Name: production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors
Uploaded: 2019-01-29T14:00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors at JoVE.com

Mr Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (iki) doktora sonrası Bursu (133722/1204517N) tarafından desteklenen ve Fundación kardiyovasküler de Kolombiya ve Yönetim Bilimi Bölümü sürekli destek kabul eder, Teknoloji ve yenilik (Grant CT-FP44842-307-2016, proje kodu 656671250485). Mm bir iki Doktora Bursu (1S48018N) tarafından desteklenmektedir. M.G.H. bir VIB kurumsal grant ve Thierry Latran Vakfı (SOD-VIP), vakıf Alzheimer araştırma (SAO-FRA) (P #14006), iki (Grant 1513616N) ve Avrupa Araştırma Konseyi (ERC) (Grant başlangıç için dış destek tarafından desteklenmiştir 281961 - AstroFunc; ««Kavramı Grant 713755 - reklam-VIP kanıtı). Yazarlar için fare yetiştirme onun yardımıyla Jeason Haughton, Stephanie Castaldo kuyruk ven enjeksiyonları gerçekleştirme ona yardım için ve Caroline transfected HEK293T hücrelerin görüntülerini sağlamak için Eykens kabul edersiniz. M.G.H. Michael Dunlop, Peter Hickman ve Dean Harrison kabul eder.

