Name: isolation of embryonic tissues and formation of quail-chicken chimeric organs using the thymus example
Uploaded: 2019-02-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Embryonic Tissues and Formation of Quail-Chicken Chimeric Organs Using The Thymus Example at JoVE.com

De auteurs zijn Isabel Alcobia dankbaar voor de kritische lezing van het manuscript, Mário Henriques voor video vertelling en Vitor Proa vanaf de betekening van de histologie van de Instituto de Histologia e Biologia doen Desenvolvimento, Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa, voor technische ondersteuning. Wij zijn met name dank verschuldigd Paulo Caeiro en Hugo Silva uit de Unidade de audiovisuais (Unit audiovisuele media), Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa voor hun uitstekende inzet voor de productie van deze video. Wij erkennen Leica Microsystems voor het vriendelijk het verstrekken van een stereoscoop uitgerust met een video systeem en Interaves - Sociedade Agro-Pecuária, S.A om bij te dragen met kwartel eieren bevrucht. Dit werk werd gesteund door Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).

Al deze experimenten volgen de verzorging van de dieren en de ethische richtsnoeren inzake de Centro Académico de Medicina Lisboa.
1. bevrucht kwartel en kip ei incubatie
<ol><li>Plaats bevruchte eieren van Japanse kwartel (Coturnix coturnix japonica) in een bevochtigde incubator van 38 ° C gedurende 3 dagen. Incubeer de eieren (ei botte uiteinde) naar boven in de luchtkamer. Opmerking: Het bevochtigde milieu wordt bereikt door het plaatsen van een watercontainer onderin de inc...

<ol>
	<li>Le Douarin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nogent+Institute--50+years+of+embryology.">The Nogent Institute--50 years of embryology.</a> The International Journal of Developmental Biology. 49 (2-3), 85-103 (2005).</li><li>Le Douarin, N. M., Teillet, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+migration+of+neural+crest+cells+to+the+wall+of+the+digestive+tract+in+avian+embryo.">The migration of neural crest cells to the wall of the digestive tract in avian embryo.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 30 (1), 31-48 (1973).</li><li>Le Douarin, N. M., Jotereau, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+of+cells+of+the+avian+thymus+through+embryonic+life+in+interspecific+chimeras.">Tracing of cells of the avian thymus through embryonic life in interspecific chimeras.</a> Journal of Experimental Medicine. 142 (1), 17-40 (1975).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.+1951.">A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951.</a> Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).</li><li>Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Bmp4+signalling+in+the+epithelial-mesenchymal+interactions+that+take+place+in+early+thymus+and+parathyroid+development+in+avian+embryos.">Modulation of Bmp4 signalling in the epithelial-mesenchymal interactions that take place in early thymus and parathyroid development in avian embryos.</a> Developmental Biology. 361 (2), 208-219 (2012).</li><li>Takahashi, Y., Bontoux, M., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelio--mesenchymal+interactions+are+critical+for+Quox+7+expression+and+membrane+bone+differentiation+in+the+neural+crest+derived+mandibular+mesenchyme.">Epithelio--mesenchymal interactions are critical for Quox 7 expression and membrane bone differentiation in the neural crest derived mandibular mesenchyme.</a> Embo Journal. 10 (9), 2387-2393 (1991).</li><li>Figueiredo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+and+Hedgehog+in+the+thymus/parathyroid+common+primordium:+Crosstalk+in+organ+formation.">Notch and Hedgehog in the thymus/parathyroid common primordium: Crosstalk in organ formation.</a> Developmental Biology. 418 (2), 268-282 (2016).</li><li>Figueiredo, M., Neves, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+Approach+to+Explore+Early-and+Late-stages+of+Organ+Formation+in+the+Avian+Model:+The+Thymus+and+Parathyroid+Glands+Organogenesis+Paradigm+Video+Link.">Two-step Approach to Explore Early-and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm Video Link.</a> Journal of Visualuzed Experiments. , (2018).</li><li>Nehls, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+genetically+separable+steps+in+the+differentiation+of+thymic+epithelium.">Two genetically separable steps in the differentiation of thymic epithelium.</a> Science (New York, N.Y.). 272 (5263), 886-889 (1996).</li><li>Morahan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nu+gene+acts+cell-autonomously+and+is+required+for+differentiation+of+thymic+epithelial+progenitors.">The nu gene acts cell-autonomously and is required for differentiation of thymic epithelial progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (12), 5742-5746 (1996).</li><li>Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DiGeorge+syndrome+phenotype+in+mice+mutant+for+the+T-box+gene,+Tbx1.">DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1.</a> Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).</li><li>Nie, X., Brown, C. B., Wang, Q., Jiao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+Bmp4+from+the+Tbx1+expression+domain+causes+abnormal+pharyngeal+arch+artery+and+cardiac+outflow+tract+remodeling.">Inactivation of Bmp4 from the Tbx1 expression domain causes abnormal pharyngeal arch artery and cardiac outflow tract remodeling.</a> Cells Tissues Organs. 193 (6), 393-403 (2011).</li><li>Zou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+of+the+third+pharyngeal+pouch+into+thymus/parathyroid+by+Six+and+Eya1.">Patterning of the third pharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1.</a> Developmental Biology. 293 (2), 499-513 (2006).</li><li>Davey, M. G., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chicken+as+a+model+for+embryonic+development.">The chicken as a model for embryonic development.</a> Cytogenetic and Genome Research. 117 (1-4), 231-239 (2007).</li><li>Nowak-sliwinska, P., Segura, T., Iruela-arispe, M. L., Angeles, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chicken+chorioallantoic+membrane+model+in+biology,+medicine+and+bioengineering.">The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering.</a> Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).</li><li>Uematsu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+in+ovo+chorioallantoic+membrane+engraftment+to+culture+testes+from+neonatal+mice.">Use of in ovo chorioallantoic membrane engraftment to culture testes from neonatal mice.</a> Comparative Medicine. 64 (4), 264-269 (2014).</li><li>Martyn, I., Kanno, T. Y., Ruzo, A., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+a+human+organizer+by+combined+Wnt+and+Nodal+signaling.">Self-organization of a human organizer by combined Wnt and Nodal signaling.</a> Nature. 558 (7708), 132-135 (2018).</li></ol>

