Name: isolation of embryonic tissues and formation of quail-chicken chimeric organs using the thymus example
Uploaded: 2019-02-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Embryonic Tissues and Formation of Quail-Chicken Chimeric Organs Using The Thymus Example at JoVE.com

الكتاب ممتنون إيزابيل الكوبايا لقراءة نقدية من المخطوطة، ماريو إنريكي للسرد الفيديو و Proa فيتور من "دائرة علم الأنسجة" ه هيستولوجيا دي معهد بيولوجيا هل التنمية، دي كلية الطب دي لشبونة، جامعة دي لشبونة، لتقديم الدعم التقني. ونحن مدينون لا سيما كايرو باولو و "هوجو سيلفا" من مقاتلي دي أوديوفيسوايس (الوحدة السمعية البصرية)، دي كلية الطب دي لشبونة، جامعة دي يسبوا على التزامهم المعلقة بإنتاج هذا الفيديو. ونعترف Microsystems إيكا يرجى توفير ستيريوسكوبي مزودة بنظام فيديو وإلى إينتيرافيس--شركة زراعية-سنة, S.A للمساهمة مع السمان يخصب البيض. هذا العمل كان يدعمه دي كلية الطب دي لشبونة، جامعة دي لشبونة (فمول).

كل هذه التجارب اتبع المبادئ التوجيهية الأخلاقية دي التاريخ مركز الطب والرعاية الحيوانية يسبوا.
1-المخصبة حضانة بيض السمان والدجاج
<ol><li>مكان بيض السمان الياباني (طائر طائر japonica) المخصب في حاضنة هوميديفيد 38 درجة مئوية لمدة 3 أيام. احتضان البيض (بيضة نهاية حادة) مواجهة في ?...

<ol>
	<li>Le Douarin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nogent+Institute--50+years+of+embryology.">The Nogent Institute--50 years of embryology.</a> The International Journal of Developmental Biology. 49 (2-3), 85-103 (2005).</li><li>Le Douarin, N. M., Teillet, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+migration+of+neural+crest+cells+to+the+wall+of+the+digestive+tract+in+avian+embryo.">The migration of neural crest cells to the wall of the digestive tract in avian embryo.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 30 (1), 31-48 (1973).</li><li>Le Douarin, N. M., Jotereau, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+of+cells+of+the+avian+thymus+through+embryonic+life+in+interspecific+chimeras.">Tracing of cells of the avian thymus through embryonic life in interspecific chimeras.</a> Journal of Experimental Medicine. 142 (1), 17-40 (1975).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.+1951.">A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951.</a> Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).</li><li>Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Bmp4+signalling+in+the+epithelial-mesenchymal+interactions+that+take+place+in+early+thymus+and+parathyroid+development+in+avian+embryos.">Modulation of Bmp4 signalling in the epithelial-mesenchymal interactions that take place in early thymus and parathyroid development in avian embryos.</a> Developmental Biology. 361 (2), 208-219 (2012).</li><li>Takahashi, Y., Bontoux, M., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelio--mesenchymal+interactions+are+critical+for+Quox+7+expression+and+membrane+bone+differentiation+in+the+neural+crest+derived+mandibular+mesenchyme.">Epithelio--mesenchymal interactions are critical for Quox 7 expression and membrane bone differentiation in the neural crest derived mandibular mesenchyme.</a> Embo Journal. 10 (9), 2387-2393 (1991).</li><li>Figueiredo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+and+Hedgehog+in+the+thymus/parathyroid+common+primordium:+Crosstalk+in+organ+formation.">Notch and Hedgehog in the thymus/parathyroid common primordium: Crosstalk in organ formation.</a> Developmental Biology. 418 (2), 268-282 (2016).</li><li>Figueiredo, M., Neves, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+Approach+to+Explore+Early-and+Late-stages+of+Organ+Formation+in+the+Avian+Model:+The+Thymus+and+Parathyroid+Glands+Organogenesis+Paradigm+Video+Link.">Two-step Approach to Explore Early-and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm Video Link.</a> Journal of Visualuzed Experiments. , (2018).</li><li>Nehls, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+genetically+separable+steps+in+the+differentiation+of+thymic+epithelium.">Two genetically separable steps in the differentiation of thymic epithelium.</a> Science (New York, N.Y.). 272 (5263), 886-889 (1996).</li><li>Morahan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nu+gene+acts+cell-autonomously+and+is+required+for+differentiation+of+thymic+epithelial+progenitors.">The nu gene acts cell-autonomously and is required for differentiation of thymic epithelial progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (12), 5742-5746 (1996).</li><li>Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DiGeorge+syndrome+phenotype+in+mice+mutant+for+the+T-box+gene,+Tbx1.">DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1.</a> Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).</li><li>Nie, X., Brown, C. B., Wang, Q., Jiao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+Bmp4+from+the+Tbx1+expression+domain+causes+abnormal+pharyngeal+arch+artery+and+cardiac+outflow+tract+remodeling.">Inactivation of Bmp4 from the Tbx1 expression domain causes abnormal pharyngeal arch artery and cardiac outflow tract remodeling.</a> Cells Tissues Organs. 193 (6), 393-403 (2011).</li><li>Zou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+of+the+third+pharyngeal+pouch+into+thymus/parathyroid+by+Six+and+Eya1.">Patterning of the third pharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1.</a> Developmental Biology. 293 (2), 499-513 (2006).</li><li>Davey, M. G., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chicken+as+a+model+for+embryonic+development.">The chicken as a model for embryonic development.</a> Cytogenetic and Genome Research. 117 (1-4), 231-239 (2007).</li><li>Nowak-sliwinska, P., Segura, T., Iruela-arispe, M. L., Angeles, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chicken+chorioallantoic+membrane+model+in+biology,+medicine+and+bioengineering.">The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering.</a> Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).</li><li>Uematsu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+in+ovo+chorioallantoic+membrane+engraftment+to+culture+testes+from+neonatal+mice.">Use of in ovo chorioallantoic membrane engraftment to culture testes from neonatal mice.</a> Comparative Medicine. 64 (4), 264-269 (2014).</li><li>Martyn, I., Kanno, T. Y., Ruzo, A., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+a+human+organizer+by+combined+Wnt+and+Nodal+signaling.">Self-organization of a human organizer by combined Wnt and Nodal signaling.</a> Nature. 558 (7708), 132-135 (2018).</li></ol>

