Name: isolation of embryonic tissues and formation of quail-chicken chimeric organs using the thymus example
Uploaded: 2019-02-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Embryonic Tissues and Formation of Quail-Chicken Chimeric Organs Using The Thymus Example at JoVE.com

Forfatterne er taknemmelige for Isabel Alcobia kritisk læsning af manuskript, at Mário Henriques for video fortælling og Vitor Proa fra tjenesten histologi af Instituto de Histologia e Biologia gøre Desenvolvimento, humanistiske de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa, for teknisk support. Vi er især gæld til Paulo Caeiro og Hugo Silva fra Unidade de audiovisuais (enheden for audiovisuelle medier), humanistiske de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa for deres fremragende indsats for produktionen af denne video. Vi anerkender Leica Microsystems venligst give en Stereoskopet udstyret med en video system og Interaves - Sociedade Agro-Pecuária, S.A for at bidrage med vagtler befrugtede æg. Dette arbejde blev støttet af humanistiske de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).

Alle disse eksperimenter følge dyrs pleje og etiske retningslinjer de-Centro Académico de Medicina Lisboa.
1. befrugtet vagtler og kylling æg inkubation
<ol><li>Sted befrugtede æg af japanske vagtler (Coturnix coturnix japonica) i en 38 ° C befugtet inkubator for 3 dage. Inkuber æg (æg stump ende) vender opad i luftkammer. Bemærk: Befugtet miljøet opnås ved at placere en vandbeholder i bunden af varmeskabet.</li>
	<li>Inkuber befrugtede æg af fjerkræ (Gallus gallu...

<ol>
	<li>Le Douarin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nogent+Institute--50+years+of+embryology.">The Nogent Institute--50 years of embryology.</a> The International Journal of Developmental Biology. 49 (2-3), 85-103 (2005).</li><li>Le Douarin, N. M., Teillet, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+migration+of+neural+crest+cells+to+the+wall+of+the+digestive+tract+in+avian+embryo.">The migration of neural crest cells to the wall of the digestive tract in avian embryo.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 30 (1), 31-48 (1973).</li><li>Le Douarin, N. M., Jotereau, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+of+cells+of+the+avian+thymus+through+embryonic+life+in+interspecific+chimeras.">Tracing of cells of the avian thymus through embryonic life in interspecific chimeras.</a> Journal of Experimental Medicine. 142 (1), 17-40 (1975).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.+1951.">A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951.</a> Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).</li><li>Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Bmp4+signalling+in+the+epithelial-mesenchymal+interactions+that+take+place+in+early+thymus+and+parathyroid+development+in+avian+embryos.">Modulation of Bmp4 signalling in the epithelial-mesenchymal interactions that take place in early thymus and parathyroid development in avian embryos.</a> Developmental Biology. 361 (2), 208-219 (2012).</li><li>Takahashi, Y., Bontoux, M., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelio--mesenchymal+interactions+are+critical+for+Quox+7+expression+and+membrane+bone+differentiation+in+the+neural+crest+derived+mandibular+mesenchyme.">Epithelio--mesenchymal interactions are critical for Quox 7 expression and membrane bone differentiation in the neural crest derived mandibular mesenchyme.</a> Embo Journal. 10 (9), 2387-2393 (1991).</li><li>Figueiredo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+and+Hedgehog+in+the+thymus/parathyroid+common+primordium:+Crosstalk+in+organ+formation.">Notch and Hedgehog in the thymus/parathyroid common primordium: Crosstalk in organ formation.</a> Developmental Biology. 418 (2), 268-282 (2016).</li><li>Figueiredo, M., Neves, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+Approach+to+Explore+Early-and+Late-stages+of+Organ+Formation+in+the+Avian+Model:+The+Thymus+and+Parathyroid+Glands+Organogenesis+Paradigm+Video+Link.">Two-step Approach to Explore Early-and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm Video Link.</a> Journal of Visualuzed Experiments. , (2018).</li><li>Nehls, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+genetically+separable+steps+in+the+differentiation+of+thymic+epithelium.">Two genetically separable steps in the differentiation of thymic epithelium.</a> Science (New York, N.Y.). 272 (5263), 886-889 (1996).</li><li>Morahan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nu+gene+acts+cell-autonomously+and+is+required+for+differentiation+of+thymic+epithelial+progenitors.">The nu gene acts cell-autonomously and is required for differentiation of thymic epithelial progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (12), 5742-5746 (1996).</li><li>Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DiGeorge+syndrome+phenotype+in+mice+mutant+for+the+T-box+gene,+Tbx1.">DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1.</a> Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).</li><li>Nie, X., Brown, C. B., Wang, Q., Jiao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+Bmp4+from+the+Tbx1+expression+domain+causes+abnormal+pharyngeal+arch+artery+and+cardiac+outflow+tract+remodeling.">Inactivation of Bmp4 from the Tbx1 expression domain causes abnormal pharyngeal arch artery and cardiac outflow tract remodeling.</a> Cells Tissues Organs. 193 (6), 393-403 (2011).</li><li>Zou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+of+the+third+pharyngeal+pouch+into+thymus/parathyroid+by+Six+and+Eya1.">Patterning of the third pharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1.</a> Developmental Biology. 293 (2), 499-513 (2006).</li><li>Davey, M. G., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chicken+as+a+model+for+embryonic+development.">The chicken as a model for embryonic development.</a> Cytogenetic and Genome Research. 117 (1-4), 231-239 (2007).</li><li>Nowak-sliwinska, P., Segura, T., Iruela-arispe, M. L., Angeles, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chicken+chorioallantoic+membrane+model+in+biology,+medicine+and+bioengineering.">The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering.</a> Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).</li><li>Uematsu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+in+ovo+chorioallantoic+membrane+engraftment+to+culture+testes+from+neonatal+mice.">Use of in ovo chorioallantoic membrane engraftment to culture testes from neonatal mice.</a> Comparative Medicine. 64 (4), 264-269 (2014).</li><li>Martyn, I., Kanno, T. Y., Ruzo, A., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+a+human+organizer+by+combined+Wnt+and+Nodal+signaling.">Self-organization of a human organizer by combined Wnt and Nodal signaling.</a> Nature. 558 (7708), 132-135 (2018).</li></ol>