De embryonale weefsels isolatie procedure hier is verbeterd van vorige technieken voor de productie van kwartel-kip chimeer embryo's in verschillende biologische contexten3,5,6.
Deze aanpak is geschikt voor het isoleren van pure embryonale weefsels zonder genetische manipulatie of het gebruik van weefsel-specifieke markers, die vaak onbepaald zijn, beperking van het gebruik van genetisch gemodificeerd...

In de vroege jaren 1970, werd een elegante kwartel-kip chimera-systeem ontwikkeld door Le Douarin, opening van nieuwe wegen om te begrijpen van de rol van cel migratie en cellulaire interacties tijdens ontwikkeling1,2. Het model is ontwikkeld op de vooronderstelling dat cel uitwisseling tussen de twee soorten embryogenese, later bevestigd wanneer gebruikt bij het bestuderen van tal van ontwikkelings processen, met inbegrip van de vorming van het zenuwstelsel en de hematopoietische niet aanzienlijk zou storen systemen1. De laatste als voorbeeld nemen, de cyclische golven van hematopoietische progenitorcellen koloniseren de serie epitheliale grondbeginselen werd het eerst waargenomen met behulp van de kwartel-kip chimera systeem3. Daarvoor was het toekomstige grondgebied van de zwezerik, de endoderm van de derde en vierde faryngaal zakjes (3/4PP), mechanisch en enzymatisch geïsoleerd van kwartel (q) embryo's in 15 tot 30 - Somiet stadium [embryonale dag (E) 1.5-E2.5]. Deze fasen overeen met kip, Hamburger en Hamilton4 (HH) - fasen 12-17. De isolatie procedures gestart met het gebruik van tripsine enzymatisch verwerpen de endoderm uit de bijgevoegde mesenchym. De geïsoleerde endoderm was geënt op de somatopleura-regio van een embryo van de kip (c) host op E3-E3.5 (HH-etappes 20-21). Deze heterologe mesenchym werd beschouwd als "tolerant" serie epitheel ontwikkeling ook bijdragen aan de vorming van orgel3. Daarna opeenvolgende golven van kip host bloed overgedragen voorlopercellen geïnfiltreerd de kwartel donor serie epitheliale tegenhanger bij te dragen tot thymus vorming in de host embryo3.
Meer recentelijk, een gewijzigde versie van deze aanpak werd ook bewezen als belangrijk voor de studie van epitheliale-mesenchymale interacties tijdens de vroege stadia van zwezerik vorming5. In dit opzicht waren de weefsels die betrokken zijn bij de vorming van de ectopische thymus in chimeer embryo's3 geïsoleerd, zowel van de donor- en ontvangende embryo's, en bijbehorende ex vivo. Een verbeterde protocol is gebruikt voor het isoleren van de kwartel 3/4PP endoderm (E2.5-E3) en de kip somatopleura mesoderm (E2.5-E3). Kort, embryonale weefsels werden geïsoleerd door microchirurgie en onder voorbehoud van de in vitro Pancreatine spijsvertering. Ook werden de voorwaarden van enzymatische spijsvertering, temperatuur en tijd van incubatie geoptimaliseerd volgens weefseltype en ontwikkelingsstadium (tabel 1).
Vervolgens werden de geïsoleerde weefsels geassocieerd in een organotypic in vitro systeem voor 48 h, als eerder gemeld5,6. De in vitro vereniging van weefsels bootst de lokale cellulaire interacties in het embryo, het overwinnen van enkele beperkingen van de in vivo manipulatie. Dit systeem is met name nuttig zijn te onderzoeken van cellulaire interacties in complexe morfogenisch gebeurtenissen, zoals de ontwikkeling van het faryngaal apparaat.
De bijdrage van elk weefsel in de thymus histogenesis, alsmede het vermogen van de vereniging van de heterospecific voor het genereren van een thymus kan worden verder onderzocht met behulp van de CAM methodologie, eerder gedetailleerde5,7,8. Bondig, waren de gekweekte weefsels geënt op de nok van cE8 embryo's en kunnen ontwikkelen in ovo voor 10 dagen. Thymus vorming werd vervolgens door morfologische analyse in de geoogste explantaten beoordeeld. Zoals in de klassieke studies van kwartel-kip3, werd de kwartel serie epitheel gekoloniseerd door hematopoïetische voorlopercellen (HPCs), afgeleid van het embryo van de kip, die later werd aangetoond bij te dragen tot orgel ontwikkeling9,10 . De HPCs migreerden vanuit het embryo aan de ectopische chimeer zwezerik tot en met de zeer gevacuoliseerd CAM5,7,-8. Kwartel afgeleide serie epitheel kan worden geïdentificeerd door immunohistochemistry met soortspecifieke antilichamen (dat wil zeggen, QCPN - MAb kwartel PeriNuclear), het overwinnen van de noodzaak van weefsel-specifieke moleculaire merkers.
Deze experimentele methode kunt als de aanpak in twee stappen gemeld in vorige publicatie8, u de modulering van de seingeving trajecten door regelmatige toediening van farmacologische agenten tijdens in vitro en in ovo ontwikkeling. Ook, explantaten geoogst kunnen worden op elk tijdstip van de cursus van het experiment8.
Tot slot, het protocol van de isolatie hier gedetailleerde staat het behoud van de natuurlijke eigenschappen en 3D-architectuur van embryonale weefsels, met name nuttig voor de detaillering ter plaatse van de genexpressie-patronen van embryonale gebieden anders ontoegankelijk door conventionele methoden. Transcriptome analyse benaderingen, met inbegrip van RNA-seq of microarrays, kunnen daarnaast ook worden toegepast in geïsoleerde weefsels zonder genetische tellers terwijl het verstrekken van een weefsel-specifieke hoge-doorvoer "omics" analyse.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1279px;" width="1277">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:379px;">Chicken fertilized eggs (Gallus gallus)</td>
			<td style="width:306px;">Pintobar, Portugal</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:445px;">Poultry farm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:379px;">Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix)</td>