تم تحسين إجراءات عزل الأنسجة الجنينية مفصلة هنا من الأساليب السابقة لإنتاج أجنة الدجاج السمان تشيميريك في مختلف السياقات البيولوجية3،،من56.
وهذا النهج مناسبة لعزل الأنسجة الجنينية نقية دون الحاجة إلى التلاعب بالجينات أو ?...

في أوائل السبعينات، وضعت نظاما أنيقة الدجاج السمان الوهم Le دارين، فتح آفاقاً جديدة لفهم دور الهجرة الخلية والتفاعلات الخلوية أثناء التنمية1،2. وقد وضع النموذج على الفرضية القائلة بأن الخلية التبادل بين هذين النوعين لا تخل إلى حد كبير امبريوجينيسيس، أكد في وقت لاحق عندما تستخدم لدراسة العمليات الإنمائية العديدة، بما في ذلك تشكيل الجهاز العصبي والمكونة للدم نظم1. أخذ هذا الأخير على سبيل مثال، موجات دورية من فروعه المكونة للدم استعمار بداية الظهارية الغدة الصعترية أولاً لوحظ استخدام نظام الوهم الدجاج السمان3. لذلك، إقليم المحتملين من الغدة الصعترية، الأنسجة الحقائب الثالث والرابع البلعوم (3/4PP)، بمعزولة ميكانيكيا وانزيماتيكالي من الأجنة السمان (q) مرحلة 15 إلى 30-سميط [يوم الجنينية (ه) 1.5-E2.5]. وهذه المراحل تتوافق مع الدجاج الهامبرغر وهاميلتون4 (ح ح)-مراحل 12-17. بدأت إجراءات العزل باستخدام التربسين انزيماتيكالي ننأى الأنسجة من mesenchyme المرفقة. كان المطعمة الأنسجة المعزولة في منطقة سوماتوبليورا جنين الدجاج (ج) المضيف في E3-E3.5 (سمو-مراحل، 20-21). واعتبر هذا mesenchyme مغايرة "المتساهلة" للتنمية ظهارة الغدة الصعترية المساهمة أيضا في تشكيل الجهاز3. بعد ذلك، تسلل موجات متعاقبة من الدجاج المضيف السلف التي يحملها الدم الخلايا نظيره السمان الظهارية الغدة الصعترية الجهات المانحة المساهمة في تكوين الغدة الصعترية في الجنين المضيف3.
في الآونة الأخيرة، كما ثبت نسخة معدلة من هذا النهج مهما لدراسة التفاعلات بين الظهارية الوسيطة خلال المراحل المبكرة من تكوين الغدة الصعترية5. وفي هذا الصدد، معزولة، سواء من الأجنة المانحة والمضيفة، الأنسجة تشارك في تكوين الغدة الصعترية حمل خارج الرحم في الأجنة تشيميريك3 والمرتبطة السابقين فيفو. واستخدمت بروتوكولا محسنة لعزل الأنسجة 3/4PP السمان (E2.5-E3) وميسوديرم سوماتوبليورا الدجاج (E2.5-E3). بإيجاز، عزلت الأنسجة الجنينية الجراحة الدقيقة وتخضع الهضم بنكرياتين في المختبر. أيضا، كانت الأمثل الشروط الهضم الأنزيمي ودرجة الحرارة والوقت من الحضانة وفقا لنوع الأنسجة ومرحلة النمو (الجدول 1).
بعد ذلك، كانت المرتبطة الأنسجة المعزولة في أورجانوتيبيك في المختبر نظام ح 48، كما ذكر سابقا5،6. رابطة الأنسجة في المختبر يحاكي التفاعلات الخلوية المحلية في الجنين، التغلب على بعض القيود للتلاعب في الحية. هذا النظام مفيد بشكل خاص لدراسة التفاعلات الخلوية في أحداث morphogenic المعقدة، مثل تطوير جهاز البلعوم.
مساهمة كل الأنسجة في هيستوجينيسيس الغدة الصعترية، فضلا عن قدرة الرابطة هيتيروسبيسيفيك لتوليد الغدة الصعترية يمكن مواصلة استكشاف استخدام منهجية كام و مفصلة قبل5،،من78. إيجاز، الأنسجة المستزرعة المطعمة على كام cE8 الأجنة ويسمح بوضع في ovo لمدة 10 أيام. بعد ذلك، تم تقييم تكوين الغدة الصعترية بالتحليل المورفولوجي في explants المقطوع. كما هو الحال في الدراسات الكلاسيكية الدجاج السمان3، كان من ظهارة الغدة الصعترية السمان استعمر السلف المكونة للدم الخلايا (هبكس) المستمدة من جنين الدجاج، الذي أبدى في وقت لاحق للمساهمة في تطوير الجهاز9،10 . هبكس هاجروا من الجنين إلى الغدة الصعترية تشيميريك خارج الرحم عن طريق vascularized عالية كام5،،من78. السمان يمكن التعرف ظهارة الغدة الصعترية المشتقة من إيمونوهيستوتشيميستري استخدام الأجسام المضادة إبلاغها (أي، قكبن-ماب السمان بيرينوكلير)، التغلب على الحاجة إلى المؤشرات الخاصة بالانسجة الجزيئية.
يسمح هذا الأسلوب التجريبي، اقتراب خطوتين عنها في المنشور السابق8، تحوير مسالك التنبيه بالإدارة العادية لوكلاء الدوائية خلال في المختبر وفي التنمية ovo. أيضا، يمكن أن تحصد explants في أي وقت نقطة لمسار التجربة8.
أخيرا، البروتوكول العزلة هنا بالتفصيل يسمح الحفاظ على الخصائص الطبيعية و 3D-هندسة الأنسجة الجنينية، مفيدة بشكل خاص لتفصيل أنماط التعبير الجيني في الموقع من الأراضي الجنينية وإلا لا يمكن الوصول إليها من قبل الأساليب التقليدية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا تطبيق نهج التحليل الترنسكربيتوم، بما في ذلك تسلسل الحمض النووي الريبي أو [ميكروارس]، في الأنسجة المعزولة دون اشتراط البصمات الجينية بينما تقدم تحليلاً "اوميكس" الخاصة بالانسجة عالية إنتاجية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1279px;" width="1277">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:379px;">Chicken fertilized eggs (Gallus gallus)</td>
			<td style="width:306px;">Pintobar, Portugal</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:445px;">Poultry farm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:379px;">Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix)</td>
			<td>Interaves, Portugal</td>
			<td></td>
			<td style="width:445px;">Bird farm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">15 mL PP centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430052</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">50 mL PP centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430290</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">60 x 20 mm pyrex dishes</td>
			<td>Duran group</td>
			<td style="width:149px;">21 755 41</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">100 x 20 mm pyrex dishes</td>
			<td>Duran group</td>