Proceduren embryonale væv isolation detaljeret her blev forbedret fra tidligere teknikker til at fremstille vagtler-kylling kimære embryoner i forskellige biologiske sammenhænge3,5,6.
Denne fremgangsmåde er egnet til at isolere ren embryonale væv uden genetisk manipulation eller brug af væv-specifikke markører, som ofte er ubestemt, begrænse anvendelsen af genetisk modificerede dyremodeller. D...

I begyndelsen af 1970 ' erne, blev en elegant vagtler-kylling chimera system udviklet af Le Douarin, åbne nye muligheder for at forstå rollen i celle migration og cellulære interaktioner under udvikling1,2. Modellen blev udtænkt på den forudsætning, at celle udveksling mellem de to arter væsentligt ikke ville forstyrre embryogenese, senere bekræftet når bruges til at studere adskillige udviklingsprocesser, herunder dannelsen af den nervøse og den hæmatopoietisk systemer1. Under sidstnævnte som et eksempel, de cykliske bølger af hæmatopoietisk stamfaderen koloniserer det thymic epitelial rudiment blev først observeret ved hjælp af vagtler-kylling chimera system3. For at, blev den potentielle område af thymus, endoderm af tredje og fjerde svælg poser (3/4PP), mekanisk og enzymatisk isoleret fra vagtler (q) embryoner på 15 til 30 - somite Stadium [embryonale dag (E) 1,5-E2.5]. Disse faser svarer til kylling Hamburger og Hamilton4 (HH) - faser 12-17. Isolationsprocedurer startede med brug af trypsin at enzymatisk adskille endoderm fra den vedlagte udkom. Den isolerede endoderm blev podet ind i somatopleura regionen en vært kylling (c) embryon på E3-E3.5 (HH-faser 20-21). Denne heterolog udkom blev betragtet som "eftergivende" thymic epitel udvikling bidrager også til orgel dannelse3. Bagefter, infiltreret successive bølger af kylling vært blodbårne stamceller vagtler donor thymic epitelial modstykket bidrager til thymus dannelse i vært embryo3.
For nylig, en modificeret version af denne tilgang blev også bevist for at være vigtige for at studere epitel-mesenchymale interaktioner i tidlige stadier af thymus dannelse5. I denne henseende var det væv, der er involveret i dannelsen af ektopiske brissel i kimære embryoner3 isoleret, begge fra donor og vært embryoner, og forbundet ex vivo. En forbedret protokol blev brugt til at isolere vagtler 3/4PP endoderm (E2.5-E3) og kylling somatopleura mesoderm (E2.5-E3). Kort, embryonale væv blev isoleret af mikrokirurgi og in vitro-pancreatin fordøjelsen. Også, enzymatisk fordøjelse, temperatur og tid til inkubation var optimeret vævstype og udviklingsstadiet (tabel 1).
Næste, isoleret væv blev forbundet i en organotypic i vitro system for 48 h, som tidligere rapporteret5,6. In vitro-sammenslutningen af væv efterligner de lokale cellulære vekselvirkninger i embryo, at overvinde visse begrænsninger af in vivo manipulation. Dette system er særligt nyttige til at studere cellulær interaktioner i komplekse morphogenic begivenheder, såsom udvikling af svælg apparatet.
Hvert væv i thymus histogenesis bidrag, samt mulighed for foreningen heterospecific til at generere en thymus kan være yderligere udforsket brug af CAM metodologi, tidligere detaljerede5,7,8. Kortfattet, blev kulturperler væv podet på CAM cE8 embryoner og lov til at udvikle i ovo for 10 dage. Derefter, thymus dannelse blev evalueret af morfologisk analyse i de høstede explants. Som i den klassiske vagtler-kylling studier3, blev vagtler thymic epitel koloniseret af hæmatopoietisk stamceller (HPCs) afledt af kylling embryo, som senere viste sig at bidrage til orgel udvikling9,10 . HPCs overflyttet fra embryonet til ektopisk kimære thymus gennem stærkt vaskulariserede CAM5,7,8. Vagtler afledte thymic epitel kan identificeres ved hjælp af Immunhistokemi bruger artsspecifikke antistoffer (dvs. QCPN - MAb vagtler PeriNuclear), at overvinde behovet for væv-specifikke molekylære markører.
Denne eksperimentelle metode, tillader som den totrinsløsning, rapporterede i forrige publikation8, graduering af signalstoffet veje af regelmæssig indgift af farmakologiske midler under in vitro og i ovo udvikling. Explants kan også høstes på ethvert tidspunkt i løbet af eksperimentet8.
Endelig tillader isolation protokollen her detaljerede bevarelsen af de naturlige egenskaber og 3D-arkitektur i embryonale væv, især nyttigt for detaljering in situ genekspression mønstre af embryonale territorier ellers utilgængelige af konventionelle metoder. Derudover kan transkriptom analyse tilgange, herunder RNA-seq eller microarrays, også anvendes i isolerede væv uden at kræve genetiske markører samtidig en væv-specifikke høj overførselshastighed "omik" analyse.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1279px;" width="1277">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:379px;">Chicken fertilized eggs (Gallus gallus)</td>
			<td style="width:306px;">Pintobar, Portugal</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:445px;">Poultry farm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:379px;">Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix)</td>
			<td>Interaves, Portugal</td>
			<td></td>
			<td style="width:445px;">Bird farm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">15 mL PP centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430052</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">50 mL PP centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430290</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">60 x 20 mm pyrex dishes</td>