			<td>Interaves, Portugal</td>
			<td></td>
			<td style="width:445px;">Bird farm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">15 mL PP centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430052</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">50 mL PP centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430290</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">60 x 20 mm pyrex dishes</td>
			<td>Duran group</td>
			<td style="width:149px;">21 755 41</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">100 x 20 mm pyrex dishes</td>
			<td>Duran group</td>
			<td style="width:149px;">21 755 48</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Metal grid</td>
			<td>Goodfellows</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:445px;">fine meshed&#160; stainless steel grid</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Membrane filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td style="width:149px;">DTTP01300</td>
			<td style="width:445px;">0.6 mm Isopore membrane filter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Petri dish, 35 x 10 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:149px;">P5112&#160;</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">60 x 30 mm pyrex bowls (Small size)</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:445px;">from supermarket&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">100 x 50 mm pyrex bowls (Large size)</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:445px;">from supermarket&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Transfer pipettes</td>
			<td>Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2041S</td>
			<td style="width:445px;">2 mL plastic pipet</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Glass pasteur pipette</td>
			<td>Normax</td>
			<td style="width:149px;">5426015</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Clear plastic tape</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:445px;">from supermarket&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:379px;">Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5</td>
			<td>BMA Biomedicals</td>
			<td>T-1302</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td style="width:445px;">Standart FBS</td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:379px;">Pancreatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-3292</td>
			<td style="width:445px;">Prepare a 25 mg/mL solution according to manufacturer&#39;s instructions; centrifuge and filter prior to aliquote and store at -20&#186;C. Aliquots can be kept frozen for several years.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>GIBCO, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">QCPN antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>QCPN</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement&#160;</td>
			<td>GIBCO, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>61870010</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit</td>
			<td>ELKEM/Silmid</td>
			<td>RH141001KG</td>
			<td style="width:445px;">To prepare the back base for petri dish</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">11251-30&#160;</td>
			<td style="width:445px;">Thin forceps</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Extra fine Bonn scissors, curved</td>
			<td style="width:306px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">14085-08</td>
			<td style="width:445px;">Curved scissors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Insect pins&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">26001-30</td>
			<td style="width:445px;">0.3 mm Stainless steel pin</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Micro spatula&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">10087-12</td>
			<td style="width:445px;">Transplantation spoon</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Minutien Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">26002-20</td>
			<td style="width:445px;">0.2 mm Stainless steel microscalpel</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Minutien Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">26002-10</td>
			<td style="width:445px;">0.1 mm Stainless steel microscalpel</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Moria Nickel Plated Pin Holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">26016-12</td>
			<td style="width:445px;">Nickel plated pin holder</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Moria Perforated Spoon</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">10370-17</td>
			<td style="width:445px;">Skimmer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Wecker Eye Scissor</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">15010-11</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Camera</td>
			<td>Leica Microsystems&#160;</td>
			<td style="width:149px;">MC170 HD</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems&#160;</td>
			<td style="width:149px;">DM2500</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">NanoZoomer&#160;S360 Digital&#160;slide scanner&#160;</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:149px;">C13220-01</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Stereoscope</td>
			<td>Leica Microsystems&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Leica M80</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of embryonic tissues and formation of quail-chicken chimeric organs using the thymus example

