Name: isolation of embryonic tissues and formation of quail-chicken chimeric organs using the thymus example
Uploaded: 2019-02-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Embryonic Tissues and Formation of Quail-Chicken Chimeric Organs Using The Thymus Example at JoVE.com

Les auteurs sont reconnaissants à Isabel Alcobia pour la lecture critique du manuscrit, Mário Henriques de narration vidéo et Vitor Proa auprès du Service d’histologie de l’Instituto de Histologia e Biologia do Desenvolvimento, Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa, pour le support technique. Nous sommes particulièrement redevables à Paulo Caeiro et Hugo Silva de l’Unidade de audiovisuais (unité de l’audiovisuel), Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa pour leur engagement exceptionnel en faveur de la production de cette vidéo. Nous reconnaissons Leica Microsystems pour aimablement un stéréoscope équipé d’un système vidéo et de Interaves - Sociedade Agro-Pecuária, S.A de contribuer avec caille fécondés. Ce travail a été soutenu par Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).

Toutes ces expériences suivent les soins aux animaux et les lignes directrices éthiques de la Centro Académico de Medicina de Lisboa.
1. fécondés d’incubation des oeufs de caille et poulet
<ol><li>Place fertilisé des oeufs de caille japonaise (Coturnix japonica coturnix) dans un incubateur humidifié à 38 ° C pendant 3 jours. Incuber les œufs (extrémité émoussée oeuf) vers le haut dans la chambre à air. Remarque : L’environnement humidifié est réalisé en pla...

<ol>
	<li>Le Douarin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nogent+Institute--50+years+of+embryology.">The Nogent Institute--50 years of embryology.</a> The International Journal of Developmental Biology. 49 (2-3), 85-103 (2005).</li><li>Le Douarin, N. M., Teillet, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+migration+of+neural+crest+cells+to+the+wall+of+the+digestive+tract+in+avian+embryo.">The migration of neural crest cells to the wall of the digestive tract in avian embryo.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 30 (1), 31-48 (1973).</li><li>Le Douarin, N. M., Jotereau, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+of+cells+of+the+avian+thymus+through+embryonic+life+in+interspecific+chimeras.">Tracing of cells of the avian thymus through embryonic life in interspecific chimeras.</a> Journal of Experimental Medicine. 142 (1), 17-40 (1975).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.+1951.">A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951.</a> Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).</li><li>Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Bmp4+signalling+in+the+epithelial-mesenchymal+interactions+that+take+place+in+early+thymus+and+parathyroid+development+in+avian+embryos.">Modulation of Bmp4 signalling in the epithelial-mesenchymal interactions that take place in early thymus and parathyroid development in avian embryos.</a> Developmental Biology. 361 (2), 208-219 (2012).</li><li>Takahashi, Y., Bontoux, M., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelio--mesenchymal+interactions+are+critical+for+Quox+7+expression+and+membrane+bone+differentiation+in+the+neural+crest+derived+mandibular+mesenchyme.">Epithelio--mesenchymal interactions are critical for Quox 7 expression and membrane bone differentiation in the neural crest derived mandibular mesenchyme.</a> Embo Journal. 10 (9), 2387-2393 (1991).</li><li>Figueiredo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+and+Hedgehog+in+the+thymus/parathyroid+common+primordium:+Crosstalk+in+organ+formation.">Notch and Hedgehog in the thymus/parathyroid common primordium: Crosstalk in organ formation.</a> Developmental Biology. 418 (2), 268-282 (2016).</li><li>Figueiredo, M., Neves, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+Approach+to+Explore+Early-and+Late-stages+of+Organ+Formation+in+the+Avian+Model:+The+Thymus+and+Parathyroid+Glands+Organogenesis+Paradigm+Video+Link.">Two-step Approach to Explore Early-and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm Video Link.</a> Journal of Visualuzed Experiments. , (2018).</li><li>Nehls, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+genetically+separable+steps+in+the+differentiation+of+thymic+epithelium.">Two genetically separable steps in the differentiation of thymic epithelium.</a> Science (New York, N.Y.). 272 (5263), 886-889 (1996).</li><li>Morahan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nu+gene+acts+cell-autonomously+and+is+required+for+differentiation+of+thymic+epithelial+progenitors.">The nu gene acts cell-autonomously and is required for differentiation of thymic epithelial progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (12), 5742-5746 (1996).</li><li>Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DiGeorge+syndrome+phenotype+in+mice+mutant+for+the+T-box+gene,+Tbx1.">DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1.</a> Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).</li><li>Nie, X., Brown, C. B., Wang, Q., Jiao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+Bmp4+from+the+Tbx1+expression+domain+causes+abnormal+pharyngeal+arch+artery+and+cardiac+outflow+tract+remodeling.">Inactivation of Bmp4 from the Tbx1 expression domain causes abnormal pharyngeal arch artery and cardiac outflow tract remodeling.</a> Cells Tissues Organs. 193 (6), 393-403 (2011).</li><li>Zou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+of+the+third+pharyngeal+pouch+into+thymus/parathyroid+by+Six+and+Eya1.">Patterning of the third pharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1.</a> Developmental Biology. 293 (2), 499-513 (2006).</li><li>Davey, M. G., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chicken+as+a+model+for+embryonic+development.">The chicken as a model for embryonic development.</a> Cytogenetic and Genome Research. 117 (1-4), 231-239 (2007).</li><li>Nowak-sliwinska, P., Segura, T., Iruela-arispe, M. L., Angeles, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chicken+chorioallantoic+membrane+model+in+biology,+medicine+and+bioengineering.">The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering.</a> Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).</li><li>Uematsu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+in+ovo+chorioallantoic+membrane+engraftment+to+culture+testes+from+neonatal+mice.">Use of in ovo chorioallantoic membrane engraftment to culture testes from neonatal mice.</a> Comparative Medicine. 64 (4), 264-269 (2014).</li><li>Martyn, I., Kanno, T. Y., Ruzo, A., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+a+human+organizer+by+combined+Wnt+and+Nodal+signaling.">Self-organization of a human organizer by combined Wnt and Nodal signaling.</a> Nature. 558 (7708), 132-135 (2018).</li></ol>