<ol>
	<li>Daya, S., Berns, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Therapy+Using+Adeno-Associated+Virus+Vectors.">Gene Therapy Using Adeno-Associated Virus Vectors.</a> Clinical Microbiology Reviews. 21 (4), 583-593 (2008).</li><li>Duque, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+Administration+of+Self-complementary+AAV9+Enables+Transgene+Delivery+to+Adult+Motor+Neurons.">Intravenous Administration of Self-complementary AAV9 Enables Transgene Delivery to Adult Motor Neurons.</a> Molecular Therapy. 17 (7), 1187-1196 (2009).</li><li>Bourdenx, M., Dutheil, N., Bezard, E., Dehay, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+gene+delivery+to+the+central+nervous+system+using+Adeno-associated+virus.">Systemic gene delivery to the central nervous system using Adeno-associated virus.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, (2014).</li><li>Kantor, B., McCown, T., Leone, P., Gray, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Applications+Involving+CNS+Gene+Transfer.">Clinical Applications Involving CNS Gene Transfer.</a> Advances in Genetics. 87, 71-124 (2014).</li><li>Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus:+The+First+Effective+In+Vivo+Gene+Delivery+Vector.">Adenovirus: The First Effective In Vivo Gene Delivery Vector.</a> Human Gene Therapy. 25 (1), 3-11 (2014).</li><li>Weinberg, M. S., Samulski, R. J., McCown, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+(AAV)+gene+therapy+for+neurological+disease.">Adeno-associated virus (AAV) gene therapy for neurological disease.</a> Neuropharmacology. 69, 82-88 (2013).</li><li>Henckaerts, E., Linden, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus:+a+key+to+the+human+genome?.">Adeno-associated virus: a key to the human genome?.</a> Future Virology. 5 (5), 555-574 (2010).</li><li>Howarth, J. L., Lee, Y. B., Uney, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+viral+vectors+as+gene+transfer+tools+(Cell+Biology+and+Toxicology+Special+Issue:+ETCS-UK+1+day+meeting+on+genetic+manipulation+of+cells).">Using viral vectors as gene transfer tools (Cell Biology and Toxicology Special Issue: ETCS-UK 1 day meeting on genetic manipulation of cells).</a> Cell Biology and Toxicology. 26 (1), 1-20 (2010).</li><li>Nathwani, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-Associated+Virus+Vector-Mediated+Gene+Transfer+in+Hemophilia+B.">Adenovirus-Associated Virus Vector-Mediated Gene Transfer in Hemophilia B.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (25), 2357-2365 (2011).</li><li>Carter, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+and+the+development+of+adeno-associated+virus+vectors:+a+historical+perspective.">Adeno-associated virus and the development of adeno-associated virus vectors: a historical perspective.</a> Molecular Therapy. 10 (6), 981-989 (2004).</li><li>Schambach, A., Zychlinski, D., Ehrnstroem, B., Baum, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosafety+Features+of+Lentiviral+Vectors.">Biosafety Features of Lentiviral Vectors.</a> Human Gene Therapy. 24 (2), 132-142 (2013).</li><li>Van Vliet, K. M., Blouin, V., Brument, N., Agbandje-McKenna, M., Snyder, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+the+Adeno-Associated+Virus+Capsid+in+Gene+Transfer.">The Role of the Adeno-Associated Virus Capsid in Gene Transfer.</a> Methods in Molecular Biology. 437, 51-91 (2008).</li><li>Rincon, M. Y., VandenDriessche, T., Chuah, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+cardiovascular+disease:+advances+in+vector+development,+targeting,+and+delivery+for+clinical+translation.">Gene therapy for cardiovascular disease: advances in vector development, targeting, and delivery for clinical translation.</a> Cardiovascular Research. 108 (1), 4-20 (2015).</li><li>Samulski, R. J., Muzyczka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-Mediated+Gene+Therapy+for+Research+and+Therapeutic+Purposes.">AAV-Mediated Gene Therapy for Research and Therapeutic Purposes.</a> Annual Review of Virology. 1 (1), 427-451 (2014).</li><li>McCarty, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-complementary+AAV+Vectors;+Advances+and+Applications.">Self-complementary AAV Vectors; Advances and Applications.</a> Molecular Therapy. 16 (10), 1648-1656 (2008).</li><li>Choi, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+AAV+expression+cassettes+to+improve+packaging+capacity+and+transgene+expression+in+neurons.">Optimization of AAV expression cassettes to improve packaging capacity and transgene expression in neurons.</a> Molecular Brain. 7, 17 (2014).</li><li>Deverman, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre-dependent+selection+yields+AAV+variants+for+widespread+gene+transfer+to+the+adult+brain.">Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 204-209 (2016).</li><li>Jackson, K. L., Dayton, R. D., Deverman, B. E., Klein, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Better+Targeting,+Better+Efficiency+for+Wide-Scale+Neuronal+Transduction+with+the+Synapsin+Promoter+and+AAV-PHP.B.">Better Targeting, Better Efficiency for Wide-Scale Neuronal Transduction with the Synapsin Promoter and AAV-PHP.B.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, (2016).</li><li>Lock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+Manufacturing+of+Recombinant+Adeno-Associated+Viral+Vectors+at+Scale.">Versatile Manufacturing of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors at Scale.</a> Human Gene Therapy. 21 (10), 1259-1271 (2010).</li><li>Strobel, B., Miller, F. D., Rist, W., LamLa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Analysis+of+Cesium+Chloride-+and+Iodixanol-Based+Purification+of+Recombinant+Adeno-Associated+Viral+Vectors+for+Preclinical+Applications.">Comparative Analysis of Cesium Chloride- and Iodixanol-Based Purification of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors for Preclinical Applications.</a> Human Gene Therapy Methods. 26 (4), 147-157 (2015).</li><li>Jungmann, A., Leuchs, B., Katus, H. A., Rommelaere, J., M&#252;ller, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+efficient+generation+and+characterization+of+adeno-associated+viral+(AAV)+vectors.">Protocol for efficient generation and characterization of adeno-associated viral (AAV) vectors.</a> Human Gene Therapy Methods. , (2017).</li><li>Tolmachov, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+Plasmid+Vectors.">Designing Plasmid Vectors.