De capaciteit om te isoleren van embryonale weefsels was een essentiële stap voor de vaststelling van de kwartel-kip chimera-systeem, dat op zijn beurt heeft verstrekt onbetwiste bijdragen aan de onthulling belangrijke processen in Ontwikkelingsbiologie.
Hierin is een geoptimaliseerde manier om zich te isoleren van embryonale weefsels van kwartels en kippen door microchirurgie en enzymatische spijsvertering met behoud van de biologische eigenschappen beschreven. Na isolatie, weefsels van beide soorten zijn met elkaar verbonden in een organotypic in vitro assay voor 48 h. kwartel en kip weefsels kunnen worden gediscrimineerd door verschillende nucleaire functies en moleculaire merkers waardoor de studie voor de cellulaire cross-talk tussen heterospecific vereniging van weefsels. Deze aanpak is dus een nuttig instrument voor de studie van interacties van de complexe weefsel in ontwikkelings processen met hoogdynamische ruimtelijke wijzigingen, zoals die welke voorkomen tijdens faryngaal genuitdrukking en de vorming van de voordarm Endoderm afkomstige organen. Deze experimentele aanpak was aanvankelijk ontwikkeld om te bestuderen van de epitheliale-mesenchymale interacties tijdens de vroege stadia van de formatie van de thymus. In de prospectieve serie grondbeginselen endoderm afkomstige en mesoderm afkomstige mesenchym, werden geïsoleerd van kwartel en kip embryo's, respectievelijk.
De capaciteit van de omliggende weefsels tot organen kan verder te worden getest door ze te enten op het chorion membraan (CAM) van een embryo van de kip. De CAM biedt voedingsstoffen en gas uitwisseling aan het transplanteren weefsels. Na 10 dagen in ovo ontwikkeling, kunnen de chimeer organen in de geoogste explantaten door conventionele morfologische methodes worden geanalyseerd. Deze procedure staat ook weefsel-specifieke bijdragen tijdens orgel vorming, uit haar eerste ontwikkelen (in vitro) studeren de laatste fasen van de organogenese (in ovo ontwikkeling).
Tot slot, de verbeterde isolatie-methode biedt ook ruimtelijk (3D) bewaard embryonale weefsels, die kunnen ook worden gebruikt voor hoge resolutie topografische analyse van genexpressie-weefsel-specifieke patronen.

