Name: isolation of embryonic tissues and formation of quail-chicken chimeric organs using the thymus example
Uploaded: 2019-02-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Embryonic Tissues and Formation of Quail-Chicken Chimeric Organs Using The Thymus Example at JoVE.com

提交人感谢 isabel alcobia 对手稿的批判性阅读, 感谢对 mário henriques 进行录像的阅读, 并感谢来自 desenvolvimento、medicina de lisboa 组织学处的 vitor proa,里斯本大学, 技术支持。我们特别感谢来自视听单位、里斯本医学研究委员会、里斯本大学的 Faculdade 和 hugo silva 对制作这段视频的杰出承诺。我们感谢 leica 微系统善意地提供配备了视频系统的立体镜和 interaves-sociedade agro-pecuária, s. a 为鹌鹑受精卵做出贡献。这项工作得到了 lisboa 大学 medicina de faculdade de lisboa 的支持。

所有这些实验都遵循了 lisboa medicina de medicina académico 中心的动物护理和伦理准则。
1. 施肥鹌鹑和鸡蛋孵育
<ol><li>将日本鹌鹑的受精卵放入38°c 的加湿孵化器中3天。将鸡蛋 (鸡蛋钝器端) 面朝上在气室中孵育。 注: 加湿环境是通过在孵化器底部放置一个水容器来实现的。</li>
	<li>将鸡受精卵 (gallus gallus) 在38°c 加湿孵化器中孵育2.5天。将鸡蛋孵育在水平位置, 并...

<ol>
	<li>Le Douarin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nogent+Institute--50+years+of+embryology.">The Nogent Institute--50 years of embryology.</a> The International Journal of Developmental Biology. 49 (2-3), 85-103 (2005).</li><li>Le Douarin, N. M., Teillet, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+migration+of+neural+crest+cells+to+the+wall+of+the+digestive+tract+in+avian+embryo.">The migration of neural crest cells to the wall of the digestive tract in avian embryo.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 30 (1), 31-48 (1973).</li><li>Le Douarin, N. M., Jotereau, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+of+cells+of+the+avian+thymus+through+embryonic+life+in+interspecific+chimeras.">Tracing of cells of the avian thymus through embryonic life in interspecific chimeras.</a> Journal of Experimental Medicine. 142 (1), 17-40 (1975).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.+1951.">A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951.</a> Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).</li><li>Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Bmp4+signalling+in+the+epithelial-mesenchymal+interactions+that+take+place+in+early+thymus+and+parathyroid+development+in+avian+embryos.">Modulation of Bmp4 signalling in the epithelial-mesenchymal interactions that take place in early thymus and parathyroid development in avian embryos.</a> Developmental Biology. 361 (2), 208-219 (2012).</li><li>Takahashi, Y., Bontoux, M., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelio--mesenchymal+interactions+are+critical+for+Quox+7+expression+and+membrane+bone+differentiation+in+the+neural+crest+derived+mandibular+mesenchyme.">Epithelio--mesenchymal interactions are critical for Quox 7 expression and membrane bone differentiation in the neural crest derived mandibular mesenchyme.</a> Embo Journal. 10 (9), 2387-2393 (1991).</li><li>Figueiredo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+and+Hedgehog+in+the+thymus/parathyroid+common+primordium:+Crosstalk+in+organ+formation.">Notch and Hedgehog in the thymus/parathyroid common primordium: Crosstalk in organ formation.</a> Developmental Biology. 418 (2), 268-282 (2016).</li><li>Figueiredo, M., Neves, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+Approach+to+Explore+Early-and+Late-stages+of+Organ+Formation+in+the+Avian+Model:+The+Thymus+and+Parathyroid+Glands+Organogenesis+Paradigm+Video+Link.">Two-step Approach to Explore Early-and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm Video Link.</a> Journal of Visualuzed Experiments. , (2018).</li><li>Nehls, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+genetically+separable+steps+in+the+differentiation+of+thymic+epithelium.">Two genetically separable steps in the differentiation of thymic epithelium.</a> Science (New York, N.Y.). 272 (5263), 886-889 (1996).</li><li>Morahan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nu+gene+acts+cell-autonomously+and+is+required+for+differentiation+of+thymic+epithelial+progenitors.">The nu gene acts cell-autonomously and is required for differentiation of thymic epithelial progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (12), 5742-5746 (1996).</li><li>Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DiGeorge+syndrome+phenotype+in+mice+mutant+for+the+T-box+gene,+Tbx1.">DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1.</a> Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).</li><li>Nie, X., Brown, C. B., Wang, Q., Jiao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+Bmp4+from+the+Tbx1+expression+domain+causes+abnormal+pharyngeal+arch+artery+and+cardiac+outflow+tract+remodeling.">Inactivation of Bmp4 from the Tbx1 expression domain causes abnormal pharyngeal arch artery and cardiac outflow tract remodeling.</a> Cells Tissues Organs. 193 (6), 393-403 (2011).</li><li>Zou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+of+the+third+pharyngeal+pouch+into+thymus/parathyroid+by+Six+and+Eya1.">Patterning of the third pharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1.</a> Developmental Biology. 293 (2), 499-513 (2006).</li><li>Davey, M. G., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chicken+as+a+model+for+embryonic+development.">The chicken as a model for embryonic development.</a> Cytogenetic and Genome Research. 117 (1-4), 231-239 (2007).</li><li>Nowak-sliwinska, P., Segura, T., Iruela-arispe, M. L., Angeles, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chicken+chorioallantoic+membrane+model+in+biology,+medicine+and+bioengineering.">The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering.</a> Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).</li><li>Uematsu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+in+ovo+chorioallantoic+membrane+engraftment+to+culture+testes+from+neonatal+mice.">Use of in ovo chorioallantoic membrane engraftment to culture testes from neonatal mice.</a> Comparative Medicine. 64 (4), 264-269 (2014).</li><li>Martyn, I., Kanno, T. Y., Ruzo, A., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+a+human+organizer+by+combined+Wnt+and+Nodal+signaling.">Self-organization of a human organizer by combined Wnt and Nodal signaling.</a> Nature. 558 (7708), 132-135 (2018).</li></ol>