			<td style="width:149px;">21 755 48</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Metal grid</td>
			<td>Goodfellows</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:445px;">fine meshed&#160; stainless steel grid</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Membrane filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td style="width:149px;">DTTP01300</td>
			<td style="width:445px;">0.6 mm Isopore membrane filter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Petri dish, 35 x 10 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:149px;">P5112&#160;</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">60 x 30 mm pyrex bowls (Small size)</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:445px;">from supermarket&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">100 x 50 mm pyrex bowls (Large size)</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:445px;">from supermarket&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Transfer pipettes</td>
			<td>Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2041S</td>
			<td style="width:445px;">2 mL plastic pipet</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Glass pasteur pipette</td>
			<td>Normax</td>
			<td style="width:149px;">5426015</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Clear plastic tape</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:445px;">from supermarket&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:379px;">Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5</td>
			<td>BMA Biomedicals</td>
			<td>T-1302</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td style="width:445px;">Standart FBS</td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:379px;">Pancreatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-3292</td>
			<td style="width:445px;">Prepare a 25 mg/mL solution according to manufacturer&#39;s instructions; centrifuge and filter prior to aliquote and store at -20&#186;C. Aliquots can be kept frozen for several years.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>GIBCO, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">QCPN antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>QCPN</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement&#160;</td>
			<td>GIBCO, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>61870010</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit</td>
			<td>ELKEM/Silmid</td>
			<td>RH141001KG</td>
			<td style="width:445px;">To prepare the back base for petri dish</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">11251-30&#160;</td>
			<td style="width:445px;">Thin forceps</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Extra fine Bonn scissors, curved</td>
			<td style="width:306px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">14085-08</td>
			<td style="width:445px;">Curved scissors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Insect pins&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">26001-30</td>
			<td style="width:445px;">0.3 mm Stainless steel pin</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Micro spatula&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">10087-12</td>
			<td style="width:445px;">Transplantation spoon</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Minutien Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">26002-20</td>
			<td style="width:445px;">0.2 mm Stainless steel microscalpel</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Minutien Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">26002-10</td>
			<td style="width:445px;">0.1 mm Stainless steel microscalpel</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Moria Nickel Plated Pin Holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">26016-12</td>
			<td style="width:445px;">Nickel plated pin holder</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Moria Perforated Spoon</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">10370-17</td>
			<td style="width:445px;">Skimmer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Wecker Eye Scissor</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">15010-11</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Camera</td>
			<td>Leica Microsystems&#160;</td>
			<td style="width:149px;">MC170 HD</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems&#160;</td>
			<td style="width:149px;">DM2500</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">NanoZoomer&#160;S360 Digital&#160;slide scanner&#160;</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:149px;">C13220-01</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Stereoscope</td>
			<td>Leica Microsystems&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Leica M80</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of embryonic tissues and formation of quail-chicken chimeric organs using the thymus example

