnet-medierad transfection36.
Rening strategin spelar en nyckelroll i protokollet. Jämfört med andra metoder, tenderar iodixanol-baserade reningar att innehålla en högre andel av Tom viruspartiklar (20%)20. Detta kompenseras, till en grad, av det faktum att iodixanol-baserade rening rutinmässigt resulterar i AAV vektor preparat med partikel-till-smittsamhet förhållande av mindre än 100. Detta innebär en betydande förbättring i jämförelse med konventionella CsCl-baserade förfaranden, som är betydande förlust av partikel smittsamhet rapporterade37. Ett annat vanligt alternativ metod att rena AAV vektorer är kromatografi-baserade rening. Men denna metod har den stora nackdelen att det krävs en särskild kolumn för varje vektor kapsid används: till exempel AAV2 är klassiskt isolerade med heparin kolumner, denna metod fungerar inte med AAV4 och AAV5, som inte äger heparin-bindande platser på deras förhoppningsvis38. Med tanke på att kromatografi rening är också dyra, är iodixanol-baserade rening generellt mer lämplig för laboratorier som vill producera hög kvalitet partier av AAV vektorer på en liten skala33,39, 40. men för att maximera den slutliga avkastning och renhet av vektor, extrem försiktighet behövs när du gör iodixanol Övertoningarna. De olika iodixanol fraktionerna ska överföras till ultracentrifugering röret med hjälp av en steril Pasteur-pipett vars spets vidrör väggen i röret: iodixanol bör utvisas från pipetten långsamt och kontinuerligt. Som vektor partiklarna ansamlas i 40% iodixanol lagret, måste vidtas för att säkerställa att de gradient gränssnitt inte blanda20. Slutligen bör det bråk som innehåller vektorn återvinnas genom införandet av en rostfritt stål trubbig nål med en mätare som inte är större än 20 G. För att maximera vektor återhämtning, ska tydlig bråket hämtas i sin helhet. Under detta steg är timing kritisk. För att undvika att äventyra renheten av preparatet, är det viktigt att stoppa samlingen innan andra (kontaminerande) faser av övertoningen samlas.
Skillnader i erhållna vektor titern kan också hänföras till vektorn inneboende förmåga att producera paketerade partiklar. En jämförelse mellan olika AAV serotyper visade att vissa AAV vektorer är svårare att producera en högre titer än andra (t.ex. AAV2)41. Nederbörd vektorns under avsaltning steg, kan vara en möjlig orsak till en lägre titer och förebyggas enkelt genom att undvika överkoncentration33. Dessutom är det också möjligt att av iodixanol gradient-baserade reningens effektivitet skiljer sig något mellan serotyper och, därför, avvikelser i titern erhålls med olika serotyper kan observeras41.
Slutligen måste det påpekas att även om qPCR är en mycket noggrann metod för DNA kvantifiering vissa inneboende variabilitet i tekniken kan observeras. Noggrannhet i titreringen beror primärt på exakt pipettering och ordentlig vortexa av alla lösningar. För att garantera den mest exakta titer läsning, qPCR självständigt kan upprepas, och erhållna medelvärdet. Valet av primers som presenteras i detta protokoll är baserat på sekvens av CBA arrangören ligger i pTransgene plasmiden används i vårt laboratorium. CBA arrangören är en stark syntetisk arrangören som används mycket i fältet vektor att driva uttryck över flera celltyper. Den innehåller flera element, inklusive cytomegalovirus (CMV) tidig enhancer elementet; arrangören, första exon och den första intron av CBA genen; och den skarv acceptorn av den kanin β-globingenen. Primers kan dock utformas för praktiskt taget alla element som ligger inom uttryck kassetten (inklusive promotorn, transgenens och reglerande element). Jämförelse av titer över partier är också möjligt, att tillhandahålla primers används mot regioner vanligt att vektorerna i fråga.
Avslutningsvis kan detta protokoll användas för att producera AAV vektorer med en mängd förhoppningsvis, genomet konfigurationer, promotorn typer och transgenens laster. Detta gör att användare att enkelt anpassa sin vektorer till bästa experimentella behov slutliga egenskaper. I exemplet presenteras i de representativa resultat, användning av PHP. B kapsid, som effektivt korsar BBB, gav högeffektiva genuttryck i CNS, följande svans ven injektion32. Systemisk administrering av CNS penetrant vektorer har avsevärda fördelar när det gäller eventuella biverkningar2,17,32. Ett möjligt alternativ till perifera injektion, samtidigt som man undviker förbehåll av invasiva tekniker, är intratekal leverans, som består av leverans av AAV vektorn i ryggmärgsvätskan. Denna leverans rutt är visat sig vara effektiva, visar utbredd uttryck för transgenens hela CNS, mindre off-target effekter i perifera organ, och låga nivåer av immunsvar42. Intratekala injektioner är dock mycket mer utmanande, eftersom de kräver högre tekniska färdigheter än svans ven injektion.
Kapsid vidareutveckling att förfina denna teknik kommer att drivas av möjligheterna för AAV vektor användning i gen terapi program. Sådana tillvägagångssätt erbjuder attraktiva möjligheter att behandla för närvarande obotliga CNS-störningar, såsom amyotrofisk lateral skleros, Charcot-Marie-Tooth sjukdom, Parkinsons sjukdom och Alzheimers sjukdom18.