Het protocol gegevens een methode om te isoleren van aviaire embryonale weefsels in verschillende cellulaire en ontwikkelingsbiologie biologie technische benaderingen moeten worden gebruikt. Deze methode was eerder werkzaam te bestuderen van epitheliale-mesenchymale interacties tijdens de vroege stadia van zwezerik vorming5. Hierin worden nieuwe resultaten getoond in Figuur 1 en Figuur 2, met behulp van so...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Embryonic Tissues and Formation of Quail-Chicken Chimeric Organs Using The Thymus Example at JoVE.com

Isolation of Embryonic Tissues and Formation of Quail-Chicken Chimeric Organs Using The Thymus Example

Dit artikel bevat een methode voor het isoleren van pure embryonale weefsels van kwartel en kip embryo's die kunnen worden samengevoegd tot ex vivo chimeer organen.

Isolatie van embryonale weefsels en vorming van kwartel-kip chimeer organen met behulp van het voorbeeld van de Thymus

The capacity to isolate embryonic tissues was an essential step for establishing the quail-chicken chimera system, which in turn has provided undisputed ...

Het algemene doel van deze procedure is om een geoptimaliseerde experimentele aanpak te presenteren om embryonale weefsels te isoleren van de kwartel- en kippenembryo's. Met deze techniek verkrijgen we zuivere embryonale weefsels die kunnen worden gebruikt in genexpressiestudies en functionele testen. Weefsels van kwartel en kippenembryo's worden geïsoleerd door microchirurgie en onderworpen aan in vitro enzymatische spijsvertering met behoud van de biologische eigenschappen.Na isolatie kunnen de driedimensionale geconserveerde weefsels worden gebruikt voor analyse van topografische genexpressiepatronen met hoge resolutie. Deze aanpak is vooral nuttig voor het detailleren van in situ genexpressie in embryonale gebieden die anders ontoegankelijk zijn door conventionele methoden. Bovendien kunnen transcriptome-analysebenaderingen ook worden toegepast in geïsoleerde weefsels zonder dat genetische markers nodig zijn, terwijl een weefselspecifieke hoge doorvoeromputanalyse wordt geboden.Als alternatief kunnen de geïsoleerde weefsels van beide soorten gedurende 48 uur worden geassocieerd in een in vitro organotypic test. Deze aanpak maakt het mogelijk om weefsels interacties te bestuderen, omdat kwartel en kippencellen kunnen worden gediscrimineerd door verschillende nucleaire kenmerken en moleculaire markers. De capaciteit van de kweekweefsels om organen te vormen kan verder worden getest door in ovo-test.Deze methode is daarom een nuttig hulpmiddel voor het bestuderen van complexe weefselinteracties in ontwikkelingsprocessen met zeer dynamische ruimtelijke modificaties en kan ook helpen om het potentieel van specifieke embryonale gebieden aan de vorming van organen te onthullen. Als voorbeeld wordt hierin de vorming van kwartelkip chimerische thymus uit geïsoleerde embryonale weefsels beschreven. Ten eerste, de endoderm van de derde en vierde faryngeale zakjes, de toekomstige thymische rudiment is geïsoleerd van de faryngeale regio van kwartel embryo's met drie dagen van ontwikkeling.Vervolgens wordt dit weefsel geassocieerd met een mesenchyme dat in staat is de ontwikkeling ervan te ondersteunen, het somatopleura mesoderm. Ten slotte is de heterospecifieke associatie van weefsels gekweekt in vitro en in ovo om een chimerische thymus te vormen. Voer alle eimanipulatieprocedures uit in steriele omstandigheden met behulp van een horizontale laminaire stroomkap en gesteriliseerde instrumenten en materialen.Bevruchte kwarteleieren werden geïncubeerd met de luchtkamer naar boven gericht. Om te beginnen, verwijder de kwarteleieren uit de couveuse. Bereid een grote borosilicaat glazen kom gevuld met koude PBS.Met een gebogen schaar, tik en snijd een cirkelvormig gat in de schelp van een kwartelei met drie dagen van incubatie. Maak het gat in de andere kant van het ei stomp, en breng de dooier naar de kom met koude PBS. Verwijder het embryo uit de dooier door het vitelline membraan extern te snijden naar extraembryonische vaten.Breng het embryo met behulp van dunne tangen over op een kommetje gevuld met koude PBS en verplaats het embryo vervolgens naar een petrischaaltje met zwarte basis met een skimmer. Verwijder de faryngeale regio