وكان القدرة على عزل الأنسجة الجنينية خطوة أساسية لإقامة نظام الوهم الدجاج السمان، الذي بدوره قد قدمت مساهمات بلا منازع لإزاحة الستار عن العمليات الرئيسية في علم الأحياء التنموي.
وهنا يتم وصف أسلوب أمثل لعزل الأنسجة الجنينية من السمان والدجاج بالجراحة والهضم الأنزيمي مع الحفاظ على خصائصه البيولوجية. بعد عزلة، ترتبط الإنزيم أورجانوتيبيك في المختبر ل h. 48 السمان الأنسجة من كل الأنواع ويمكن التمييز بميزات النووية متميزة والمؤشرات الجزيئية التي تتيح دراسة الحديث عبر الهاتف الخلوي بين أنسجة الدجاج رابطة هيتيروسبيسيفيك للأنسجة. هذا النهج، لذلك، أداة مفيدة لدراسة تفاعلات الأنسجة المعقدة في العمليات الإنمائية مع التعديلات المكانية ديناميكية للغاية، مثل تلك التي تحدث أثناء morphogenesis البلعوم وتشكيل المعي أجهزة المستمدة من الأنسجة. ووضع هذا النهج التجريبي الأولى لدراسة التفاعلات الظهارية الوسيطة خلال المراحل المبكرة من تكوين الغدة الصعترية. في هذا الصدد، بداية الغدة الصعترية المحتملين المستمدة من الأنسجة والمستمدة من ميسوديرم ميسينتشيمي، تم عزل من الأجنة السمان والدجاج، على التوالي.
يمكن اختبار قدرة الأنسجة المرتبطة بها لإنشاء الأجهزة كذلك بتطعيم لهم على الغشاء تشوريوالانتويك (كام) جنين الدجاج. كام توفر المواد الغذائية، ويتيح تبادل الغاز للأنسجة اكسبلانتيد. بعد 10 أيام في التنمية ovo، يمكن تحليل أجهزة تشيميريك في اكسبلانتس المقطوع بالطرق المورفولوجية التقليدية. يسمح هذا الإجراء أيضا دراسة المساهمات الخاصة بالانسجة أثناء تكوين الجهاز، ومن تطورها الأولى (التنمية في المختبر) إلى المراحل النهائية من أورجانوجينيسيس (في التنمية ovo).
أخيرا، توفر طريقة تحسين العزل أيضا ثريديمينسيونالي (3D) الحفاظ على الأنسجة الجنينية، التي يمكن أن تستخدم أيضا لتحليل الطوبوغرافية عالية الاستبانة لأنماط التعبير الجيني الأنسجة على حدة.