Under de senaste 30 åren, har vildtyp AAVs konstruerats för att skapa rekombinant AAV vektorer, som har visat sig vara mycket användbara verktyg för genöverföring till CNS1,2,3,4, 5,6 och gene therapy närmar sig till sjukdom (inklusive FDA - och EMA-godkänd terapier)4,7. Lämpligheten för användning i CNS härrör till stor del från deras förmåga att infektera icke-dividera, efter mitotiska celler, normalt återfinns i CNS8. AAV-baserade vektorer har emellertid också fördelen att ett långvarigt uttryck av någon viss terapeutisk transgenens4,9 medan framkalla en mildare immunsvar jämfört med andra virala vektorer7, 8,10,11,12.
De viktigaste delarna i varje AAV vektor är genomet och kapsid. Vildtyp AAVs är enkelsträngat (ss) DNA virus med en arvsmassa cirka 5 kilobases (kb)13. För produktion av rekombinant AAV vektorer, rep och cap generna (nödvändigt för genomet replikering och montering av viral kapsid) är bort från genomet hos den vildtyp AAV och tillhandahålls i trans, vilket lämnar utrymme för en uttryck kassett som innehåller transgenens14,15. Den inverterade terminal upprepa sekvenser (ITRs) av det ursprungliga virala genomet är de enda balanserade element i en AAV vektor, eftersom dessa är viktiga för replikering och förpackning3,10,14. AAV vektorer kan vara konstruerad för att förbättra transgenens uttryck; en mutation i en av ITRs leder till bildandet av en hårnål-loop som effektivt gör att genereringen av en kompletterande DNA strand3,7,15. Den största fördelen med denna konfiguration kallas en self-kompletterande (sc) genomet, är att det kringgår behovet av andra-strand syntes typiska i konventionella livscykeln för AAVs, avsevärt öka hastighet och nivåer av transgenens uttryck 1. dock använda en scAAV arvsmassa minskar lastkapacitet av vektorn för cirka 2,4 kb. Detta inkluderar transgenens sekvenser, liksom eventuella reglerande sekvenser såsom initiativtagare eller mikroRNA-bindande platser, för att begränsa uttrycket till viss cell typer16.
AAV kapsid avgör vektor-host cell interaktionen och ger en viss cell typ eller vävnad tropism för en AAV serotyp, som också kan utnyttjas för att begränsa transgenens uttryck till specifika platser. Flera AAV serotyper förekommer i naturen, medan andra har producerats i laboratorier genom rekombinant strategier (dvs, PHP. (B). Dessutom några förhoppningsvis också skänka andra användbara egenskaper, såsom möjlighet att korsa BBB, vilket resulterar i leveransen av transgener i hela CNS efter systemisk administrering. Detta har visats för AAV9 samt för den nyligen beskriven PHP. B kapsid17. Följaktligen bör har dessa serotyper visat sig vara särskilt relevanta för nya gen terapi metoder för neurodegenerativa sjukdomar1,17,18.
Syftet med detta protokoll är att beskriva en kostnadseffektiv metod för småskalig produktion av AAV vektorer med hög titer och renhet. Även om de resultat som presenteras här använder PHP. B kapsid och en scAAV uttryck kassett, protokollet är lämplig för produktion av flera AAV vektor serotyper och genomet konfigurationer, vilket ger maximal experimentella flexibilitet. Den vektor avkastning och slutliga renhet kan emellertid variera beroende på den valda serotypen.
Själva protokollet är en variant av den klassiska tri-transfection metoden för virala vektorn produktion och omfattar användning av en iodixanol lutning för vektor ren-upp, som i jämförelse med klassiskt användningen av cesium klorid (CsCl) lutningar, varit rapporterade för att producera AAV vektorer på ett mer tidseffektivt sätt19,20,21högre renhet.
Transfection, rening och koncentration stegen är avsedda att utföras enligt god laboratoriesed (GLP) i en vävnadskultur laboratorium varmt för virala vektorn arbete. Varje uppgift måste utföras i enlighet med den relevanta lokala och nationella lagstiftningen avseende viral vektor produktion och använda. Arbete måste utföras under en LAF och sterila förhållanden. Inuti anläggningen i vektor rekommenderas det att bära en lab-förkläde, utöver den regelbundna vävnadsodling labbrock. Dessutom bör en dubbel par handskar samt plast galoscher, bäras hela tiden.
Innan produktionsstart vektor, se till att all nödvändig utrustning och plasmider är tillgängliga. (1) pCapsid plasmiden innehåller den rep -genen som kodar fyra icke-strukturella proteiner nödvändiga för replikering, nämligen Rep78, Rep68, Rep52 och Rep40, och den gemensamma jordbrukspolitik -genen som kodar tre strukturella kapsid proteiner, nämligen VP1, VP2 och VP3. (2) pHelper plasmiden innehåller generna E4, E2Aoch VA från adenovirus, vilket underlättar AAV produktionen i HEK293T celler. (3) pTransgene plasmiden innehåller transgenens uttryck kassett, flankerad av två ITRs. Dessa plasmider kan vara syntetiskt de novo i laboratoriet använder sekvenser tillgängliga online22. För plasmider gjort de novo, är särskilt de som innehåller roman transgener, sekvensering skyldig att se till att transgenens och ITRs är rätt. Alternativt, premade plasmider kan förvärvas direkt genom online plasmid förråd. Vid behov, plasmider kan amplifieras och renas med hjälp av standard kit, enligt tillverkarens instruktioner23.
Vector titer och renhet kan påverka transduktion förmåga vektorn. Tilläggsprotokollen levereras för att utvärdera kvaliteten på de producerade vektorn. De slutliga vektorerna kommer att vara användbart för studier av funktionen CNS cell i både in vitro- och in-vivo applikationer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Plasmid production</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTransgene plasmid</td>
			<td>De novo design or obtained from a plasmid repository</td>
			<td>N/A</td>
			<td>See step 1 of main protocol for further details</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCapsid</td>
			<td>De novo design or obtained from a plasmid repository</td>
			<td>N/A</td>
			<td>See step 1 of main protocol for further details</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHelper</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>240071</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Plus maxi kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12963</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV Helper-Free System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>240071</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Cell culture and transfection </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, no glutamine</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11960-044</td>
			<td>Supplement DMEM with FBS (1% or 10% v/v) and GlutaMAX 200 mM (1% v/v) then filter sterilize the medium using a 0.22 mm filter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10500-064</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX supplement</td>
			<td rowspan="2">GIBCO</td>
			<td rowspan="2">35050038</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(200 mM)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filter system</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430769</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (DPBS) with no calcium and no magnesium</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cells</td>
			<td>American Tissue Culture Collection</td>
			<td>CRL3216</td>
			<td>Upon receipt, thaw the cells and culture as described in the protocol. After a minimal number of passages, freeze a subfraction for future in aliquots.&#160;Always use cells below passage number 20. Once cultured cells have been passaged more than 20 times, restart a culture from the stored aliquots</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes</td>
			<td>Greiner Cellstar</td>
			<td>639160</td>
			<td>15 cm diameter culture dishes</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-904</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>23966-2</td>
			<td>PEI in powder form is dissolved at 1 &#181;g/&#181;L in deionized water (ddwater) at pH=2 (use HCl). Prepare in a beaker and stir for 2-3 h. When dissolved, bring the pH back to 7 with NaOH. Filter sterilize and store the resuspended stock solution in 1 ml aliquots at -20 &#176;C. PEI aliquots can freeze/thawed multiple times.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virkon solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9821357</td>
			<td>Disinfect any material that has been in contact with assembled viral particles with Virkon solution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutexi long-sleeve aprons</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11735423</td>
			<td>Wear an apron over the top of a regular lab coat</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand maximum protection disposable overshoes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15401952</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">AAV Purification and desalting</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optiprep density gradient medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Optiprep is a 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile). CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z627992</td>