met de derde en vierde faryngeale zakjes zoals beschreven in de vorige Jove SPA ligatie. Breng vervolgens het derde en vierde faryngeale booggebied over op een glas dat een uur lang is gevuld met koude pancrea en incubeer, op ijs, voor enzymatische spijsvertering.Merk op dat de incubatietijd van enzymatische spijsvertering afhankelijk is van het ontwikkelingsstadium. Plaats de glazen schaal onder de stereomicroscoop en isoleer het endoderm van het derde en vierde faryngeale booggebied, met behulp van twee micro-scalpel in een houder. Plaats eerst het faryngeale gebied met de rugzijde omhoog, die intern het endoderm en ectoderm in de externe oppervlakte toont.Observeer het ectoderm, endoderm, mesenchyme, hartbuis en ventrale gedeelte van de neurale buis. Verwijder de neurale buis en het mesoderm aan het dorsale oppervlak van het faryngeale endoderm. Observeer de endoderm van de keelholte, de vierde en derde faryngeale zakjes en de hartbuis.Met de rugzijde omhoog, voorzichtig los en verwijder de mesenchyme tussen de faryngeale bogen en bloot de faryngeale zakjes. Voer deze procedure uit aan de andere kant van het faryngeale gebied. Verwijder de mesenchyme bevestigd aan het meest achterste deel van het endoderm en observeer het vierde faryngeale zakje.Met achterste kant omhoog, observeren zowel links als rechts vierde faryngeale zakjes. Ga verder door het verwijderen van de mesenchyme bevestigd aan het meest achterste deel van het endoderm en aan de tweede zak. Verwijder de hartbuis en de mesenchyme rond de binnenzakjes.Met de ventrale kant omhoog, observeer de keelholte endoderm, en de rechterkant van de tweede faryngeale boog. In dit stadium moet het endoderm van de schildklier rudiment zichtbaar zijn. Maak de ectoderm van de tweede en derde faryngeale bogen los en verwijder voorzichtig het mesenchyme van de bogen.Observeer de verwijdering van het mesenchyme van de tweede faryngeale boog aan de rechterkant. Let op de locatie van de vierde en derde zakjes en schildklier rudiment. Verwijder de resten aan mesenchymale cellen die aan de keelholtezakjes worden vastgehefd.Let op de derde en vierde zak van de rechterkant en het vierde zakje aan de linkerkant. Herhaal de mesenchyme detachement van de linkerkant. Let nu op het derde zakje van de linkerkant.Observeer mesenchyme detachement van de tweede boog aan de linkerkant. Houd er rekening mee dat alle oppervlakken en oplossingen tijdens deze procedure koud moeten worden gehouden. Verander in een nieuwe koude pancreatine oplossing en schotel in het geval van het nemen van een lange tijd om de weefsels te ontleden.Tot slot, maak een transversale snede tussen de tweede en derde faryngeale zakjes om de tweede zakjes en de schildklier rudiment te verwijderen. Op dit punt bestaat het geïsoleerde endoderm uit de derde en vierde faryngeale zakjes en het achterste puntje van de keelholte. Verwijder de resten los mesenchyme met behulp van twee micro-scalpels.Breng het geïsoleerde endoderme over in een glazen schaal gevuld met koud foetaal runderserum en houd het tijdens de bereiding van de in vitro-test op ijs. Eieren werden geplaatst in horizontale positie en de bovenzijde gemarkeerd voor het gebruik van een houtskool. Om te beginnen, verwijder de eieren uit de couveuse.Met een gebogen schaar, open een klein gaatje in de schelp, steek een naald, en aspirate twee milliliter albumine met een 10 milliliter spuit. Open een cirkelvormig gat in het gemarkeerde gebied van de schelp en snijd het vitelline membraan extern naar de extra embryonale vaten terwijl u het embryo met dunne tangen vasthoudt. Plaats het embryo onder een stereomicroscoop in een petrischaaltje met zwarte basis met koude PBS.Gebruik vier insectenspelden om het embryo op de bodem van de plaat te houden. Plaats de pinnen in het extraembryonische gebied dat een vierkante vorm vormt. Voer twee sneden uit tussen de somites 19 en 24 transversaal naar de embryo-as en het oversteken van het embryo.Laat deze sectie los door de marginale embryonale randen te snijden. Observeer de laterale plaat, neurale buis en somites. Aspirate en breng de weefsels naar een glazen schaal gevuld met koude pancreain.Incubeer gedurende 30 minuten op ijs voor enzymatische spijsvertering. Onder de stereomicroscoop isoleert u het mesoderme van de