تفاصيل البروتوكول وسيلة لعزل الطيور الأنسجة الجنينية لاستخدامها في العديد من النهج التقني البيولوجيا الخلوية والإنمائية. هذا الأسلوب كان يعمل سابقا في دراسة التفاعلات الظهارية الوسيطة خلال المراحل المبكرة من تكوين الغدة الصعترية5. وهنا، تظهر نتائج جديدة ?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Embryonic Tissues and Formation of Quail-Chicken Chimeric Organs Using The Thymus Example at JoVE.com

Isolation of Embryonic Tissues and Formation of Quail-Chicken Chimeric Organs Using The Thymus Example

توفر هذه المقالة طريقة لعزل نقية الأنسجة الجنينية من أجنة السمان والدجاج التي يمكن دمجها إلى النموذج السابقين فيفو تشيميريك الأجهزة.

عزل الأنسجة الجنينية وتشكيل أجهزة تشيميريك السمان-الدجاج باستخدام المثال الغدة الصعترية

The capacity to isolate embryonic tissues was an essential step for establishing the quail-chicken chimera system, which in turn has provided undisputed ...

الهدف العام لهذا الإجراء هو تقديم نهج تجريبي أفضل لعزل الأنسجة الجنينية من السمان وأجنة الدجاج. مع هذه التقنية، نحصل على الأنسجة الجنينية النقية التي يمكن استخدامها في دراسات التعبير الجيني والتشايس الوظيفي. يتم عزل الأنسجة من السمان وأجنة الدجاج عن طريق الجراحة الدقيقة وتخضع لعملية الهضم الانزيمية في المختبر مع الحفاظ على خصائصها البيولوجية.بعد العزل، يمكن استخدام الأنسجة المحفوظة ثلاثية الأبعاد لتحليل أنماط التعبير الجيني الطبوغرافي عالية الدقة. وهذا النهج مفيد بصفة خاصة في تفصيل التعبير الجيني في الموقع في الأراضي الجنينية، وإلا فإن الطرق التقليدية لا يمكن الوصول إليها. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا تطبيق نُهج تحليل النسخ في الأنسجة المعزولة دون الحاجة إلى علامات جينية، مع توفير تحليل عام عالي الإنتاجية خاص بالنسج.بدلا من ذلك، يمكن أن ترتبط الأنسجة المعزولة من كلا النوعين في فحص organotypic في المختبر لمدة 48 ساعة. ويسمح هذا النهج بدراسة تفاعلات الأنسجة، حيث يمكن التمييز بين خلايا السمان والدجاج من خلال ميزات نووية مميزة وعلامات جزيئية. القدرة من الثقافة الأنسجة لتشكيل أعضاء يمكن اختبارها كذلك من قبل في اختبار ovo.ولذلك فإن هذه الطريقة هي أداة مفيدة لدراسة تفاعلات الأنسجة المعقدة في العمليات التنموية مع تعديلات ديناميكية للغاية يمكن أن تساعد أيضًا على الكشف عن إمكانات مناطق جنينية محددة لتشكيل الأعضاء. كمثال، في هذه الوثيقة يوصف تشكيل السمان-الدجاج thymus chimeric من الأنسجة الجنينية المعزولة. أولا ، إندديرم من الحقائب البلعوم الثالث والرابع ، يتم عزل rudiment الزعتر المحتملين من المنطقة البلعوم من أجنة السمان مع ثلاثة أيام من التطور.ثم, ويرتبط هذا النسيج مع mesenchyme قادرة على دعم تطورها, وssoderm somatopleura. وأخيرا، يتم استزراع الرابطة غير المحددة للأنسجة في المختبر وفي الأوفو لتشكيل الغدة الصعترية الشيمية. تنفيذ جميع إجراءات التلاعب البيض في ظروف معقمة باستخدام غطاء تدفق الفارني الأفقي والأجهزة والمواد المعقمة.تم احتضان بيض السمان المخصب مع غرفة الهواء التي تواجه ما يصل. للبدء، وإزالة بيض السمان من الحاضنة. إعداد وعاء زجاجي بوروسيليكات كبيرة مليئة PBS الباردة.مع مقص منحني، اضغط وقطع حفرة دائرية في قذيفة من بيضة السمان مع ثلاثة أيام من الحضانة. جعل ثقب في الجانب الآخر من البيضة حادة، ونقل صفار إلى وعاء مع برنامج تلفزيوني الباردة. إزالة الجنين من صفار عن طريق قطع غشاء vitelline خارجيا إلى الأوعية خارج المقصف.