			<td>Duran group</td>
			<td style="width:149px;">21 755 41</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">100 x 20 mm pyrex dishes</td>
			<td>Duran group</td>
			<td style="width:149px;">21 755 48</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Metal grid</td>
			<td>Goodfellows</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:445px;">fine meshed&#160; stainless steel grid</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Membrane filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td style="width:149px;">DTTP01300</td>
			<td style="width:445px;">0.6 mm Isopore membrane filter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Petri dish, 35 x 10 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:149px;">P5112&#160;</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">60 x 30 mm pyrex bowls (Small size)</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:445px;">from supermarket&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">100 x 50 mm pyrex bowls (Large size)</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:445px;">from supermarket&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Transfer pipettes</td>
			<td>Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2041S</td>
			<td style="width:445px;">2 mL plastic pipet</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Glass pasteur pipette</td>
			<td>Normax</td>
			<td style="width:149px;">5426015</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Clear plastic tape</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:445px;">from supermarket&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:379px;">Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5</td>
			<td>BMA Biomedicals</td>
			<td>T-1302</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td style="width:445px;">Standart FBS</td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:379px;">Pancreatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-3292</td>
			<td style="width:445px;">Prepare a 25 mg/mL solution according to manufacturer&#39;s instructions; centrifuge and filter prior to aliquote and store at -20&#186;C. Aliquots can be kept frozen for several years.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>GIBCO, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">QCPN antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>QCPN</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement&#160;</td>
			<td>GIBCO, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>61870010</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit</td>
			<td>ELKEM/Silmid</td>
			<td>RH141001KG</td>
			<td style="width:445px;">To prepare the back base for petri dish</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">11251-30&#160;</td>
			<td style="width:445px;">Thin forceps</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Extra fine Bonn scissors, curved</td>
			<td style="width:306px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">14085-08</td>
			<td style="width:445px;">Curved scissors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Insect pins&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">26001-30</td>
			<td style="width:445px;">0.3 mm Stainless steel pin</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Micro spatula&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">10087-12</td>
			<td style="width:445px;">Transplantation spoon</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Minutien Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">26002-20</td>
			<td style="width:445px;">0.2 mm Stainless steel microscalpel</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Minutien Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">26002-10</td>
			<td style="width:445px;">0.1 mm Stainless steel microscalpel</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Moria Nickel Plated Pin Holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">26016-12</td>
			<td style="width:445px;">Nickel plated pin holder</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Moria Perforated Spoon</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">10370-17</td>
			<td style="width:445px;">Skimmer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Wecker Eye Scissor</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">15010-11</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Camera</td>
			<td>Leica Microsystems&#160;</td>
			<td style="width:149px;">MC170 HD</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems&#160;</td>
			<td style="width:149px;">DM2500</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">NanoZoomer&#160;S360 Digital&#160;slide scanner&#160;</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:149px;">C13220-01</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Stereoscope</td>
			<td>Leica Microsystems&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Leica M80</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of embryonic tissues and formation of quail-chicken chimeric organs using the thymus example