</a> Methods in Molecular Biology. 542, 117-129 (2009).</li><li>. QIAGEN Plasmid Purification Handbook Available from: <a target="_blank" href="https://www.qiagen.com/us/resources/download.aspx?id=46205595-0440-459e-9d93-50eb02e5707e&amp;lang=en">https://www.qiagen.com/us/resources/download.aspx?id=46205595-0440-459e-9d93-50eb02e5707e&amp;lang=en</a> (2018)</li><li>Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+Determination+of+Single-Stranded+and+Self-Complementary+Adeno-Associated+Viral+Vector+Genome+Titers+by+Droplet+Digital+PCR.">Absolute Determination of Single-Stranded and Self-Complementary Adeno-Associated Viral Vector Genome Titers by Droplet Digital PCR.</a> Human Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).</li><li>. ProteoSilver Silver Stain Kit (PROTSIL1) - Bulletin, ProteoSilver Available from: <a target="_blank" href="https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/protsil1bul.pdf">https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/protsil1bul.pdf</a> (2018)</li><li>Machholz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+Restraint+and+Common+Compound+Administration+Routes+in+Mice+and+Rats.">Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), e2771 (2012).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents.">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Puntel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+rat+brain+using+adenoviral+vectors.">Gene transfer into rat brain using adenoviral vectors.</a> Current Protocols in Neuroscience. 50 (1), (2010).</li><li>Bachman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+on+Freely+Floating+Fixed+Tissue+Sections.">Immunohistochemistry on Freely Floating Fixed Tissue Sections.</a> Methods in Enzymology. 533, 207-215 (2013).</li><li>Hordeaux, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Neurotropic+Properties+of+AAV-PHP.B+Are+Limited+to+C57BL/6J+Mice.">The Neurotropic Properties of AAV-PHP.B Are Limited to C57BL/6J Mice.</a> Molecular Therapy. 26 (3), 664-669 (2018).</li><li>Rincon, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+transduction+of+astrocytes+and+neurons+in+the+mouse+central+nervous+system+after+systemic+delivery+of+a+self-complementary+AAV-PHP.B+vector.">Widespread transduction of astrocytes and neurons in the mouse central nervous system after systemic delivery of a self-complementary AAV-PHP.B vector.</a> Gene Therapy. 25 (2), 83-92 (2018).</li><li>Crosson, S. M., Dib, P., Smith, J. K., Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helper-free+Production+of+Laboratory+Grade+AAV+and+Purification+by+Iodixanol+Density+Gradient+Centrifugation.">Helper-free Production of Laboratory Grade AAV and Purification by Iodixanol Density Gradient Centrifugation.</a> Molecular Therapy. Methods &amp; Clinical Development. 10, 1-7 (2018).</li><li>Merdan, T., Kunath, K., Fischer, D., Kopecek, J., Kissel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+processing+of+poly(ethylene+imine)/ribozyme+complexes+can+be+observed+in+living+cells+by+using+confocal+laser+scanning+microscopy+and+inhibitor+experiments.">Intracellular processing of poly(ethylene imine)/ribozyme complexes can be observed in living cells by using confocal laser scanning microscopy and inhibitor experiments.</a> Pharmaceutical Research. 19 (2), 140-146 (2002).</li><li>Meissner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+gene+expression:+recombinant+protein+production+with+suspension-adapted+HEK293-EBNA+cells.">Transient gene expression: recombinant protein production with suspension-adapted HEK293-EBNA cells.</a> Biotechnology and Bioengineering. 75 (2), 197-203 (2001).</li><li>Reed, S. E., Staley, E. M., Mayginnes, J. P., Pintel, D. J., Tullis, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+mammalian+cells+using+linear+polyethylenimine+is+a+simple+and+effective+means+of+producing+recombinant+adeno-associated+virus+vectors.">Transfection of mammalian cells using linear polyethylenimine is a simple and effective means of producing recombinant adeno-associated virus vectors.</a> Journal of Virological Methods. 138 (1-2), 85-98 (2006).</li><li>Zolotukhin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+adeno-associated+virus+purification+using+novel+methods+improves+infectious+titer+and+yield.">Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield.</a> Gene Therapy. 6 (6), 973-985 (1999).</li><li>Kaludov, N., Handelman, B., Chiorini, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+Purification+of+Adeno-Associated+Virus+Type+2,+4,+or+5+Using+Ion-Exchange+Chromatography.">Scalable Purification of Adeno-Associated Virus Type 2, 4, or 5 Using Ion-Exchange Chromatography.</a> Human Gene Therapy. 13 (10), 1235-1243 (2002).</li><li>Nass, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+Method+for+the+Purification+of+Recombinant+AAV+Vectors+of+Differing+Serotypes.">Universal Method for the Purification of Recombinant AAV Vectors of Differing Serotypes.</a> Molecular Therapy. Methods &amp; Clinical Development. 9, 33-46 (2017).</li><li>Qu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+adeno-associated+virus+type+2+empty+particles+from+genome+containing+vectors+by+anion-exchange+column+chromatography.">Separation of adeno-associated virus type 2 empty particles from genome containing vectors by anion-exchange column chromatography.</a> Journal of Virological Methods. 140 (1-2), 183-192 (2007).</li><li>Holehonnur, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+viral+serotypes+produce+differing+titers+and+differentially+transduce+neurons+within+the+rat+basal+and+lateral+amygdala.">Adeno-associated viral serotypes produce differing titers and differentially transduce neurons within the rat basal and lateral amygdala.</a> BMC Neuroscience. 15, 28 (2014).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+spinal+cord+transduction+by+intrathecal+injection+of+rAAV+delivers+efficacious+RNAi+therapy+for+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Widespread spinal cord transduction by intrathecal injection of rAAV delivers efficacious RNAi therapy for amyotrophic lateral sclerosis.</a> Human Molecular Genetics. 23 (3), 668-681 (2014).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Rekombinant AAV vektörel çizimler üretimi burada kullandığı malzeme ve ekipman çoğu Moleküler Biyoloji Laboratuvarları ve hücre kültür imkanları için ortak nitelendirdi. Vitro ve in vivo uygulamaları bir dizi birden çok hücre ve doku türü hedeflenecek kullanılan saf, preklinik sınıf AAV vektörel çizimler elde etmek kullanıcı sağlar. Bu iletişim kuralı, (yani, CsCl tabanlı arıtma), diğerlerine göre en büyük avantajlarından biri gerekli kısa çalışma zamanı. Kullanıma hazır AAV elde edilebilecek en fazla HEK293T hücrelerinin ilk transfection 6 işgünü içinde vektörleridir.