مع مساعدة من ملقط رقيقة، ونقل الجنين إلى وعاء صغير مملوءة PBS الباردة، ثم نقل الجنين إلى طبق بيتري مع قاعدة سوداء مع مقشطة. إزالة المنطقة البلعوم تحتوي على الحقائب البلعوم الثالث والرابع كما هو موضح في السابق Jove SPA الربط. ثم، نقل المنطقة الثالثة والرابعة قوس البلعوم إلى كوب مليء البنكرياس الباردة واحتضان لمدة ساعة واحدة، على الجليد، للهضم الأنزيمي.لاحظ أن فترة حضانة الهضم الأنزيمي تعتمد على مرحلة التطور. ضع الطبق الزجاجي تحت المجهر الاستريو وعزل الـ endoderm عن المنطقة الثالثة والرابعة قوس البلعوم، باستخدام اثنين من مشرط صغير في حامل. المقام الأول في المنطقة البلعوم مع الجانب الظهري، وتبين داخليا اعمد و ectoderm في السطح الخارجي.مراقبة ectoderm، إندودم، mesenchyme، أنبوب القلب، والجزء البطني من الأنبوب العصبي. إزالة الأنبوب العصبي وميسدرم تعلق على سطح الظهرية من endoderm البلعوم. مراقبة endoderm من البلعوم، والحقائب البلعوم الرابع والثالث، وأنبوب القلب.مع الجانب الظهري، قم بفصل وإزالة mesenchyme بين الأقواس البلعوم وفضح الحقائب البلعوم. تنفيذ هذا الإجراء في الجانب الآخر من المنطقة البلعوم. إزالة mesenchyme تعلق على الجزء الخلفي من معظم endoderm ومراقبة الحقيبة البلعوم الرابع.مع الجانب الخلفي حتى، لاحظ كل من الحقائب البلعوم الرابع الأيسر والأيني. الاستمرار عن طريق إزالة mesenchyme تعلق على الجزء الخلفي معظم endoderm والحقيبة الثانية. إزالة أنبوب القلب وmesenchyme المحيطة الحقائب الداخلية.مع الجانب البطني، ومراقبة endoderm البلعوم، والجانب الأيمن من قوس البلعوم الثاني. في هذه المرحلة ، يجب أن يكون endoderm من بدين الغدة الدرقية مرئية. فصل ectoderm من الأقواس البلعوم الثاني والثالث وإزالة بعناية mesenchyme من الأقواس.مراقبة إزالة mesenchyme من قوس البلعوم الثاني على الجانب الأيمن. لاحظ موقع الحقائب الرابعة والثالثة وروادية الغدة الدرقية. إزالة بقايا إلى الخلايا المينزية تعلق على الحقائب البلعوم.مراقبة الحقائب الثالثة والرابعة من الجانب الأيمن والحقيبة الرابعة من الجانب الأيسر. كرر مفرزة mesenchyme من الجانب الأيسر. لاحظ الآن الحقيبة الثالثة من الجانب الأيسر.مراقبة مفرزة mesenchyme من القوس الثاني على الجانب الأيسر. لاحظ أنه يجب أن تبقى جميع الأسطح والحلول باردة أثناء هذا الإجراء. تغيير إلى محلول جديد البنكرياس الباردة وطبق في حالة من أخذ وقتا طويلا لتشريح الأنسجة.وأخيرا، جعل قطع عرضية بين الحقائب البلعوم الثاني والثالث لإزالة الحقائب الثانية وrudidiment الغدة الدرقية. عند هذه النقطة، وsoderm معزولة يتكون من الحقائب البلعوم الثالث والرابع والتلميح الخلفي من البلعوم. إزالة ما تبقى mesenchyme منفصلة بمساعدة اثنين من مشرط الصغرى.نقل إندديرم معزولة إلى طبق زجاجي مملوءة مصل البقر الجنين الباردة والاحتفاظ بها على الجليد أثناء إعداد مقايسة في المختبر. وضعت البيض في وضع أفقي والجانب العلوي ملحوظ لاستخدام الفحم. للبدء، إزالة البيض من الحاضنة.مع مقص منحني، وفتح ثقب صغير في قذيفة، وإدراج إبرة، وpirerate اثنين من milliliters من الألبومين مع حقنة 10 ملليلتر. افتح ثقباً دائرياً في المنطقة المميزة للقذيفة وقطع غشاء الفيتيلين خارجياً إلى الأوعية الجنينية الإضافية أثناء حمل الجنين مع ملقط رقيقة. تحت مجهر ستيريو، ضع الجنين في طبق بيتري مع قاعدة سوداء تحتوي على PBS الباردة.استخدم أربعة دبابيس حشرة للاحتفاظ بالجنين إلى أسفل الطبق. ضع الدبابيس في المنطقة الخارجية التي تشكل شكل مربع. إجراء شقين بين النيمت 19 و 24 عرضية إلى محور الجنين وعبور الجنين.حرر هذا القسم عن طريق قطع الحواف الجنينية الهامشية. مراقبة لوحة الجانبي، أنبوب عصبي، و somites. التعرق ونقل الأنسجة إلى طبق زجاجي مملوءة البنكرياس الباردة.احتضان لمدة 30 دقيقة على الجليد للهضم الأنزيمي. تحت المجهر ستيريو، عزل mesoderm من الأنسجة المحيطة بها باستخدام اثنين من مشرط الصغرى في أصحاب. مراقبة ميسودرم somatopleura، وssopleura، أنبوب عصبي، و ectoderm.