Kapacitet til at isolere embryonale væv var et vigtigt skridt til oprettelse af vagtler-kylling chimera system, som igen har givet ubestridte bidrag til afsløringen nøgleprocesser i udviklingsmæssige biologi.
Heri er beskrevet en optimeret metode til at isolere embryonale væv fra vagtler og kyllinger af mikrokirurgi og enzymatiske fordøjelsen samtidig bevare sin biologiske egenskaber. Efter isolering, væv fra begge arter er forbundet i en in vitro organotypic analyse for 48 h. vagtler og kylling væv kan blive diskrimineret ved forskellige nukleare funktioner og molekylære markører tillader undersøgelse af det cellulære cross-talk mellem heterospecific sammenslutning af væv. Denne tilgang er derfor et nyttigt redskab til at studere komplekse væv interaktioner i udviklingsprocesser med højdynamiske rumlige ændringer, såsom dem, der forekommer under svælg morfogenese og dannelsen af foregut endoderm-afledte organer. Denne eksperimentelle tilgang blev først udviklet for at studere de epitel-mesenchymale interaktioner i tidlige stadier af thymus dannelse. I denne, endoderm-afledte potentielle thymic rudiment og mesoderm-afledte udkom, blev isoleret fra vagtler og kylling embryoner, henholdsvis.
De tilknyttede væv evne til at generere organer kan testes yderligere ved at pode dem ind på chorioallantoic membranen (CAM) af en kylling embryo. Cam-Modulet giver næringsstoffer og giver gasbørser til eksplanterede væv. Efter 10 dage i ovo udvikling, kan de kimære organer analyseres på de høstede explants af konventionelle morfologiske metoder. Denne procedure giver også mulighed for at studere væv-specifikke bidrag under orgel dannelse, fra sin første udvikling (in vitro-udvikling) til de sidste faser af organogenesis (i ovo udvikling).
Endelig metoden bedre isolering også indeholder tre dimensioner (3D) bevaret embryonale væv, der kan også bruges til høj opløsning topografiske analyse af væv-specifikke genekspression mønstre.

Protokollen beskriver en metode til at isolere aviær embryonale væv skal anvendes i flere cellulære og udviklingsmæssige biologi tekniske tilgange. Denne metode var tidligere ansat til at studere epitel-mesenchymale interaktioner i tidlige stadier af thymus dannelse5. Heri, er nye resultater vist i figur 1 og figur 2, ved hjælp af lignende metoder.
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-p...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Embryonic Tissues and Formation of Quail-Chicken Chimeric Organs Using The Thymus Example at JoVE.com

Isolation of Embryonic Tissues and Formation of Quail-Chicken Chimeric Organs Using The Thymus Example

Denne artikel indeholder en metode til at isolere ren embryonale væv fra vagtler og kylling embryoner, der kan kombineres til at danne ex vivo kimære organer.