			<td>Sterilize before use</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiSeal Polypropylene tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>361625</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase (250 U/&#181;L)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td>Supplied as a ready-to-use solution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodisc syringe filter</td>
			<td>Pall corporation</td>
			<td>4614</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnifix syringe (5mL)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4617053V</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt syringe needle</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z261378</td>
			<td>Stainless steel 316 syringe needle, pipetting blunt 90&#176; tip gauge 16, L 4 in. Referred to in the text as a blunt-end needle</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua Ecotainer</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>0082479E</td>
			<td>Sterile endotoxin-free water. Referred to as &#39;Ultrapure water&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon ultra-15 centrifugal filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td>These filters concentrate the final product by collecting the viral particles in consecutive centrifugation steps</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F68 (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>24040032</td>
			<td>Non-ionic surfactant. Dilute in sterile PBS to use at 0,01% (v/v)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps (2 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-374</td>
			<td>Use skirted tubes for easy handling</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">AAV Titration </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Restriction enzyme: StuI (10 U/&#181;L)</td>
			<td rowspan="2">Promega</td>
			<td rowspan="2">R6421</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I (1 U/&#181;L)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>EN0521</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3115852001</td>
			<td>Reconstitute in ultrapure water and use at a final concentration of 10 mg/ml. Solution can be stored at -20&#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyStrip Plus Tube Strips (with attached caps)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>AB2000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microtube 3810x</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z606340-1000EA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4707516001</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler Multiwell Plates, 96 wells</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729692001</td>
			<td>White polypropylene plate (with unique identifying barcode)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal &#39;A&#39; PCR Plate and PCR Tube Sealing Film</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>msa5001</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">AAV Purity control </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td>Reconstitute in ultrapure water to 10% (v/v). CAUTION. Use under laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base ULTROL Grade</td>
			<td>Merck</td>
			<td>648311</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16500-500</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotiphorese&#174; Gel 30 (37,5:1)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3029.3</td>
			<td>Aqueous 30 % acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ratio of 37.5:1. CAUTION. Use under laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serva Blue G</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6104-58-1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus prestained marker</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610374edu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Butanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B7906</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Immunohistochemistry</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GFP</td>
			<td>Synaptic System</td>
			<td>132002</td>
			<td>1:300 dilution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21206</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td>Comments</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Vector production lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotina 380 bench-top centrifuge *</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>1701</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN 80 ultracentrifuge *</td>
			<td>Beckmann Coulter</td>
			<td>A95765</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 50.2 Ti fixed-angle titanium rotor *</td>
			<td>Beckmann Coulter</td>
			<td>337901</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Entris digital scale *</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>2202-1S</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warm water bath *</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Set at 37&#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket *</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10146-290</td>
			<td>Keep material used in the vector production lab separate from that used in standard lab areas</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetboy pro *</td>
			<td>Integra</td>
			<td>156,400</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes: Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>606180</td>
			<td>Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes: Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>607180</td>
			<td>Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes: Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>760180</td>
			<td>Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co2 incubator CB150 *</td>
			<td>Binder</td>
			<td>9040-0038</td>
			<td>Set at 37&#176;C, 5% CO2 and 95% humidity</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuaire safety cabinet NU 437-400E *</td>
			<td>Labexchange</td>
			<td>31324</td>
			<td>Clean all the surfaces with 70% ethanol and Virkon before and after use</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Conventional lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 thermal cycler *</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 Instrument II *</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015278001</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer *</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>C 5382000015</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop *</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND 2000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Protean Tetra Cell*</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658001FC</td>
			<td>For use with handmade or precast gels</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteoSilver silver stain kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PROTSIL1</td>
			<td>High sensitivity protein detection with low background</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804 R *</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>B1_022628045</td>
			<td>High speed centrifuge for medium capacity needs (up to 250 ml)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>606180</td>
			<td>5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>607180</td>
			<td>5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>760180</td>
			<td>5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>750257</td>
			<td>2 &#181;l, 20 &#181;l, 200 &#181;l</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>738257</td>
			<td>2 &#181;l, 20 &#181;l, 200 &#181;l</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>771257</td>
			<td>2 &#181;l, 20 &#181;l, 200 &#181;l</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket with lid *</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10146-290</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini diaphragm vacuum pump, VP 86 *</td>
			<td>VWR</td>
			<td>181-0065</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144801</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123600</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123615</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123601</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123602</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">* Materials marked with an asterisk are expensive vpieces of equipment and are usually central infrastructure items shared between multiple labs. These items can also be replaced by equivalents if available. Note, when a different ultracentrifuge is used, care must be taken to select the correct rotor and centrifuge tubes.</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors

Gen leveransverktyg baserat på adeno-associerade virus (AAVs) är ett populärt val för leverans av transgener till det centrala nervsystemet (CNS), inklusive gen terapi program. AAV vektorer är icke-replikering, kan infektera både dela och icke-dela celler och ge långsiktiga transgenens uttryck. Ännu viktigare, vissa serotyper, såsom nyligen beskriven PHP. B, kan korsa blod-hjärna-barriären (BBB) i djurmodeller, efter systemisk leverans. AAV vektorer kan produceras effektivt i laboratoriet. Robust och reproducerbara protokoll krävs dock att erhålla AAV vektorer med tillräcklig renhet nivåer och antikroppnivåns värden tillräckligt hög för i vivo applikationer. Det här protokollet beskriver en effektiv och reproducerbara strategi för AAV vektor produktion, baserat på en iodixanol gradient rening strategi. Iodixanol rening metoden är lämplig för att erhålla partier av hög-titer AAV vektorer av hög renhet, jämfört med andra reningsmetoder. Protokollet är dessutom allmänt snabbare än andra metoder som för närvarande beskrivs. Dessutom en kvantitativ polymerasen kedjar reaktion (qPCR)-baserad strategi beskrivs för en snabb och noggrann bestämning av vektor titern, liksom silver färgning metod att bestämma renheten av vektor batchen. Slutligen, representativa resultat gen leverans till CNS, efter systemisk administrering av AAV-PHP. B, presenteras. Sådana resultat bör vara möjligt i alla laboratorier med de protokoll som beskrivs i denna artikel.