Çeşitli faktörler son verim veya AAV vektör kalitesini olumsuz etkileyebilir. Zavallı transfection verimliliği düşük viral verim33için ana nedenlerinden biri. Önemli bir tavsiye daha--dan 20 kere pasajlı değil ve bir hücre izdiham 90 %'den büyük transfection21anda var mı HEK293T hücreleri kullanılır. Ayrıca, seçilen transfection yöntemi sonuçları üzerinde büyük bir etkisi vardır. Bu iletişim kuralı PEI kullanımına dayanır. PEI eksojen DNA hücre çekirdeği kompleksleri polimer ve nükleik asit, hücre ve ticareti yoluyla endosomes34tarafından alınır polyplexes olarak bilinen nesil aracılığıyla teslim alma olanağı katyonik bir polimerdir. PEI tabanlı transfection, kalsiyum fosfat35ile DNA'ın yağış Co gibi diğer yaygın olarak kullanılan yöntemlerin aksine gerçekleştirmek için hızlı ve kolay. Ayrıca, PEI tabanlı transfection katyonik lipidler ve mıknatıs-aracılı transfection36kullanımı gibi yeni tanıtılan diğer yöntemlere göre çok daha ucuz.
Arıtma strateji protokolünde önemli bir rol oynar. Diğer yöntemlerine göre iodixanol tabanlı purifications boş viral parçacıkların (% 20)20daha yüksek bir yüzdesi içeren eğilimindedir. Bu, bir dereceye kadar gerçeği iodixanol tabanlı arıtma rutin AAV vektör hazırlıkları az 100 bir parçacık infektivite oranı ile sonuçları ile dengeleniyor. Bu parçacık infektivite önemli kaybı bildirilen37olduğu geleneksel CsCl tabanlı yordamlara ile karşılaştırıldığında önemli bir gelişme gösterir. AAV vektörel çizimler arındırmak için başka bir ortak alternatif Kromatografi dayalı saflaştırma yöntemidir. Ancak, bu yöntem özel bir sütunda kullanılan her vektör kapsid için gerekli olan önemli dezavantajı vardır: AAV2 heparin sütunları kullanarak klasik izole olmakla birlikte, örneğin, bu yöntemi AAV4 ve AAV5, hangi heparin bağlama sahip olmayan çalışmıyor onların capsids38sitelerinde. Kromatografi arıtma aynı zamanda pahalı olduğunu göz önünde bulundurursak, arıtma iodixanol tabanlı genellikle daha yüksek kaliteli toplu işlemleri AAV vektörlerin tarihinde bir küçük ölçekli33,39, üretmek istediğiniz laboratuarlar için uygundur 40. ancak, son verim ve vektör saflığı en üst düzeye çıkarmak için aşırı kaygı iodixanol degradeler yaparken gereklidir. Çeşitli iodixanol kesirler olan ucu tüp duvarına dokunmadan steril bir Pasteur pipet kullanarak ultrasantrifüj tüp aktarılması gerektiğini: iodixanol ihraç pipet yavaş yavaş ve sürekli olarak. Vektör parçacıklar % 40 iodixanol katmanında biriktikçe, bakım degrade arabirimleri20rmay sağlamak için alınması gerekiyor. Son olarak, vektör içeren kesir bir göstergesi 20 G. değil daha büyük bir paslanmaz çelik künt iğneyle ekleme tarafından kurtarıldı Vektör kurtarma en üst düzeye çıkarmak için açık kesir tam olarak alınması. Bu adım sırasında zamanlama çok önemlidir. Hazırlık saflığı ödün önlemek için koleksiyon (bulaşıcı) diğer aşamalarında geçişin toplanan önce durdurmak için esastır.
Elde edilen vektör titresi farklılıkları da paketlenmiş parçacıklar üretmek için iç yetenek vektör için bağlanabilir. Farklı AAV serotipleri arasında bir karşılaştırma bazı AAV vektörel çizimler (örneğin, AAV2) diğerlerinden daha yüksek bir titresi, üretmek daha zor olduğunu gösterdi41. Vektör, yağış sırasında desalting adım daha düşük bir titresi olası bir neden olabilir ve kolayca overconcentration33kaçınarak engelledi. Ayrıca, iodixanol gradyan tabanlı arıtma verimliliğini biraz serotipleri arasında değişir ve bu nedenle, farklı serotipi ile elde edilen titresi tutarsızlıkları41dikkat edilmesi mümkündür.
Son olarak, bu teknik bazı doğal değişkenlik qPCR DNA miktar için çok doğru bir yöntem olsa bile görülebilir işaret gerekir. Titrasyon doğruluk öncelikle kesin pipetting ve tüm çözümleri uygun vortexing bağlıdır. Okuma en doğru titresi garantilemek için qPCR bağımsız olarak tekrar edilebilir ve elde edilen değerlerin ortalaması. Bu protokol için sunulan astar seçimi bizim Laboratuvarda kullanılan pTransgene plazmid bulunan CBA organizatörü sırasını temel alır. CBA organizatörü birden çok hücre tipleri arasında yaygın sürücü ifade vektör alanında kullanılan güçlü bir sentetik organizatörü var. Sitomegalovirüs (CMV) erken artırıcı öğesi dahil olmak üzere birden çok öğe içermektedir; Düzenleyici, ilk exon ve ilk intron CBA gen; ve tavşan β globin gen splice alıcısı. Ancak, astar (organizatörü, transgene ve düzenleyici elemanlarının dahil) ifade kaset içinde bulunan hemen her öğe için tasarlanabilir. Titresi toplu işlemleri arasında karşılaştırılması da astar bölgeleri vektörel çizimler söz konusu ortak karşı kullanılan sağlamak mümkündür.
Sonuç olarak, bu protokolü AAV vektörleri ile capsids, genom yapılandırmaları, organizatörü türleri ve transgene yükler çeşitli üretmek için kullanılabilir. Bu kullanıcılar en iyi deneysel gereksinimlerinize uyacak şekilde kendi vektörel çizimler son özelliklerini kolayca uyum sağlar. Temsilcisi sonuçları sunulan örnekte PHP kullanımı. Verimli bir şekilde BBB haçlar, B kapsid yüksek verimli gen ekspresyonu MSS, aşağıdaki kuyruk ven enjeksiyon32verdi. CNS penetrant vektörel çizimler sistemik yönetim olası yan etkileri2,17,32açısından önemli avantajlar vardır. Periferik enjeksiyon invaziv tekniklerin uyarılar kaçınırken, olası bir alternatif AAV vektör teslimini beyin omurilik sıvısı içine oluşur intratekal teslimat olur. Bu teslim yolu transgene yaygın ifade MSS, periferik organ veya bağışıklık yanıtı42seviyesinin düşük daha az hedef kapalı etkilerini gösteren etkili olduğu kanıtlanmıştır. Bunlar kuyruk ven enjeksiyon daha yüksek teknik beceri gerektirir gibi çok daha zor, ancak, intratekal enjeksiyonları vardır.
Bu teknolojiyi geliştirmek için daha fazla kapsid geliştirme gen terapisi uygulamalarda AAV vektör kullanmak için fırsatlar tarafından tahrik olacak. Bu tür yaklaşımlar amyotrofik lateral skleroz, Charcot Marie Tooth hastalığı, Parkinson ve Alzheimer hastalığı18gibi şu anda tedavi edilemez CNS hastalıkları tedavi etmek için çekici olanaklar sunmaktadır.