本文详细介绍的胚胎组织分离程序从以前的技术进行了改进, 在不同的生物环境中产生了鸡嵌状胚胎 3,5,6。
这种方法适用于分离纯胚胎组织, 而不需要基因操作或使用组织特异性标记, 这些标记往往是未定的, 限制了转基因动物模型的使用。它可用于研究上皮-间充质相互作用在发展过程中, 与分离纯组织的?...

20世纪70年代初, le douarin 开发了一个优雅的鹌尾鸡嵌合体系统, 为了解细胞迁移和细胞相互作用在发育过程中的作用开辟了新的途径 1,2。该模型是在两个物种之间的细胞交换不会明显干扰胚胎发育的前提下设计的, 后来在用于研究包括神经和造血在内的许多发育过程时得到了证实系统1。以后者为例, 首次利用鸡嵌合体系统3观察到了造血祖细胞对胸腺上皮雏形进行殖民的循环波.为此, 胸腺的预期区域, 即第三和第四咽袋 () 的内胚层, 在15至 30-sy像中阶段从鹌鹑 (q) 胚胎中进行了机械和酶分离 [胚胎日 (e) 1.5-e2.5]。这些阶段对应于鸡汉堡包和 hamilton4 (hh)-阶段12-17。隔离程序从使用胰蛋白酶开始, 将内皮从附着的中生酶中分离。分离的内皮在 e3-e3.5 (hh 级 20-21) 被移植到宿主鸡 (c) 胚胎的体细胞区域。这种异源间质被认为是胸腺上皮发育的 "允许", 也有助于器官的形成 3.随后, 鸡寄主血液传播祖细胞的连续波浸润到鹌鹑供体胸腺上皮对应体,有助于宿主胚胎3的胸腺形成。
最近, 这种方法的改进版本也被证明是重要的研究上皮-间充质相互作用的早期阶段胸腺 5.在这方面, 参与嵌合胚胎3中异位胸腺形成的组织从供体胚胎和宿主胚胎中分离, 并在体内相关。采用改进的方案分离了鹌鹑 (e2.5-e3) 和鸡生长激素中胚层 (e2.5-e3)。简单地说, 胚胎组织通过显微手术分离, 并进行体外胰腺素消化。并根据组织类型和发育阶段优化了酶消化条件、培养温度和培养时间 (表 1)。
其次, 分离的组织在一个组织型的体外系统中联系 48小时, 如先前报道的 5,6。组织的体外关联模仿胚胎中的局部细胞相互作用, 克服了体内操作的一些限制。该系统对于研究复杂形态发生事件中的细胞相互作用特别有用, 例如咽部设备的开发。
可以使用 cam 方法 (以前详细的5,7, 8)进一步探讨每个组织在胸腺组织发生中的作用, 以及异种协会产生胸腺的能力。简单地将培养的组织嫁接到 ce8 胚胎的 cam 中, 并允许在体内发育10天。然后, 通过对采集的外植体进行形态学分析, 评价胸腺的形成。与经典的鹌鹑研究3一样, 鹌鹑胸腺上皮被来自鸡胚胎的造血祖细胞 (hpc) 殖民, 后来被证明有助于器官发育9,10.hpc 通过高度血管化的 cam 5、7、8从胚胎迁移到异位嵌合胸腺。鹌鹑源性胸腺上皮可以通过免疫组织化学使用物种特异性抗体 (即 qcpn-mab 鹌鹑环核) 进行鉴定, 克服了对组织特异性分子标记的需求。
这种实验方法, 正如在以前的出版物8中报告的两步方法, 允许调节信号通路通过定期给药剂在体外和奥沃发展。此外, 外植体可以在实验过程的任何时间点收获 8.
最后, 这里详细的隔离协议允许保存胚胎组织的自然特性和三维结构, 特别是用于详细说明胚胎领土的原位基因表达模式, 否则无法进入常规方法。此外, 转录组分析方法, 包括 rna-seq 或微阵列, 也可以应用于孤立的组织, 而不需要遗传标记, 同时提供组织特异性高通量 "组学" 分析。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1279px;" width="1277">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:379px;">Chicken fertilized eggs (Gallus gallus)</td>
			<td style="width:306px;">Pintobar, Portugal</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:445px;">Poultry farm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:379px;">Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix)</td>
			<td>Interaves, Portugal</td>
			<td></td>
			<td style="width:445px;">Bird farm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">15 mL PP centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430052</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">50 mL PP centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430290</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">60 x 20 mm pyrex dishes</td>
			<td>Duran group</td>
			<td style="width:149px;">21 755 41</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">100 x 20 mm pyrex dishes</td>
			<td>Duran group</td>
			<td style="width:149px;">21 755 48</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Metal grid</td>
			<td>Goodfellows</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:445px;">fine meshed&#160; stainless steel grid</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Membrane filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td style="width:149px;">DTTP01300</td>
			<td style="width:445px;">0.6 mm Isopore membrane filter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Petri dish, 35 x 10 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:149px;">P5112&#160;</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">60 x 30 mm pyrex bowls (Small size)</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:445px;">from supermarket&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">100 x 50 mm pyrex bowls (Large size)</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:445px;">from supermarket&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Transfer pipettes</td>
			<td>Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2041S</td>
			<td style="width:445px;">2 mL plastic pipet</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Glass pasteur pipette</td>
			<td>Normax</td>
			<td style="width:149px;">5426015</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Clear plastic tape</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:445px;">from supermarket&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:379px;">Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5</td>
			<td>BMA Biomedicals</td>
			<td>T-1302</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td style="width:445px;">Standart FBS</td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:379px;">Pancreatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-3292</td>
			<td style="width:445px;">Prepare a 25 mg/mL solution according to manufacturer&#39;s instructions; centrifuge and filter prior to aliquote and store at -20&#186;C. Aliquots can be kept frozen for several years.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>GIBCO, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">QCPN antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>QCPN</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement&#160;</td>
			<td>GIBCO, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>61870010</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit</td>
			<td>ELKEM/Silmid</td>
			<td>RH141001KG</td>
			<td style="width:445px;">To prepare the back base for petri dish</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">11251-30&#160;</td>
			<td style="width:445px;">Thin forceps</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Extra fine Bonn scissors, curved</td>
			<td style="width:306px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">14085-08</td>
			<td style="width:445px;">Curved scissors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Insect pins&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">26001-30</td>
			<td style="width:445px;">0.3 mm Stainless steel pin</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Micro spatula&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">10087-12</td>
			<td style="width:445px;">Transplantation spoon</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Minutien Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">26002-20</td>
			<td style="width:445px;">0.2 mm Stainless steel microscalpel</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Minutien Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">26002-10</td>
			<td style="width:445px;">0.1 mm Stainless steel microscalpel</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Moria Nickel Plated Pin Holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">26016-12</td>
			<td style="width:445px;">Nickel plated pin holder</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Moria Perforated Spoon</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">10370-17</td>
			<td style="width:445px;">Skimmer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Wecker Eye Scissor</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">15010-11</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Camera</td>
			<td>Leica Microsystems&#160;</td>
			<td style="width:149px;">MC170 HD</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems&#160;</td>
			<td style="width:149px;">DM2500</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">NanoZoomer&#160;S360 Digital&#160;slide scanner&#160;</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:149px;">C13220-01</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Stereoscope</td>
			<td>Leica Microsystems&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Leica M80</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of embryonic tissues and formation of quail-chicken chimeric organs using the thymus example