omliggende weefsels met behulp van twee microscals in houders. Observeer de somatopleura mesoderm, de splanchnopleura, neurale buis, en ectoderm.Verwijder eerst het ectoderm aan het oppervlak. Observeer de somatopleura mesoderm gescheiden van het ectoderm. Maak vervolgens voorzichtig de ventrally splanchnopleura los van de somatopleura.Observeer de juiste laterale mesoderm van de somatopleura. Laat het los door het in een parallelle beweging naar de neurale buis te snijden. Houd er rekening mee dat alle oppervlakken en oplossingen tijdens deze procedure koud moeten worden gehouden.Verander in een nieuwe koude pancreatine oplossing en schotel in het geval van het nemen van een lange tijd om de weefsels te ontleden. Observeer de linker laterale mesoderm van de somatopleura, somites, neurale buis, en ectoderm. Herhaal de mesoderm release van deze kant.Maak langzame bewegingen met de micro-scalpel. De blootgestelde extracellulaire matrix eiwitten zitten door weefsels en instrumenten, het voorkomen van vloeiende bewegingen. Snijd de somatopleura voorzichtig in een parallelle beweging naar de neurale buis.Breng het geïsoleerde mesoderme over in een glazen schaal gevuld met koud foetaal runderserum en houd het op ijs tijdens de bereiding van in vitro test. Plaats een fijn gemeshed metalen rooster in een petrischaaltje en vul met cultuurmedium. Verwijder de overtollige vloeistoffen om het medium oppervlak te nivelleren met de bovenkant van het rooster.Met behulp van dunne tangen dompelt u een membraanfilter in het kweekmedium en plaatst u het voorzichtig op de bovenkant van het rooster om een oppervlak met haar in contact te hebben. Breng onder de stereomicroscoop het geïsoleerde endoderm van de glazen schaal naar het membraanfilter door voorzichtig te glijden met behulp van spatel en dunne tangen. Herhaal deze procedure voor het geïsoleerde mesoderm.Met behulp van een micro-scalpel, meng de weefsels om het associatie te maximaliseren. Plaats de bijbehorende weefsels voorzichtig in een bevochtigde couveuse op 37 graden met 5% CO2 gedurende 48 uur. Na de incubatietijd, graf de kweekweefsels op het coriolan type membraan en laat het zich ontwikkelen in ovaal voor verdere 10 dagen om orgaanvorming te voltooien zoals eerder beschreven.Hier is de reticulaire methode die het mogelijk maakt de isolatie van aviaire embryonale weefsels worden gebruikt in verschillende experimentele benaderingen. Als voorbeeld, de expressie van genen waarvan bekend is dat betrokken zijn bij de vorming van de faryngeale zakjes werden ook geëvalueerd een geïsoleerd endoderm met de tweede, derde en vierde faryngeale zakjes van kippen embryo's op embryonale dag drie en een half door hele mount in situ hybridisatie. De uitdrukking van Sonic Hedgehog werd gedetecteerd in het endoderm van de centrale keelholte en uitgesloten van de zakjes, terwijl BMP7 werd uitgedrukt in de endoderm van de tweede en derde faryngeale zakjes en uitgesloten van de centrale farynx en vierde faryngeale zak.Geïsoleerde weefsels kunnen ook worden vitro specifiek geassocieerd in vitro voor 48 uur, graft op de coriolan type membraan, en mag ontwikkelen voor verdere 10 dagen. Explants kunnen worden geanalyseerd door conventionele histologie en immunohistochemie. Enkele representatieve resultaten van de associatie van kwartel endoderm uit de derde en vierde faryngeale zakjes met kip somatopleura mesoderm zijn de volgende-Grafts toonde een volledig gevormde chimerische thymus met kwartel afgeleid thymische epitheliale cellen positief voor QCPN en kip lymfecellen.Bovendien vertoonde cytokeratine positief thymisch epitheel normale morfologische kenmerken, met een typische reticulaire architectuur. Na het bekijken van deze video, moet u een goed begrip hebben hoe kwartel en kip embryonale weefsels die kunnen worden gebruikt in genexpressie studies te isoleren en door de vorming van chimeric organen kan ook helpen ontcijferen van de complexiteit van orgaan genetica.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profilering van<em&gt; In-Vivo</em&gt; Geproduceerd Bovine Pre-implantatie embryo&#39;s met behulp van twee-kleuren Microarray Platform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Epigenetische regulatie van Cardiac Differentiatie van embryonale stamcellen en weefsels