AAV9 ansågs, tills nyligen, att vara den mest effektiva AAV vektor serotypen i passerar BBB och transducing celler i CNS, perifer administrering. Ett viktigt framsteg i kapsid design uppnåddes när Deverman et al. rapporterade användningen av en metod för urval av kapsid som kallas Cre rekombination-baserade AAV-riktad evolution (skapa)17. Med den här metoden identifierat de en ny kapsid, heter PHP. B, som de uppgavs kunna transduce majoriteten av astrocyter och nervceller i flera CNS regioner, efter systemisk injektion17. Vid denna punkt, det bör noteras att även om PHP. B ger positiva resultat i C57/Bl6 möss (som var den stam som används i de ursprungliga isolering experiment), preliminära rapporter tyder dess effektivitet kan variera på ett sätt som stam-beroende. Ytterligare experiment kommer, utan tvekan, sprida mer ljus över denna fråga31.
Trots dessa problem, PHP. B erbjuder spännande möjligheter för noninvasiv gen manipulation i CNS av möss, inklusive proof-of-concept gen terapi experiment i sjukdomsmodeller. Som sådan, valde vi att bedöma effektiviteten av transgenens uttryck med hjälp av PHP. B kontra AAV9, som har varit 'guld-standard' vektorn för CNS transduktion perifer administrering sedan 20092. För att utföra en direkt jämförelse av båda serotyperna, under optimala förhållanden för transgenens uttryck, använde vi en sc genomet konfiguration32. Båda vektorer bärs transgenens för grönt fluorescerande protein (GFP) under kontroll av promotorn allestädes närvarande kyckling β-aktin (CBA). C57/Bl6 honmöss vid postnatal dag 42 (ca 20 g i vikt) fick en dos på 1 x 1012 vg per mus av antingen scAAV2/PHP. B-CBA-GFP eller scAAV2/9-CBA-GFP. Vector administrationen var utförs via svans ven injektion. Experimenten godkändes av den etiska kommittén den KU Leuven.
Tre veckor postinjection, mössen genomgick transcardial perfusion med iskall PBS, följt av 4% (w/v) iskall PARAFORMALDEHYD (PFA). Deras hjärnor skördades och genomgick ytterligare postfixation genom en över natten inkubation i samma fixeringsvätskan, innan du överför till 0,01% (w/v) Na-natriumazid/PBS för lagring tills vidare analys. Efteråt, hjärnor var sektioneras med hjälp av en vibrerande mikrotomen och immunohistokemi utfördes på 50 µm tjocka sektioner.
För att utvärdera nivåerna av transgenens uttryck, avsnitt var fläckade med primära antikroppar mot GFP (kanin anti-GFP), detektering med sekundära antikroppar konjugerat med ett fluorescerande färgämne (anti-kanin Alexa Fluor 488) (figur 4A, B ). Fluorescens intensitet mätningar (i godtyckliga enheter [au]) bekräftade en betydande ökning av GFP uttryck när en sc genomet och PHP. B kapsid användes i förhållande till AAV9. Observerades förhöjningar GFP i storhjärnan (2105 ± 161 vs. 1441 ± 99 au; p = 0.0032), lillhjärnan (2601 ± 196 vs. 1737 ± 135 au; p = 0.0032), och hjärnstammen (3082 ± 319 vs. 2485 ± 88 au; p = 0.0038) (figur 4 c).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58960/58960fig4.jpg"> Figur 4: systemisk leverans av scAAV2/PHP. B-CBA-GFP leder till en hög GFP uttryck i CNS. scAAV2/PHP. B-CBA-GFP eller scAAV2/9-CBA-GFP (1 x 1012 vg/mus) administrerades till 6 veckor gamla C57/Bl6 möss via svans ven injektion. GFP upptäcktes med immunohistokemi på koronalt hjärnan avsnitt 3 veckor postinjection. (A) de storhjärnan och (B) visas i lillhjärnan och hjärnstammen. Skala barer = 1 mm. (C) kvantifiering av relativa fluorescens stödnivåer utfördes för att bestämma nivåerna av GFP signal uppnås med varje vektor (10 sektioner per mus; tre möss per vektor grupp). En envägs ANOVA-test utfördes, följt av en tvåsidiga Students t-test; data är uttryckt som medelvärde ± standardavvikelse; p < 0,01; Au. godtyckliga enheter. pCapsid, används för AAV vektor produktion, innehåller den gen rep från serotyp 2 och gen cap från serotyp PHP. B eller AAV9, med detta. Denna siffra har ändrats från Rincon et al.32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58960/58960fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors at JoVE.com