分离胚胎组织的能力是建立鸡嵌合体系统的一个重要步骤, 而这又为揭示发育生物学的关键过程提供了无可争辩的贡献。
本文介绍了一种通过显微手术和酶消化从鹌鹑和鸡中分离胚胎组织的优化方法, 同时保持其生物学特性。隔离后, 这两个物种的组织在48小时的体外组织型分析中联系在一起. 鹌鹑和鸡组织可以通过不同的核特征和分子标记来区分, 从而研究细胞间的交叉对话。组织的异种关联。因此, 这种方法是研究具有高度动态空间修饰的发育过程中复杂组织相互作用的有用工具, 例如在咽部形态发生和前肢形成过程中发生的过程内皮衍生器官。本实验方法首次用于研究胸腺形成早期上皮-间充质的相互作用。本文分别从鹌鹑和鸡胚胎中分离出内皮源性的远景胸腺原体和中胚层源性间质。
相关组织产生器官的能力可以通过将它们移植到鸡胚胎的绒毛膜 (cam) 来进一步测试。cam 提供营养, 并允许气体交换到被解释的组织。在奥沃发育10天后, 用常规形态学方法对采集的外植体中的嵌合器官进行分析。这一过程还允许研究器官形成过程中组织特有的贡献, 从其最初的发育 (体外发育) 到器官发生的最后阶段 (在奥沃发育中)。
最后, 改进后的分离方法还提供了三维保存的胚胎组织, 也可用于组织特异性基因表达模式的高分辨率地形分析。

该协议详细介绍了一种分离鸟类胚胎组织的方法, 用于几种细胞和发育生物学技术方法。该方法以前用于研究胸腺形成早期的上皮-间充质相互作用5。这里, 新的结果显示在图 1和图 2中, 使用类似的方法。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58965/58965fig1.jpg">...

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Isolation of Embryonic Tissues and Formation of Quail-Chicken Chimeric Organs Using The Thymus Example

本文提供了一种从鹌鹑和鸡胚胎中分离出可结合形成体外嵌合器官的纯胚胎组织的方法。

胸腺标本分离和鸡刺激器官的形成

The capacity to isolate embryonic tissues was an essential step for establishing the quail-chicken chimera system, which in turn has provided undisputed ...