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues

Isolatie en differentiatie van vetcellen afgeleide stamcellen uit Porcine Onderhuids vetweefsel

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

Isolatie van muizen embryonale Hemogenic endotheelcellen

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

Cultuur van muizen embryonale Middenvoetsbeentjes: Een Fysiologische Model van endochondrale Verbening

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

Protocollen voor het visualiseren steroidogenic organen en hun Interactive Organen met Immunokleuring in de fruitvlieg<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Met behulp van In Vivo en weefsel en cel Explant benaderingen te bestuderen van de voedselproductie en de pathogenese van de embryonale en perinatale Aorta

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic ...

Two-step Approach to Explore Early- and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm

De aanpak in twee stappen om te verkennen van de vroege - en Late-stadia van de vorming van het orgel in de aviaire Model: de zwezerik en de bijschildklier klieren organogenese paradigma

The avian embryo, as an experimental model, has been of utmost importance for seminal discoveries in developmental biology. Among several approaches, the ...

Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

Driedimensionale Organotypic culturen van vestibulaire en auditieve zintuigen

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...

A Familial Hypercholesterolemia Human Liver Chimeric Mouse Model Using Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocytes

Een familiale hypercholesterolemie menselijke lever chimeer muismodel met behulp van geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige hepatocyten

Familial hypercholesterolemia (FH) is mostly caused by low-density lipoprotein receptor (LDLR) mutations and results in an increased risk of early-onset ...