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Produktion, rening och kvalitetskontroll för Adeno-associerade Virus-baserat vektorer

Här beskriver vi en effektiv och reproducerbara strategi för att producera, titer och kvalitetskontroll partier av adeno-associerade virusvektorer. Det tillåter användaren att få en vektor beredning med hög-titer (≥ 1 x 1013 vektor genomen/mL) och en hög renhet, redo för bruk in vitro- eller in-vivo .

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Genom att följa detta protokoll kommer användaren att kunna producera AAV-vektorer av hög renhet och avkastning som lämpar sig för in vitro- eller in vivo-program. Detta protokoll kan användas för att producera och rena en rad AAV-serotyper med skillnader i konfigurationer. Kombinera dessa två element kan vara användbart för att erhålla celltyp och vävnad specifika uttryck.Produktion av vissa serotyper kan ge till lägre avkastning. Detta är produktion där det finns nära serotyper och bör utvärderas på individuell basis. Demonstrera dessa förfaranden kommer att Shelly Fripont, en tekniker från vårt laboratorium.Efter odling av HEK-cellerna, blanda 360 mikrogram hjälpreda plasmid, 180 mikrogram plasmid kodning vektorn capsid, och 180 mikrogram plasmid som innehåller transgen i 18 milliliter av 150 millimolar natriumklorid för att förbereda DNA-mixen. Fördela denna mix över tre 50 milliliter koniska rör. I ett nytt koniskt rör, blanda 840 mikrogram PEI och sex milliliter på 150 millimolarnatriumklorid för att förbereda PEI-mixen för sex cellodlingsrätter.Tillsätt sedan sex milliliter av PEI-blandningen, droppe för droppe, till ett av de koniska rören som innehåller DNA-blandningen. Inkubera i rumstemperatur i 20 minuter. Därefter ta bort sex cellkulturrätter från inkubatorn.I en laminär flöde huva, helt aspirera mediet från varje maträtt. Skölj disken med fem milliliter förvuppverat DPBS för att avlägsna spår av mediet. Luta vardera skålen försiktigt för att säkerställa att DPBS är jämnt fördelat över hela ytan.Sedan, försiktigt aspirera DPBS. Tillsätt 12 milliliter DMEM en till varje maträtt långsamt, med en pipett placeras i kanten av skålen. Blanda PEI och DNA-blandningen genom pipettering upp och ner tre till fem gånger.Tillsätt två milliliter av denna blandning till var och en av de sex cellkultur rätter i en droppe för droppe mode, se till att noggrant distribuera den över hela ytan. Upprepa denna process med sex cellkultur rätter i taget tills de når 18 cell kultur rätter. Skaka försiktigt cellodlingsrätterna för att fördela PEI DNA-blandningen.Inkubera de transfekterade cellerna vid 37 grader Celsius med 95 procents luftfuktighet och fem procent koldioxid i fem timmar. Efter detta, lägga till ytterligare 12 milliliter DMEM 10 till var och en av de 18 rätter utan att ta bort det befintliga mediet. Fortsätt inkubera de transfekterade cellerna under samma förhållanden.Vid 72 timmar efter transfection, använd en cell skrapa för att försiktigt lossa cellerna från varje odlingsfat. Samla mediet och cellerna i två odlingsrätter i ett 15 milliliter koniskt rör, som hålls på is. Centrifugera rören vid 420 gånger G och vid fyra grader Celsius i 10 minuter med acceleration och inbromsning av centrifug inställd på maximalt.Kassera supernatanten försiktigt från varje rör genom att försiktigt hälla den i en behållare för avfallshantering. Placera sedan rören som innehåller cellpelletsen på is. Vi upphäver varje pellet i två milliliter lysbuffert och mixar genom att pipettera upp och ner fem till tio gånger.Dra AAV från tre rör, tillsammans. Till att börja med frysa de åter upphängda cellerna genom att placera dem i en hink som innehåller torris blandat med etanol. Tina sedan cellerna genom att omedelbart placera dem i ett vattenbad som ligger på 37 grader Celsius.Upprepa denna frys- och töcykel tre gånger för att lysa cellerna och frisläpp AAV-partiklarna. Efter det tredje upptiningssteget centrifug vid 1167 gånger G och vid fyra grader Celsius i 15 