Isolering af embryonale væv og dannelsen af vagtler-kylling kimære organer ved hjælp af eksemplet med Thymus

The capacity to isolate embryonic tissues was an essential step for establishing the quail-chicken chimera system, which in turn has provided undisputed ...

Det overordnede mål med denne procedure er at præsentere en optimeret eksperimentel tilgang til at isolere embryonale væv fra vagtler og kylling embryoner. Med denne teknik opnår vi rene embryonale væv, der kan anvendes i genekspressionsundersøgelser og funktionelle analyser. Væv fra vagtler og kyllingembryoner isoleres af mikrokirurgi og udsættes for in vitro enzymatisk fordøjelse, samtidig med at dets biologiske egenskaber bevares.Efter isolation kan de tredimensionelle bevarede væv bruges til topografiske genudtryksmønstre med høj opløsning. Denne fremgangsmåde er især nyttig til at beskrive in situ-genekspression i embryonale områder, der ellers ikke er tilgængelige ved konventionelle metoder. Desuden kan transskriptoanalysemetoder også anvendes i isolerede væv uden at kræve genetiske markører, samtidig med at der leveres en vævsspecifik høj gennemløbsanalyse.Alternativt kan det isolerede væv fra begge arter være forbundet i en in vitro organotypic-analyse i 48 timer. Denne tilgang gør det muligt at studere væv interaktioner, da vagtler og kylling celler kan diskrimineres af forskellige nukleare træk og molekylære markører. Kulturvævets evne til at danne organer kan testes yderligere ved i ovo-analysen.Denne metode er derfor et nyttigt redskab til at studere komplekse vævsinteraktioner i udviklingsprocesser med meget dynamiske spaciale ændringer og kan også bidrage til at afsløre potentialet i specifikke embryonale områder til dannelsen af organer. Som et eksempel, heri er beskrevet dannelsen af vagtel-kylling kimære thymus fra isolerede embryonale væv. For det første er endoderm af den tredje og fjerde svælg poser, den potentielle thymic rudiment isoleret fra svælg region vagtel embryoner med tre dages udvikling.Derefter, dette væv er forbundet med en mesenchyme stand til at støtte dens udvikling, den somatopleura mesoderm. Endelig er den heterospecific forening af væv dyrkes in vitro og in ovo til at danne en kimær thymus. Udfør alle æg manipulation procedurer i sterile forhold ved hjælp af en vandret laminar flow hætte og steriliserede instrumenter og materialer.Befrugtede vagtler æg blev inkuberet med luftkammeret vender opad. Til at begynde, fjerne vagtler æg fra rugemaskinen. Forbered en stor borosilikat glasskål fyldt med kold PBS.Med buet saks, tryk og skær et cirkulært hul i skallen af en vagtel æg med tre dages inkubation. Gør hullet i den modsatte side af ægget stump, og overfør æggeblomme til skålen med kold PBS. Fjern embryonet fra æggeblomme ved at skære vitellinemembranen eksternt til extraembryonic fartøjer.Ved hjælp af tynde snævninger overføres fosteret til en lille skål fyldt med kold PBS, og flyt derefter fosteret til en petriskål med sort bund med en skummer. Svængeregionen, der indeholder tredje og fjerde pharyngeal-poser som beskrevet i tidligere Jove SPA ligation, fjernes. Derefter overføre den tredje og fjerde svælg bue region til et glas, der er fyldt med kold pancreatin og inkubere i en time, på is, for enzymatisk fordøjelse.Bemærk, at inkubationstiden for enzymatisk fordøjelse afhænger af udviklingsstadiet. Anbring glasskålen under stereomikroskopet, og isoler endoderm fra den tredje og fjerde svælget bueregion ved hjælp af to mikroskalpel i en holder. Første sted svælg region med dorsal side op, viser internt endoderm og ectoderm i den ydre overflade.Overhold ectoderm, endoderm, mesenchyme, hjerterør, og ventrale del af neuralrøret. Fjern neuralrøret og mesoderm knyttet til den dorsale overflade af svælg endoderm. Overhold endoderm af svælge, den fjerde og tredje svælge poser, og hjertet rør.Med dorsal side op, omhyggeligt løsrive og fjerne mesenchyme mellem svælg buer og udsætte svælg poser. Udfør denne procedure i den anden side af svængeregionen. Fjern mesenchyme knyttet til den mest bageste del af endoderm og observere den fjerde svælg pose.Med posterior side op, observere både venstre og højre fjerde svænge poser. Fortsæt ved at fjerne mesenchyme knyttet til den mest bageste del af endoderm og til den anden pose. Fjern hjerterøret og mesenchyme omkring de indvendige poser.Med ventrale side op, observere svælx endoderm, og højre side af den anden svællede bue. På dette stadium, endoderm af skjoldbruskkirtlen rudiment bør være synlige. Løsrive ectoderm af den anden og tredje svælg buer og forsigtigt fjerne mesenchyme af buer.Overhold fjernelsen af mesenchyme af den anden svælg bue på højre side. Bemærk placeringen af den fjerde og tredje poser og skjoldbruskkirtel rudiment. Fjern resterne til mesenkymale celler knyttet til svængning poser.Overhold den tredje og fjerde poser i højre side og den fjerde pose fra venstre side. Gentag mesenchyme udstationering af venstre side. Overhold nu den tredje pose i venstre side.Overhold mesenchyme udstationering af den anden bue på venstre side. Bemærk, at alle overflader og opløsninger skal holdes kolde under denne procedure. Skift til en ny kold pancreatin opløsning og fad i tilfælde af at tage lang tid at dissekere væv.Endelig foretage en tværgående snit mellem