أولا، إزالة ectoderm على السطح. مراقبة سوماتوبلوورا ميسوديرم من انفصالها عن ectoderm. ثم، فصل بعناية في بنترالي تقع 1000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000مراقبة ميسوديرم الجانبي الأيمن من سوماتوبلوورا. حرره عن طريق قطعه في حركة موازية للأنبوب العصبي. لاحظ أنه يجب أن تبقى جميع الأسطح والحلول باردة أثناء هذا الإجراء.تغيير إلى محلول جديد البنكرياس الباردة وطبق في حالة من أخذ وقتا طويلا لتشريح الأنسجة. مراقبة ميسوديرم الجانبي الأيسر من somatopleura، somites، الأنبوب العصبي، و ectoderm. كرر الافراج عن mesoderm من هذا الجانب.جعل الحركات البطيئة مع مشرط الصغرى. البروتينات مصفوفة خارج الخلية المكشوفة الجلوس من خلال الأنسجة والأدوات، ومنع حركات السوائل. قطع بعناية somatopleura في حركة موازية للأنبوب العصبي.نقل mesoderm معزولة إلى طبق زجاجي مملوءة مصل البقر الجنين الباردة والاحتفاظ بها على الجليد أثناء إعداد في المختبر. ضع صرًا معدنيًا ناعمًا في طبق بيتري وملأه بوسيلة الثقافة. إزالة السوائل المفرطة لمستوى السطح المتوسط مع الجزء العلوي من صر.مع مساعدة من ملقط رقيقة، تراجع مرشح غشاء في وسط الثقافة ووضعها بعناية على الجزء العلوي من صر أن يكون سطح في اتصال معها. تحت المجهر ستيريو، نقل الإنددير المعزول من الطبق الزجاجي إلى مرشح الغشاء عن طريق الانزلاق لطيف مع مساعدة من ملعقة ملقط رقيقة. كرر هذا الإجراء للميسوديرم المعزول.مع مساعدة من مشرط صغير، مزيج الأنسجة لتحقيق أقصى قدر من انها جمعية. ضع الأنسجة المرتبطة بعناية في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 ساعة. بعد فترة الحضانة، الكسب غير المشروع الأنسجة الثقافة على غشاء نوع كوريولان والسماح لها لتطوير في البيضاوي لمدة 10 أيام أخرى لاستكمال تشكيل الجهاز كما وصف سابقا.هنا هو الأسلوب الخلوي الذي يسمح لعزل أنسجة جنينية الطيور لاستخدامها في نهج تجريبية متميزة. وكمثال على ذلك، تم تقييم التعبير عن الجينات المعروفة بالمشاركة في تكوين الحقائب البلعومية أيضاً في إندودم معزول يحتوي على الحقائب البلعومية الثانية والثالثة والرابعة من أجنة الدجاج في اليوم الجنيني ثلاثة ونصف عن طريق التركيب الكامل في التهجين. تم الكشف عن التعبير عن القنفذ سونيك في endoderm من البلعوم المركزي واستبعد من الحقائب، في حين تم التعبير عن BMP7 في endoderm من الحقائب البلعوم الثاني والثالث واستبعد من البلعوم المركزي والحقيبة البلعوم الرابع.يمكن أن تكون الأنسجة المعزولة أيضا في المختبر المرتبطة على وجه التحديد في المختبر لمدة 48 ساعة، والكسب غير المشروع على غشاء نوع كوريولان، ويسمح لتطوير لأيام أخرى 10. يمكن تحليل Explants بواسطة علم الأنسجة التقليدي والكيمياء المناعية. بعض النتائج التمثيلية لرابطة السمان endoderm من الحقائب البلعوم الثالث والرابع مع الدجاج somatopleura mesoderm هي التالية-Grafts أظهرت الغدة الصعترية الشيمية شكلت بالكامل مع السمان المشتقة الخلايا الظهارية الغدية إيجابية ل QCPN والخلايا اللمفاوية الدجاج.بالإضافة إلى ذلك، أظهرت السيتوكيراتين ظهارة الزعتر الإيجابية ميزات مورفولوجية طبيعية، وعرض بنية شبكة نموذجية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد كيفية عزل أنسجة السمان والدجاج الجنينية التي يمكن استخدامها في دراسات التعبير الجيني وعن طريق تشكيل أعضاء تشيميرك يمكن أن تساعد أيضا في فك تعقيد علم الوراثة الجهاز.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome على من التنميط<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; إنتاج الأبقار الأجنة قبل الزرع عن طريق اللونين ميكروأري منصة