Son 30 yılda, vahşi tipli AAVs CNS1,2,3,4içine gen transferi için son derece yararlı araçlar olduğu kanıtlanmıştır rekombinant AAV vektörler oluşturmak için tasarlanmış, 5,6 ve gen terapisi (FDA ve EMA onaylanmış tedaviler de dahil olmak üzere) hastalığı4,7' ye yaklaşıyor. MSS kullanımda için Uygunluk Sigara bölen, sonrası Mitotik hücre bulaştırmak, genellikle CNS8' bulunan yeteneğini büyük ölçüde türetilmiştir. Ancak, AAV tabanlı vektörel çizimler de diğer viral vektörler7'göre daha hafif bir immün yanıt alabilme ise uzun vadeli bir ifade herhangi bir verilen terapötik transgene4,9 izin vermenin avantajına sahip, 8,10,11,12.
Herhangi bir AAV vektör ana unsurları genom ve kapsid vardır. Vahşi tipli AAVs tek iplikçikli (ss) DNA virüsleri ile genom yaklaşık 5 kilobases (kb)13. Rekombinant AAV vektörel çizimler üretimi için temsilcisi ile kap gen (genom çoğaltma ve viral kapsid montajı için gerekli) vahşi tipi AAV genom silinir ve içinde transiçin oda bırakarak, sağlanan bir transgene14,15içeren ifade kaset. Bu çoğaltma ve3,10,14paketleme için temel olarak ters terminal tekrar dizileri (ITRs) özgün viral genom kopyası yalnızca tutulan bir AAV vektör öğelerdir. AAV vektörel çizimler transgene ifade geliştirmek için tasarlanmış; ITRs biri bir mutasyon etkili tamamlayıcı DNA strand3,7,15nesil sağlayan bir saç tokası döngü oluşumuna yol açar. İkinci-strand sentez AAVs önemli ölçüde transgene ifadesi düzeyi ve hızını artırarak, geleneksel yaşam döngüsünde tipik gereksinimini atlar bir öz-tamamlayıcı (sc) genom olarak adlandırdığı bu yapılandırma büyük avantajı olduğunu 1. Bununla birlikte, bir scAAV genom kullanarak vektör kargo kapasitesi yaklaşık 2,4 KB azaltır. Bu transgene dizileri yanı sıra Rehberleri veya mikroRNA bağlayıcı siteleri, ifade belirli hücre türleri16sınırlamak için gibi herhangi bir düzenleme dizileri içerir.
AAV kapsid vektör-konak hücre etkileşim belirler ve bir ölçüde de transgene ifade belirli konumlara sınırlamak için yararlanılabilir AAV serotip için hücre türü veya doku tropism confers. Diğerleri rekombinant yaklaşımlar (yani, PHP. aracılığıyla laboratuarlarında üretildi, ancak birkaç AAV serotipleri doğada bulunur B). Buna ek olarak, bazı capsids bestow da sistemik yönetim sonra transgenes MSS boyunca teslimini sonuçlanan BBB, çapraz yeteneği gibi diğer yararlı özellikleri. Bu AAV9, yanı sıra son zamanlarda açıklanan PHP için gösterilmiştir. B kapsid17. Sonuç olarak, bu serotipleri nörodejeneratif hastalıkları1,17,18için yeni gen terapisi yaklaşımlar için özellikle alakalı olacak şekilde kanıtlamaktadır.
Bu iletişim kuralının amacı AAV vektörler yüksek titresi ve saflık ile küçük ölçekli üretim için uygun maliyetli bir yöntem tarif etmektir. Her ne kadar burada sunulan sonuçlar PHP kullanın. B kapsid ve scAAV ifade kaset, protokol birkaç AAV vektör serotipleri ve genom yapılandırmaları, en fazla deneysel esneklik sağlayan üretimi için uygundur. Ancak, vektör verim ve son saflık seçilen serotip bağlı olarak değişebilir.
Protokolün kendisi klasik tri-transfection yöntem viral vektör üretim için bir türevi ve bir iodixanol degrade kullanım için vektör hangi sezyum klorür (CsCl) degradeler, klasik kullanımı ile karşılaştırıldığında olmuştur temizlik, birleştirmek AAV vektörel çizimler daha zaman verimli bir şekilde19,20,21daha yüksek saflık üretmek için bildirilen.
Transfection, arıtma ve toplama adımları iyi laboratuar uygulaması (GLP) göre yapılması için viral vektör çalışma için dekor doku kültürü Laboratuvarında yöneliktir. Her görev viral vektör üretim ile ilgili ilgili yerel ve ulusal mevzuata uygun olarak gerçekleştirilmesi ve kullanmak gerekiyor. Laminar akış başlık altında ve steril koşullarda çalışma yapılmalıdır. Vektör tesis içinde ek olarak normal doku kültürü laboratuar önlüğünü bir laboratuar önlüğü giymek tavsiye edilir. Ayrıca, Çift kişilik bir çift eldiven yanı sıra plastik bütünleşik, her zaman giyilmelidir.
Önce vektör üretim başlangıç sağlamak tüm gerekli ekipman ve plazmid bulunmaktadır. 1) pCapsid plazmid çoğaltma için yani Rep78, Rep68, Rep52 ve Rep40, gerekli dört yapısal olmayan protein kodlayan temsilcisi gen ve üç yapısal kapsid protein, yani VP1, VP2 ve VP3 kodlayan kap gen içerir. 2) pHelper plazmid kolaylaştırmak AAV üretim HEK293T hücrelerdeki genler E4, E2Ave VA adenovirus, üzerinden içerir. 3) pTransgene plazmid tarafından iki ITRs çevrili transgene ifade kaset içerir. Bu Plasmid'ler sentezlenmiş de novo dizileri kullanılabilir çevrimiçi22kullanarak laboratuvar olabilir. De novoyapılan plazmid için özellikle roman transgenes, içeren sıralama, transgene ve ITRs doğru olduğundan emin olmak için gereklidir. Alternatif olarak, hazır plazmid doğrudan online plazmid depoları elde edilebilir. Gerektiğinde, plazmid çoğaltılabilir ve standart kitleri kullanarak üreticinin yönergeleri23göre saf.
Vektör titresi ve saflık vektör iletim yeteneği olumsuz yönde etkilenebilir. Ek protokolleri üretilen vektör niteliğini değerlendirmek için sağlanır. Son vektörel çizimler CNS hücre işlevi vitro ve in vivo uygulamalarında çalışmaları yararlı olacaktır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Plasmid production</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTransgene plasmid</td>
			<td>De novo design or obtained from a plasmid repository</td>
			<td>N/A</td>
			<td>See step 1 of main protocol for further details</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCapsid</td>
			<td>De novo design or obtained from a plasmid repository</td>
			<td>N/A</td>
			<td>See step 1 of main protocol for further details</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHelper</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>240071</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Plus maxi kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12963</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV Helper-Free System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>240071</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Cell culture and transfection </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, no glutamine</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11960-044</td>
			<td>Supplement DMEM with FBS (1% or 10% v/v) and GlutaMAX 200 mM (1% v/v) then filter sterilize the medium using a 0.22 mm filter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10500-064</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX supplement</td>
			<td rowspan="2">GIBCO</td>
			<td rowspan="2">35050038</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(200 mM)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filter system</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430769</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (DPBS) with no calcium and no magnesium</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cells</td>
			<td>American Tissue Culture Collection</td>
			<td>CRL3216</td>
			<td>Upon receipt, thaw the cells and culture as described in the protocol. After a minimal number of passages, freeze a subfraction for future in aliquots.&#160;Always use cells below passage number 20. Once cultured cells have been passaged more than 20 times, restart a culture from the stored aliquots</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes</td>
			<td>Greiner Cellstar</td>
			<td>639160</td>
			<td>15 cm diameter culture dishes</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-904</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>23966-2</td>
			<td>PEI in powder form is dissolved at 1 &#181;g/&#181;L in deionized water (ddwater) at pH=2 (use HCl). Prepare in a beaker and stir for 2-3 h. When dissolved, bring the pH back to 7 with NaOH. Filter sterilize and store the resuspended stock solution in 1 ml aliquots at -20 &#176;C. PEI aliquots can freeze/thawed multiple times.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virkon solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9821357</td>
			<td>Disinfect any material that has been in contact with assembled viral particles with Virkon solution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutexi long-sleeve aprons</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11735423</td>
			<td>Wear an apron over the top of a regular lab coat</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand maximum protection disposable overshoes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15401952</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">AAV Purification and desalting</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optiprep density gradient medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Optiprep is a 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile). CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z627992</td>
			<td>Sterilize before use</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiSeal Polypropylene tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>361625</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase (250 U/&#181;L)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td>Supplied as a ready-to-use solution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodisc syringe filter</td>
			<td>Pall corporation</td>
			<td>4614</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnifix syringe (5mL)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4617053V</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt syringe needle</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z261378</td>
			<td>Stainless steel 316 syringe needle, pipetting blunt 90&#176; tip gauge 16, L 4 in. Referred to in the text as a blunt-end needle</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua Ecotainer</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>0082479E</td>
			<td>Sterile endotoxin-free water. Referred to as &#39;Ultrapure water&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon ultra-15 centrifugal filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td>These filters concentrate the final product by collecting the viral particles in consecutive centrifugation steps</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F68 (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>24040032</td>
			<td>Non-ionic surfactant. Dilute in sterile PBS to use at 0,01% (v/v)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps (2 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-374</td>
			<td>Use skirted tubes for easy handling</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">AAV Titration </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Restriction enzyme: StuI (10 U/&#181;L)</td>
			<td rowspan="2">Promega</td>
			<td rowspan="2">R6421</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I (1 U/&#181;L)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>EN0521</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3115852001</td>
			<td>Reconstitute in ultrapure water and use at a final concentration of 10 mg/ml. Solution can be stored at -20&#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyStrip Plus Tube Strips (with attached caps)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>AB2000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microtube 3810x</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z606340-1000EA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4707516001</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler Multiwell Plates, 96 wells</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729692001</td>
			<td>White polypropylene plate (with unique identifying barcode)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal &#39;A&#39; PCR Plate and PCR Tube Sealing Film</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>msa5001</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">AAV Purity control </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td>Reconstitute in ultrapure water to 10% (v/v). CAUTION. Use under laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base ULTROL Grade</td>
			<td>Merck</td>
			<td>648311</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16500-500</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotiphorese&#174; Gel 30 (37,5:1)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3029.3</td>
			<td>Aqueous 30 % acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ratio of 37.5:1. CAUTION. Use under laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serva Blue G</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6104-58-1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus prestained marker</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610374edu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Butanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B7906</td>
			<td>CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Immunohistochemistry</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GFP</td>
			<td>Synaptic System</td>
			<td>132002</td>
			<td>1:300 dilution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21206</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td>Comments</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Vector production lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotina 380 bench-top centrifuge *</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>1701</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN 80 ultracentrifuge *</td>
			<td>Beckmann Coulter</td>
			<td>A95765</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 50.2 Ti fixed-angle titanium rotor *</td>
			<td>Beckmann Coulter</td>
			<td>337901</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Entris digital scale *</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>2202-1S</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warm water bath *</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Set at 37&#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket *</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10146-290</td>
			<td>Keep material used in the vector production lab separate from that used in standard lab areas</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetboy pro *</td>
			<td>Integra</td>
			<td>156,400</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes: Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>606180</td>
			<td>Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes: Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>607180</td>
			<td>Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes: Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>760180</td>
			<td>Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co2 incubator CB150 *</td>
			<td>Binder</td>
			<td>9040-0038</td>
			<td>Set at 37&#176;C, 5% CO2 and 95% humidity</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuaire safety cabinet NU 437-400E *</td>
			<td>Labexchange</td>
			<td>31324</td>
			<td>Clean all the surfaces with 70% ethanol and Virkon before and after use</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Conventional lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 thermal cycler *</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 Instrument II *</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015278001</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer *</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>C 5382000015</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop *</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND 2000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Protean Tetra Cell*</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658001FC</td>
			<td>For use with handmade or precast gels</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteoSilver silver stain kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PROTSIL1</td>
			<td>High sensitivity protein detection with low background</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804 R *</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>B1_022628045</td>
			<td>High speed centrifuge for medium capacity needs (up to 250 ml)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>606180</td>
			<td>5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>607180</td>
			<td>5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated pipettes Cell star *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>760180</td>
			<td>5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>750257</td>
			<td>2 &#181;l, 20 &#181;l, 200 &#181;l</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>738257</td>
			<td>2 &#181;l, 20 &#181;l, 200 &#181;l</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips *</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>771257</td>
			<td>2 &#181;l, 20 &#181;l, 200 &#181;l</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket with lid *</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10146-290</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini diaphragm vacuum pump, VP 86 *</td>
			<td>VWR</td>
			<td>181-0065</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144801</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123600</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123615</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123601</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123602</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">* Materials marked with an asterisk are expensive vpieces of equipment and are usually central infrastructure items shared between multiple labs. These items can also be replaced by equivalents if available. Note, when a different ultracentrifuge is used, care must be taken to select the correct rotor and centrifuge tubes.</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors

Adeno ilişkili virüs (AAVs) dayalı gen teslim araçlardır gen terapisi uygulamaları da dahil olmak üzere transgenes teslim edilmek üzere merkezi sinir sistemi (MSS), popüler bir seçim. AAV vektörleridir olmayan çoğaltılıyor, güçlü-e doğru bölme ve bölme hücreleri enfekte ve uzun vadeli transgene ifade sağlar. Önemlisi, bazı serotipleri, yeni açıklanan PHP gibi. B, kan-beyin-bariyer (BBB) hayvan modellerinde çapraz olabilir sistemik teslim takip. AAV vektörel çizimler verimli laboratuvarda üretilebilir. Ancak, sağlam ve tekrarlanabilir AAV vektörleri ile yeterli saflık düzeyleri ve titresi değerleri vivo içinde uygulamaları için yüksek almak için gerekli iletişim kurallarıdır. Bu iletişim kuralı bir iodixanol degrade arıtma stratejisi dayalı AAV vektör üretim için verimli ve tekrarlanabilir bir strateji açıklar. İodixanol arıtma yöntemi dizi-in yüksek-titresi AAV vektörel çizimler yüksek saflık, diğer arıtma yöntemleri karşılaştırıldığında elde etmek için uygundur. Ayrıca, şu anda açıklanan diğer yöntemlerden daha genellikle daha hızlı iletişim kuralıdır. Buna ek olarak, nicel bir polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR)-tabanlı strateji vektör toplu saflığı belirlemek bir hızlı ve doğru belirlenmesi vektör titresi yanı sıra bir gümüş boyama yöntemi için açıklanmıştır. Son olarak, sistemik yönetim AAV-php takip MSS, gen teslimat temsilcisi sonuçları. B, sunulmaktadır. Bu sonuçlar bu makalede açıklanan protokolleri kullanarak tüm Labs'de mümkün olmalıdır.