den anden og tredje svaryngeal poser for at fjerne den anden poser og skjoldbruskkirtlen rudiment. På dette tidspunkt er den isolerede endoderm består af den tredje og fjerde svælg poser og den bageste spids af svælg. Fjern resterne løsrevet mesenchyme ved hjælp af to mikro-skalpeller.Den isolerede endoderm overføres til en glasskål fyldt med koldt føtalt kvægserum og opbevares på is under fremstillingen af in vitro-analysen. Æg blev placeret i vandret position og oversiden markeret til brug af en trækul. Til at begynde, fjerne æggene fra rugemaskinen.Med en buet saks skal du åbne et lille hul i skallen, indsætte en nål og aspirere to milliliter albumin med en 10 milliliter sprøjte. Åbn et cirkulært hul i skallens markerede område og skær vitellinemembranen eksternt til de ekstra embryonale kar, mens embryonet holder med tynde fakinder. Under et stereomikroskop skal fosteret placeres i en petriskål med sort bund, der indeholder kold PBS.Brug fire insektstifter til at holde fosteret nede i bunden af pladen. Placer stifterne i den ekstraembryoniske region, der danner en firkantet form. Udfør to snit mellem somitterne 19 og 24 på tværs af embryoaksen og krydsning af embryonet.Slip dette afsnit ved at skære de marginale embryonale kanter. Overhold sidepladen, neuralrøret og somitterne. Aspirere og overføre væv til et glas fad fyldt med kold pancreatin.Inkuber i 30 minutter på is til enzymatisk fordøjelse. Under stereomikroskopet isoleres mesoderm fra det omgivende væv ved hjælp af to mikroskaller i holdere. Overhold somatopleura mesoderm, splanchnopleura, neuralrør, og ectoderm.Først skal du fjerne ectoderm på overfladen. Overhold somatopleura mesoderm dissociated fra ectoderm. Derefter forsigtigt frigøre ventrally placeret splanchnopleura fra somatopleura.Overhold den højre laterale mesoderm af somatopleura. Slip det ved at skære det i en parallel bevægelse til neuralrøret. Bemærk, at alle overflader og opløsninger skal holdes kolde under denne procedure.Skift til en ny kold pancreatin opløsning og fad i tilfælde af at tage lang tid at dissekere væv. Overhold den venstre laterale mesoderm af somatopleura, somites, neuralrør, og ectoderm. Gentag mesoderm frigivelsen af denne side.Lav langsomme bevægelser med mikro-skalpel. De eksponerede ekstracellulære matrixproteiner sidder gennem væv og instrumenter og forhindrer væskebevægelser. Skær forsigtigt somatopleuraen i en parallel bevægelse til neuralrøret.Overfør den isolerede mesoderm til en glasskål fyldt med koldt føtal kvægserum og opbevar det på is under fremstillingen af in vitro-assay. Placer en finmasket metalrist i en petriskål og fyld med kulturmedium. Fjern de overdrevne væsker til nivellering af medium overflade med toppen af risten.Ved hjælp af tynde stændrævne, dyppe en membran filter i kulturmediet og omhyggeligt placere den på toppen af risten for at have en overflade i kontakt med hende. Under stereomikroskopet overføres den isolerede endoderm fra glasskålen til membranfilteret ved at glide forsigtigt ved hjælp af spatel og tynde spån. Gentag denne procedure for den isolerede mesoderm.Ved hjælp af en mikro-skalpel, bland væv for at maksimere det forening. Placer omhyggeligt de tilhørende væv i en befugtet inkubator ved 37 grader med 5% CO2 i 48 timer. Efter inkubationstiden podes kulturvævet på den coriolanske typemembran og gør det muligt at udvikle sig i ovalt i yderligere 10 dage for at fuldføre organdannelsen som tidligere beskrevet.Her er den retikulære metode, der gør det muligt isolering af aviær embryonale væv, der skal anvendes i forskellige eksperimentelle tilgange. Som et eksempel blev udtrykket af gener, der vides at være involveret i dannelsen af svælgposerne, også vurderet en isoleret endoderm, der indeholdt den anden, tredje og fjerde svælgposer fra kyllingens embryoner på embryonal dag tre og en halv for hele mount in situ hybridisering. Udtrykket af Sonic Hedgehog blev påvist i endoderm af den centrale svælg og udelukket fra poserne, mens BMP7 blev udtrykt i endoderm af den anden og tredje svælg poser og udelukket fra den centrale svælg og fjerde svælg pose.Isolerede væv kan også være vitro specifikt forbundet in vitro i 48 timer, transplantere på coriolan type membran, og lov til at udvikle sig i yderligere 10 dage. Explants kan analyseres ved konventionel histologi og immunhistokemi. Nogle repræsentative resultater af foreningen af vagtler endoderm fra den tredje og fjerde svælg poser med kylling somatopleura mesoderm er følgende-Grafts viste en fuldt dannet kimære thymus med vagtel afledt thymic epitelceller positiv for QCPN og kylling lymfoide celler.Derudover cytokeratin positive thymic epitel viste normale morfologiske træk, viser en typisk retikulær arkitektur. Efter at have set denne video, bør du have en god forståelse af, hvordan man isolere vagtler og kylling embryonale væv, der kan bruges i genekspression undersøgelser og ved at danne kimære organer kan også hjælpe dechifrere kompleksiteten af organgenetik.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transkriptom profilering<em&gt; In-vivo</em&gt; Produceret Bovine præimplantationsembryoner Brug To farve Microarray Platform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Epigenetisk forordning af Cardiac Differentiering af embryonale stamceller og væv