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

تنظيم جينية من القلب تمايز الخلايا الجذعية الجنينية والأنسجة

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues

العزلة وتمايز الخلايا الجذعية الدهنية المشتقة من الخنزير تحت الجلد الدهنية الأنسجة

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

عزل خلايا الفئران الجنينية مكون للدم غشائي

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

ثقافة الفئران الجنينية الأمشاط: نموذج الفسيولوجي من غضروفي التعظم

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

بروتوكولات لتصور الستيرويدي المنشأ أجهزة وهيئات التفاعلية مع المناعية في ذبابة الفاكهة<em&gt; ذبابة الفاكهة</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

استخدام في فيفو والأنسجة والخلايا Explant نهج لدراسة Morphogenesis وأمراض الشريان الاورطي الجنينية والولادة

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic ...

Two-step Approach to Explore Early- and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm

نهج خطوتين لاستكشاف ومتأخرة-المراحل الأولى من تشكيل الهيئة في نموذج إنفلونزا الطيور: الغدة الصعترية ونموذج Organogenesis الغدد الجار درقية

The avian embryo, as an experimental model, has been of utmost importance for seminal discoveries in developmental biology. Among several approaches, the ...

Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

الثقافات أورجانوتيبيك ثلاثي الأبعاد للأجهزة الحسية السمعية والدهليزيه

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...

A Familial Hypercholesterolemia Human Liver Chimeric Mouse Model Using Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocytes

طراز ماوس تشيميريك كبد البشري الكوليستيرول أسرية باستخدام خلايا الكبد المستمدة من الخلايا الجذعية المستحثة Pluripotent

Familial hypercholesterolemia (FH) is mostly caused by low-density lipoprotein receptor (LDLR) mutations and results in an increased risk of early-onset ...