minuter. Överför försiktigt supernatanterna för att rengöra 50 milliliter koniska rör.Tillsätt nukleas till varje rör till en slutkoncentration på 50 enheter per milliliter supernatant. Inkubera i 37 grader Celsius i 30 minuter, medan virvlande rören var 10 minuter för att säkerställa att nukleas blandas noggrant med supernatanten. Centrifugera vid 13490 gånger G och vid fyra grader Celsius i 20 minuter för att klargöra supernatanten.Efter detta, ta bort kolven i en 10 milliliter spruta, fäst en 0,45 mikrometer filter till sprutan och placera den ovanpå en ren 50 milliliter koniska röret. Fyll försiktigt sprutan med den klarnatade supernatanten. Använd kolven för att tvinga lysate genom filtret.Därefter förbereda var och en av iodixanol fraktioner i fyra separata 50 milliliter koniska rör, som beskrivs i tabell ett av textprotokollet. Pipett åtta milliliter av 15 procent iodixanol i vart och ett av de tre ultracentrifugrören. Pipett 5,5 milliliter av 25 procent iodixanol till ett rent 50 milliliter koniskt rör.Med hjälp av en icke-graderad Pasteurpipett, försiktigt lager 5,5 milliliter av 25 procent iodixanol lösning under 15 procent iodixanol lösning. Lägg till 40-procentiga och 60-procentiga lösningarna enligt beskrivningen i textprotokollet. Iodixanolfraktioner ska inte blandas på skiktning.Med hjälp av en Pasteur pipett, lager den råa lysate ovanpå 15 procent iodixanol gradient, droppe för droppe, för att undvika att störa gränssnittet mellan rå lysate och iodixanol lösning. Fyll varje ultracentrifugeringsrör med lysbuffert tills menisken når basen av rörhalsen, för att säkerställa att röret inte kollapsar under de mycket höga krafter som genereras under ultracentrifugering. Stäng rören med hjälp av lämpliga lock.Med hjälp av en digital skala, se till att alla tre ultracentrifugeringsrör har samma vikt. Justera vikten vid behov, genom att lägga till mer lysbuffert ovanpå rå lysate. Använd en titanrotor med fast vinkel för att centrifugera rören vid 301580 gånger G och vid 12 grader Celsius i en timme och 40 minuter med hjälp av maximal acceleration och deceleration.Därefter fäster du en nål på en fem milliliter spruta. Ta bort distansen från rören i rotorn, och återvinna rören efter centrifugalisering. Aspirera endast 40 procent iodixanol fraktion som innehåller vektorpartiklarna.Antingen bearbeta provet eller lagra det på fyra grader Celsius. Här demonstreras ett protokoll som kan användas för att producera AAV-vektorer med en mängd olika kapsider, genomkonfigurationer, promotortyper och transgenlaster. I detta exempel producerade vi och renade två olika AAV-vektorer som uttryckte det gröna fluorescerande proteinet från ett självkompleativt genom.De två vektorerna utmärker sig genom olika capsids:PHPB och AAV9. De levererades, via svans ven injektion, till vuxna C57 svarta sex möss. För att utvärdera nivåerna av transgenuttryck tre veckor efter injektionen färgas sektioner med primära antikroppar mot GFP med påvisande med hjälp av sekundära antikroppar konjugerade till ett fluorescerande färgämne.Fluorescensintensitetsmätningar visar en betydande ökning av GFP-uttryck när PHPB-vektorn används i förhållande till AAV9. Ökningar i GFP observerades i storhjärnan, lillhjärnan, och i hjärnstammen. Den exakta samlingen av vektorn som innehåller fraktion är avgörande för detta protokoll.I fall detta inte görs på rätt sätt, vektorn avkastning samt vektorn renhet påverkas negativt. Att kunna producera AAV vektorer, små laboratorier kommer att vara i stånd att dra nytta av många experimentella möjligheter att leverera gener i centrala nervsystemet. Detta protokoll kräver användning av en ultracentrifug och det är viktigt att få ordentlig utbildning innan du hanterar detta för att undvika olyckor.Vidare klassificeras AAV-vektorer ofta som biorisker och därför bör du konsultera lokala bestämmelser innan du hanterar och hanterar dem.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Intrakraniell Injektion av Adeno-associerad virala vektorer