该程序的总体目标是提出一种优化的实验方法，将胚胎组织从鹅胚胎和鸡胚胎中分离。通过这项技术，我们获得了可用于基因表达研究和功能测定的纯胚胎组织。来自鹅和鸡胚胎的组织通过显微外科分离，在保持其生物特性的同时接受体外内酶消化。分离后，三维保存的组织可用于高分辨率地形基因表达模式分析。这种方法对于详细描述胚胎区域的原位基因表达特别有用，否则传统方法无法进入。此外，转录组分析方法也可以应用于孤立的组织中，无需遗传标记，同时提供组织特定的高通量 omic 分析。或者，两个物种的分离组织可以在体外器官测定中相关48小时。这种方法允许研究组织相互作用，因为鹅和鸡细胞可以被不同的核特征和分子标记区分。培养组织形成器官的能力可以通过奥沃测定进一步测试。因此，这种方法是研究发育过程中复杂的组织相互作用和高度动态空间变化的有用工具，也有助于揭示特定胚胎区对器官形成的潜力。例如，本文描述了从孤立的胚胎组织中形成鸡-鸡嵌合胸腺。首先，第三和第四咽袋的内皮，潜在的胸腺基质被分离出的咽部区域，经过三天的发育。然后，这个组织与能够支持其发育的间膜有关，即索马托普勒拉中皮。最后，组织异质特异性关联在体外和 ovo 中培养，形成嵌合胸腺。使用水平层流罩和消毒仪器和材料，在无菌条件下执行所有鸡蛋操作程序。受精卵孵化，空气室朝上。首先，从孵化器中取出鹅卵。准备一个大的硅酸盐玻璃碗，里面装满了冷 PBS。用弯曲的剪刀，用三天的孵化时间，在鸡蛋壳上敲击并切开一个圆形孔。使鸡蛋对面的孔变钝，用冷 PBS 将蛋黄转移到碗中。通过将葡萄球蛋白膜外部切割到外质血管，将胚蛋黄取出胚胎。在薄钳的帮助下，将胚胎转移到一个装满冷PBS的小碗中，然后将胚胎移动到带黑色底座的培养皿中。删除包含第三和第四咽袋的咽部区域，如以前的 Jove SPA 结扎中所述。然后，将第三和第四咽拱区域转移到装满冷胰腺素的玻璃杯中，在冰上孵育一小时，进行酶消化。请注意，酶消化的潜伏期取决于发展阶段。将玻璃盘放在立体显微镜下，使用支架中的两个微刀将内皮从第三和第四咽拱区域隔离。首先将咽带区域与后侧向上，在外部表面的内部显示内皮和外皮。观察神经管的外皮、内皮、间膜、心管和心室部分。取出附着在咽内膜的后面的神经管和中皮。观察咽部、第四和第三咽袋以及心管的内皮。与后侧向上，小心分离和去除咽拱之间的间旋，并暴露咽袋。在咽区域的另一侧执行此程序。取出附着在内侧最后部的间质，观察第四个咽袋。后侧向上，观察左四四咽袋。继续取出附着在内侧最后部和第二个袋子上的电位。取出心管和内袋周围的凹塞。与腹侧向上，观察咽内德姆，和第二咽拱的右侧。在此阶段，甲状腺基的内皮应该可见。分离第二和第三咽拱的外皮，小心地去除拱门的分膜。观察右侧第二个咽拱的分部去除。注意第四和第三袋的位置和甲状腺基点。将遗骸取出到附着在咽袋的间质细胞中。观察右侧的第三个和第四个袋子以及左侧的第四个袋子。重复左侧的分遣。现在观察左侧的第三个袋子。观察左侧第二个拱门的分遣点。请注意，在此过程期间，所有表面和溶液都应保持冷。更改为新的冷胰腺素溶液和菜，以防需要很长时间来解剖组织。最后，在第二和第三咽袋之间进行横向切割，以去除第二个邮袋和甲状腺基。此时，隔离的内侧由第三和第四咽袋和咽后尖端组成。