AAV9 olarak kabul, yakın zamana kadar en etkili AAV vektör serotip BBB geçiş ve çevresel yönetim takip MSS, hücrelerin transducing olmak. Kapsid tasarımında önemli bir ilerleme elde edildi zaman Deverman ve ark. Cre AAV hedefli evrim (Oluştur) rekombinasyon tabanlı17adlı bir kapsid seçimi Yöntem kullanım rapor etmiştir. Bu yöntemi kullanarak, PHP adında yeni bir kapsid teşhis ettiler. B olarak astrocytes ve birden fazla CNS bölgesi, nöronlarda sistemik enjeksiyon17takip çoğu transduce güçlü-e doğru rapor ettiler. Bu noktada, olması gerektiği belirtti rağmen PHP. B (ki ilk yalıtım deneylerde kullanılan zorlanma) C57/Bl6 farelerde olumlu sonuçlar sağlar, verimlilik bir zorlanma bağlı şekilde değişebilir ön raporları öneririz. Hiç şüphesiz, daha fazla deneyler bu sorunu31daha fazla ışık tutacak.
Ancak, bu sorunları rağmen PHP. B kanıtı-of-concept gen terapisi deneyler hastalık modelleri dahil olmak üzere fare, MSS noninvaziv gen manipülasyon için heyecan verici olanaklar sunmaktadır. Bu nedenle, PHP kullanarak transgene ifade verimliliğini değerlendirmek seçtik. Periferik yönetiminden beri 20092takip CNS iletim için 'altın standart' vektör olmuştur B karşı AAV9. Transgene ifade için en uygun koşullarda her iki serotipleri doğrudan karşılaştırılması gerçekleştirmek için bir sc genom yapılandırma32kullanılır. Her iki vektörel çizimler transgene yeşil flüoresan protein (GFP) için her yerde tavuk β-aktin (CBA) düzenleyici denetimi altında yapılır. Kadın C57/Bl6 fareler postnatal gün 42 (yaklaşık 20 g ağırlık), 1 x 1012 vg fare ya da scAAV2/php başına bir doz aldı. B-CBA-GFP veya scAAV2/9-CBA-GFP. Vektör yönetim kuyruk ven enjeksiyon gerçekleştirilen üzerinden yapıldı. Deneyler KU Leuven Etik Komitesi tarafından kabul edildi.
Üç hafta postinjection, fareler transcardial perfüzyon %4 (w/v) buz gibi paraformaldehyde (PFA) tarafından takip buz gibi PBS ile uygulandı. Beyinleri hasat edildi ve daha fazla % 0,01 (w/v) Na-azid/PBS için depolama için daha fazla çözümleme kadar aktarmadan önce gecede bir kuluçka aynı sabitleştirici olarak tarafından postfixation uygulandı. Daha sonra beyni bir titreşimli microtome kullanarak kesitli ve immünhistokimya 50 µm kalınlığında kesitler üzerinde gerçekleştirildi.
Transgene ifade düzeyini değerlendirmek için bölümler GFP (tavşan anti-GFP), karşı birincil antikorlar ile floresan bir boya (Anti-tavşan Alexa Fluor 488) Birleşik ikincil antikorları kullanarak algılama ile lekeli (Şekil 4A, B ). Floresan yoğunluğu ölçüm sonuçları (rasgele adet [au]) doğruladı GFP ifade bir sc ne zaman önemli bir artış genom ve PHP. B kapsid AAV9 göreli olarak kullanılmıştır. GFP artışlar cerebrum (2105 ± 161 vs 1441 ± 99 au; gözlendi p 0.0032 =), beyincik (2601 ± 196 vs 1737 ± 135 au; p 0.0032 =) ve beyin sapı (3082 ± 319 vs 2485 ± 88 au; p 0.0038 =) (Şekil 4 c).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58960/58960fig4.jpg"> Şekil 4: scAAV2/PHP sistemik teslim. B-CBA-GFP MSS yüksek GFP ifadesinde yol açar. scAAV2/PHP. B-CBA-GFP veya scAAV2/9-CBA-GFP (1 x 1012 vg/fare) 6-hafta-yaşlı C57/Bl6 farelere kuyruk ven enjeksiyon yolu ile yönetiliyordu. GFP immünhistokimya koronal beyin bölümleri 3 hafta postinjection üzerinde kullanarak tespit edildi. (A)cerebrum ve (B) serebellum ve beyin sapı gösterilir. Ölçek çubukları 1 mm göreli floresans yoğunluklarını miktar her vektör (fare başına 10 bölümler; vektör grubu başına üç fare) ile elde GFP sinyal düzeylerini belirlemek için gerçekleştirilen. (C) =. Bir tek yönlü ANOVA testi gerçekleştirilen, iki kuyruklu öğrenci ttarafından takip-test; verileri ortalama ± standart sapma ifade edilir; p < 0,01; au. rasgele birimleri. AAV vektör üretim için kullanılan pCapsid, serotip 2 üzerinden gen temsilcisi ve serotip PHP gen kap içerir. B ya da AAV9, ona göre. Bu rakam Rincon değiştirildi vd.32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58960/58960fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors at JoVE.com