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Produktion av Lentiviral vektorer för att omvandla Celler från det centrala nervsystemet

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

Subpierad adenoassocierad virus 9 (AAV9) vektorleverans i vuxna möss

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction

Metoder och Tips för intravenös administrering av Adeno-associerade Virus till råttor och utvärdering av centrala nervsystemet transduktion

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Visualisering och levande avbildning av Oligodendrocyte organeller i Organotypic hjärnan skivor med hjälp av Adeno-associerade Virus och konfokalmikroskopi

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

En i Ovo -modell för att testa Insulin-liknande föreningar

Elevated blood glucose levels in type 2 diabetes mellitus (T2DM), a complex and multifactorial metabolic disease, are caused by insulin resistance and ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Adeno-associerade Virus-medierad transgenens uttryck i genetiskt definierade nervceller i ryggmärgen

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

Direkta intratekal injektion av rekombinant Adeno-associerade virus i vuxna möss

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images

Konvektion förbättrad leverans av Optogenetiska Adeno-associerad viral vektor till cortex av Rhesus macaque under ledning av online MRI-bilder

In non-human primate (NHP) optogenetics, infecting large cortical areas with viral vectors is often a difficult and time-consuming task. Here, we ...

WheelCon: A Wheel Control-Based Gaming Platform for Studying Human Sensorimotor Control

WheelCon: En hjulkontrollbaserad spelplattform för att studera mänsklig sensorimotorisk kontroll

Feedback control theory has been extensively implemented to theoretically model human sensorimotor control. However, experimental platforms capable of ...