在两个微型手术刀的帮助下，取出分离的梅森奇梅。将分离的内皮转移到装满冷胎儿血清的玻璃盘中，在准备体外测定时将其放在冰上。鸡蛋被放置在水平位置，上侧标有使用木炭。首先，从培养箱中取出鸡蛋。用弯曲的剪刀，在壳上打开一个小孔，插入一根针，用10毫升注射器吸两毫升白素。在壳体标记区域打开一个圆形孔，将葡萄球膜外部切割到额外的胚胎血管上，同时用薄钳将胚胎抱住。在立体显微镜下，将胚胎放在含有冷 PBS 的黑色基底的培养皿中。使用四个昆虫针将胚胎固定到板的底部。将针脚放在外向区域，形成方形。在19和24的胚胎之间进行两次切割，横向到胚胎轴并穿过胚胎。通过切割边缘胚胎边缘释放此部分。观察侧板、神经管和导管。吸气并转移组织到装满冷胰腺素的玻璃盘中。在冰上孵育30分钟，进行酶消化。在立体显微镜下，使用支架中的两个微刀将中皮从周围组织分离。观察索马托普图拉中皮，splanchnopleura，神经管和异体。首先，去除表面的外皮。观察与异体分离的索马托普图拉中皮。然后，小心地将位于喷孔的 splanchnopleura 从索马托普勒库拉分离。观察索马托普图拉的右下层。通过与神经管平行运动切割释放它。请注意，在此过程期间，所有表面和溶液都应保持冷。更改为新的冷胰腺素溶液和菜，以防需要很长时间来解剖组织。观察索马托普鲁拉、索米茨、神经管和外皮的左下层。重复这边的中皮释放。用微刀做慢动作。暴露的细胞外基质蛋白通过组织和仪器，防止液体运动。小心地切断与神经管平行运动的索马托普图拉。将分离的中皮转移到装满冷胎儿牛血清的玻璃盘中，在准备体外测定时将其放在冰上。将细网状金属格栅放在培养皿中，并填充培养介质。去除过量的液体，用格栅顶部对介质表面进行平表。在薄钳的帮助下，将膜过滤器浸入培养介质中，并小心地将膜片放在格栅顶部，以与表面接触。在立体显微镜下，借助铲子和薄钳，通过轻轻滑动，将隔离的内侧膜从玻璃盘转移到膜过滤器。对隔离的中皮重复此过程。在微刀的帮助下，混合组织，以最大限度地扩大其关联性。小心地将相关组织放在37度的加湿培养箱中，用5%的CO2放置48小时。孵育期后，将培养组织移植到科里奥兰型膜上，并允许其在椭圆形中再发育10天，完成上述器官形成。下面是允许分离鸟类胚胎组织的后向法，用于不同的实验方法。例如，还评估了已知参与形成咽袋的基因的表达，评估了一种分离的内皮，含有鸡胚胎中的第二、第三和第四个咽袋，由整个坐骑原位杂交。声波刺猪的表达在中央咽的内皮中检测出来，排除在袋内，而BMP7在第二和第三咽袋的内皮中表达，排除在中央咽和四咽袋之外。分离的组织也可以在体外特别关联48小时，移植到科里奥兰型膜上，并允许进一步发育10天。外植可以通过传统组织学和免疫组织化学进行分析。第三和第四咽囊与鸡索皮瘤的关联具有代表性的一些结果如下-Grafts显示，完全形成的嵌合胸腺与鹅衍生的胸腺上皮细胞对QCPN和鸡淋巴细胞呈阳性。此外，细胞蛋白正胸腺上皮显示正常的形态特征，显示典型的视网膜结构。看完这段视频后，你应该有一个很好的理解，如何分离出可用于基因表达研究，通过形成嵌合器官，可以帮助破译器官遗传学的复杂性。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