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Üretim, arıtma ve kalite kontrol için virüs tabanlı vektörel çizimler Adeno ilişkili

Burada, biz üretmek için verimli ve tekrarlanabilir bir strateji, titresi ve adeno ilişkili virüs vektörlerin kalite kontrol toplu işlemleri açıklanmaktadır. Bir vektör hazırlık ile yüksek-titresi elde etmek kullanýcýnýn (≥1 x 1013 vektör genleri/mL) ve yüksek saflıkta, vitro veya vivo içinde kullanıma hazır.

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Bu protokolü izleyerek, kullanıcı in vitro veya in vivo uygulamalar için uygun yüksek saflıkta ve verim AAV vektörleri üretmek mümkün olacak. Bu protokol, yapılandırmafarklılıkları olan bir dizi AAV serotipüretmek ve arındırmak için kullanılabilir. Bu iki unsuru nbirle birleştirmek hücre tipi ve dokuya özgü ifade elde etmek için yararlı olabilir.Bazı serotiplerin üretimi daha düşük verim verebilir. Bu üretim, yakın serotiplerin olduğu ve bireysel bazda değerlendirilmesi gereken üretimdir. Bu prosedürleri gösteren Shelly Fripont, bizim laboratuvar bir teknisyen olacaktır.HEK hücrelerini büyüttükten sonra, 360 mikrogram yardımcı plazmid, vektör capsid'i kodlayan 180 mikrogram plazmid ve 180 mikrogram plazmid içeren transgeni 18 mililitre 150 milimoler sodyum klorür ile karıştırın. Üç 50 mililitre konik tüpler üzerinde bu karışımı dağıtın. Yeni bir konik tüp, altı hücre kültürü yemekleri için PEI karışımı hazırlamak için PEI ve 150 milimolar sodyum klorür altı mililitre 840 mikrogram karıştırın.Sonra, DNA karışımı içeren konik tüpler birine, damla damla, PEI karışımı altı mililitre ekleyin. 20 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yat. Sonra, kuluçka makinesinden altı hücre kültürü yemeği çıkarın.Bir laminar akış kaputunda, her tabaktan ortayı tamamen aspire edin. Ortamın izlerini gidermek için bulaşıkları beş mililitre önceden ısıtılmış DPBS ile durula. DPBS'nin tüm yüzeye eşit şekilde dağıtılmasını sağlamak için her yemeği yavaşça yatırın.Daha sonra DPBS'yi nazikçe aspire edin. Her çanağa yavaş yavaş 12 mililitre DMEM ekleyin ve yemeğin kenarına bir pipet yerleştirin. PEI ve DNA karışımını 3-5 kez yukarı ve aşağı boruile karıştırın.Bu karışımın her altı hücre kültürü yemekleri bir damla damla moda, dikkatle tüm yüzeye dağıtmak için emin olun iki mililitre ekleyin. 18 hücre kültürü yemekleri ulaşana kadar bir seferde altı hücre kültürü yemekleri kullanarak bu işlemi tekrarlayın. PEI DNA karışımını dağıtmak için hücre kültürünü hafifçe sallayın.Transfected hücreleri 37 santigrat derecede yüzde 95 nem ve yüzde beş karbondioksit ile beş saat boyunca kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, önceden varolan ortamı çıkarmadan 18 yemeğin her birine 12 mililitre DMEM 10 ekleyin. Transfected hücreleri aynı koşullarda kuluçkaya yatırmaya devam edin.Transfeksiyon sonrası 72 saat, hücreleri her kültür kabından dikkatlice ayırmak için bir hücre kazıyıcı kullanın. Buz üzerinde tutulan 15 mililitrelik konik bir tüp içinde orta ve iki kültür yemekleri hücreleri toplamak. Tüpleri 420 kez G'de ve 4 derece santigrat derecede 10 dakika boyunca santrifüj edin ve santrifüjün hızlanması ve yavaşlaması maksimuma ayarlayın.Dikkatle bir atık bertaraf kabına yavaşça dökerek her tüpten supernatant atın. Daha sonra, hücre peletlerini içeren tüpleri buzüzerine yerleştirin. Biz lysis tampon iki mililitre her pelet askıya ve yukarı ve aşağı 5-10 kez pipetleme tarafından karıştırın.AAV'yi üç tüpten birlikte çekin. Başlamak için, etanol ile karışık kuru buz içeren bir kova yerleştirerek yeniden askıya hücreleri dondurun. Sonra hemen 37 santigrat derece ayarlanmış bir su banyosu yerleştirerek hücreleri eritin.Hücreleri lyse ve AAV parçacıkları serbest bırakmak için bu dondurma ve çözülme döngüsü üç kez tekrarlayın. Üçüncü erime adımından sonra, santrifüj 1167 kez G ve dört derece santigrat 15 dakika. 50 mililitrelik konik tüpleri temizlemek için süpernatantları dikkatlice aktarın.Supernatant mililitre başına 50 birim lik son konsantrasyona her tüpe nükleaz ekleyin. 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın, çekirdekten süpernatant ile iyice karıştırıldığından emin olmak için tüpleri her 10 dakikada bir döndürün. Santrifüj 13490 kez G ve dört derece santigrat 20 dakika supernatant açıklığa kavuşturmak için.Bundan sonra, 10 mililitrelik şırınganın pistini çıkarın, şırıngaya 0,45 mikrometrelik bir filtre takın ve temiz bir 50 mililitrelik konik tüpün üzerine yerleştirin. Şırıngayı açıklıklı supernatant ile dikkatlice doldurun. Filtreden lysate zorlamak için piston kullanın.Daha sonra, metin protokolütabloda belirtildiği gibi, dört ayrı 50 mililitre konik tüpler, iodixanol fraksiyonları her birini hazırlamak. Pipet üç ultracentrifuge tüplerin her içine yüzde 15 iodixanol sekiz mililitre. Pipet 5.5 mililitre yüzde 25 iyodixanol temiz bir 50 mililitre konik tüp içine.Mezun olmayan pasteur pipet kullanarak, yüzde 15 iodixanol çözeltisi altında yüzde 25 iyodixanol çözeltisi dikkatle katman 5.5 mililitre. Metin protokolünde açıklandığı gibi yüzde 40 ve yüzde 60 çözümleri ekleyin. Iodixanol fraksiyonları katmanlama üzerinde intermix olmamalıdır.Pasteur pipeti kullanarak, kaba lysate ve iodixanol çözeltisi arasındaki arayüzü rahatsız önlemek için, damla damla, yüzde 15 iodixanol gradyan üstüne kaba lysate katman. Menisküs tüp boynunun tabanına ulaşana kadar her ultracentrifugation tüpünü lysis tamponuyla doldurun, böylece tüpün ultrasantrifüj sırasında oluşan çok yüksek kuvvetler altında çökmemesini sağlayın. Tüpleri uygun kapakları kullanarak kapatın.Dijital ölçek kullanarak, üç ultracentrifugation tüpün de aynı ağırlıkta olduğundan emin olun. Ağırlığı gerektiği gibi ayarlamak, kaba lysate üstüne daha fazla lysis tampon ekleyerek. Maksimum hızlanma ve yavaşlama kullanarak tüpleri 301580 kez G ve 12 santigrat derecede bir saat 40 dakika santrifüj etmek için sabit açılı titanyum rotor kullanın.Sonra, beş mililitrelik şırıngaya iğne batırın. Rotordaki tüplerden boşluk çıkarın ve santrifüj den sonra tüpleri geri. Vektör parçacıkları içeren sadece yüzde 40 iyodixanol fraksiyonu aspire.Örneği ya işleyin ya da dört santigrat derecede saklayın. Burada, çeşitli kapsidler, genom konfigürasyonları, organizatör tipleri ve transgen kargoları ile AAV vektörleri üretmek için kullanılabilen bir protokol gösterilmiştir. Bu örnekte, yeşil floresan proteini kendi kendine ücretsiz bir genomdan ifade eden iki farklı AAV vektörü üretti kildi ve saflaştırdık.İki vektör farklı kapsidler ile ayırt edilir: PHPB ve AAV9. Onlar, kuyruk damar enjeksiyonu yoluyla, yetişkin C57 siyah altı fareler içine teslim edildi. Enjeksiyon dan üç hafta sonra transjen ekspresyon düzeylerini değerlendirmek için, kesitler flüoresan boyaya konjuge sekonder antikorlar kullanılarak saptanarak GFP'ye karşı primer antikorlarla boyanır.Floresan yoğunluğu ölçümleri PHPB vektörü AAV9'a göre kullanıldığında GFP ekspresyonunda önemli bir artış olduğunu göstermektedir. GFP'de beyin, beyincik ve beyin sapında artış lar gözlendi. Fraksiyon içeren vektörün doğru toplanması bu protokol için çok önemlidir.Bu düzgün yapılmazsa, vektör verimi ve vektör saflığı olumsuz etkilenir. AAV vektörleri üretebilen küçük laboratuvarlar, merkezi sinir sistemindegenleri teslim etmek için çok sayıda deneysel olanaktan yararlanabilecek konumda olacaktır. Bu protokol bir ultracentrifuge kullanımını gerektirir ve kazaları önlemek için bu işleme önce uygun eğitim almak önemlidir.Ayrıca, AAV vektörleri genellikle biyolojik tehlike olarak sınıflandırılır ve bu nedenle, bunları işleme ve yönetmeden önce yerel düzenlemelere danışmalısınız.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Adeno-ilişkili Viral Vektörler İntrakranial Enjeksiyon

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Merkezi sinir sisteminin transducing Hücreleri için lentiviral Vektörler Üretimi

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

Yetişkin Farelerde Subpial Adeno-ilişkili Virüs 9 (AAV9) Vektör Teslimatı

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction

Yöntemleri ve merkezi sinir sistemi iletim değerlendirilmesi ve Adeno ilişkili virüs fareler için intravenöz Yönetim için ipuçları

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Görselleştirme ve Oligodendrocyte organelleri Adeno ilişkili virüs ve Confocal mikroskobu kullanılarak Organotypic beyin dilimleri içinde canlı görüntüleme

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

İnsülin mimetic bileşikler test etmek için bir Ovo içinde modeli

Elevated blood glucose levels in type 2 diabetes mellitus (T2DM), a complex and multifactorial metabolic disease, are caused by insulin resistance and ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Omurilik genetik olarak tanımlanmış nöronlar Adeno ilişkili virüs-aracılı Transgene ifade

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

Rekombinant Adeno ilişkili virüs yetişkin farelerde doğrudan intratekal enjeksiyon

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images

Online MRG görüntüleri rehberlik altında Rhesus Macaque korteks için optogenetik Adeno-ilişkili Viral vektör konveksiyon geliştirilmiş teslim

In non-human primate (NHP) optogenetics, infecting large cortical areas with viral vectors is often a difficult and time-consuming task. Here, we ...

WheelCon: A Wheel Control-Based Gaming Platform for Studying Human Sensorimotor Control

WheelCon: İnsan Sensorimotor Kontrolü Eğitimi için Tekerlek Kontrolü Tabanlı Oyun Platformu

Feedback control theory has been extensively implemented to theoretically model human sensorimotor control. However, experimental platforms capable of ...