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues

Isolering og differentiering af adipøst afledte stamceller fra Porcine subkutane fedtvæv

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

Isolering af murint embryonale Hemogenic endotelceller

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

Kultur af murine embryonale Mellemfodsben: en fysiologisk model af endochondral ossifikation

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

Protokoller til visualisering steroidogeniske organer og deres interaktive organer med Immunfarvning i bananfluen<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Brug af In Vivo og væv og celle eksplantat tilgange til at studere morfogenese og patogenese af embryonale og Perinatal Aorta

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic ...

Two-step Approach to Explore Early- and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm

To-trins tilgang til at udforske tidlige - og sene-stadier af orgel dannelse i den aviær Model: Thymus og Biskjoldbruskkirtlerne Organogenesis paradigme

The avian embryo, as an experimental model, has been of utmost importance for seminal discoveries in developmental biology. Among several approaches, the ...

Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

Tre-dimensionelle Organotypic kulturer af vestibulære og auditive sanseorganer

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...

A Familial Hypercholesterolemia Human Liver Chimeric Mouse Model Using Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocytes

En familiær hyperkolesterolæmi menneskelige lever kimære musen Model ved hjælp af induceret pluripotente stamceller-afledt hepatocytter

Familial hypercholesterolemia (FH) is mostly caused by low-density lipoprotein receptor (LDLR) mutations and results in an increased risk of early-onset ...