转录组分析]<em&gt;活体</em&gt;生产牛胚胎植入前胚胎采用双色微阵列平台

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

科研

发育生物学

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

心脏分化的表观遗传调控胚胎干细胞和组织

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues

隔离和脂肪干细胞分化的猪从皮下脂肪组织

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

小鼠胚胎Hemogenic内皮细胞的分离

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

小鼠胚胎跖骨文化：软骨内骨化的生理模型

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

协议的可视化类固醇机关及其互动器官在果蝇免疫染色<em&gt;果蝇</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

使用体内和组织和细胞外植体方法研究胚胎和围产期主动脉的形态和发病机制

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic ...

Two-step Approach to Explore Early- and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm

鸟类模型中器官形成早期和晚期的两步探讨: 胸腺和甲状旁腺器官发生范式

The avian embryo, as an experimental model, has been of utmost importance for seminal discoveries in developmental biology. Among several approaches, the ...

Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

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The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...

A Familial Hypercholesterolemia Human Liver Chimeric Mouse Model Using Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocytes

诱导多潜能干细胞源性肝细胞的家族性高胆固醇血症人肝嵌合小鼠模型

Familial hypercholesterolemia (FH) is mostly caused by low-density lipoprotein receptor (LDLR) mutations and results in an increased risk of early-onset ...