La technique d’isolation de tissu embryonnaire détaillée ici a été améliorée depuis les précédentes techniques pour produire des embryons chimériques caille-poulet dans différents contextes biologique3,5,6.
Cette approche consiste d’isoler des tissus embryonnaires pures sans nécessiter de manipulation génétique ou l’utilisation de marqueurs spécifiques des tissus, qui sont souvent ...

Dans les années 1970, un système élégant caille-poulet chimère a été développé par Le Douarin, ouvrant de nouvelles pistes pour comprendre le rôle de la migration cellulaire et interactions cellulaires au cours du développement1,2. Le modèle a été conçu en partant du principe qu’échange de cellules entre les deux espèces ne perturberait pas significativement l’embryogenèse, confirmé plus tard lorsqu’il est utilisé pour étudier les nombreux processus de développement, y compris la formation du système nerveux et le hématopoïétique systèmes de1. Prendre ce dernier à titre d’exemple, les vagues cycliques de progéniteurs hématopoïétiques qui colonisent le rudiment épithélial thymique fut observée à l’aide de la chimère de la caille-poulet système3. Pour cela, le territoire prospectif du thymus, l’endoderme des troisième et quatrième du pharyngés sachets (3/4PP), a été isolé mécaniquement et enzymatiquement embryons de caille (q) de 15 à 30 - stade de segments [1,5-E2.5 jour embryonnaire (E)]. Ces trois phases correspondent au poulet Hamburger et Hamilton4 (HH) - étapes 12-17. Les procédures d’isolement a commencé avec l’utilisation de trypsine enzymatiquement dissocier l’endoderme du mésenchyme ci-joint. L’endoderme isolé a été greffé dans la région de somatopleura d’un embryon de poulet (c) hôte à E3-E3.5 (HH-étapes 20 et 21). Ce mésenchyme hétérologue était considéré comme « permissive » au développement de l’épithélium thymique contribuant également à l’orgue formation3. Par la suite, des vagues successives de cellules progénitrices véhiculés par le sang de poulet hôtes infiltré la caille donneur thymiques épithéliales homologue contribuant à la formation du thymus chez l’hôte embryon3.
Plus récemment, une version modifiée de cette approche s’est avérée aussi important pour étudier les interactions épithéliale-mésenchymateuse durant le début de la formation de thymus5. À cet égard, les tissus impliqués dans la formation du thymus ectopique dans les embryons chimères3 ont été isolés, tous deux provenant d’embryons de donneurs et hôte et associés ex vivo. Un protocole amélioré a permis d’isoler l’endoderme 3/4PP de caille (E2.5-E3) et le mésoderme somatopleura de poulet (E2.5-E3). Brièvement, les tissus embryonnaires ont été isolées par microchirurgie et sous réserve de la digestion in vitro pancréatine. Aussi, les conditions de la digestion enzymatique, température et temps d’incubation ont été optimisées selon les tissus-type et le stade de développement (tableau 1).
Ensuite, les tissus isolés étaient associés dans un organotypique système in vitro pendant 48 h, comme indiqué précédemment5,6. L’association in vitro de tissus imite les interactions cellulaires les dans l’embryon, de surmonter certaines restrictions de la manipulation in vivo. Ce système est particulièrement utile pour étudier les interactions cellulaires dans les événements morphogène complexes, comme le développement de l’appareil pharyngien.
La contribution de chacun des tissus dans l’histogenèse du thymus, ainsi que la capacité de l’association hétérospécifiques pour générer un thymus peut être davantage explorés en utilisant la méthodologie de CAM, précédemment détaillées5,7,8. Succinctement, les tissus cultivés ont été greffés sur la came d’embryons cE8 et laissés se développer en ovo pendant 10 jours. Ensuite, la formation du thymus a été évaluée par analyse morphologique dans les explants récoltés. Comme dans les études classiques de caille-poulet3, l’épithélium thymique caille a été colonisée par les cellules progénitrices hématopoïétiques (HPCs) provenant de l’embryon de poulet, qui s’est avéré plus tard contribuer à orgue développement9,10 . Les bactéries hétérotrophes ont migré de l’embryon vers le thymus chimérique ectopique à le fortement vascularisé CAM5,7,8. Caille épithélium thymique dérivée peut être identifié par immunohistochimie à l’aide d’anticorps spécifiques à l’espèce (c'est-à-dire, QCPN - MAb caille périnucléaire), surmontant le besoin de marqueurs moléculaires spécifiques des tissus.
Cette méthode expérimentale, comme l’approche en deux étapes dans la précédente publication8, permet la modulation des voies de signalisation par l’administration régulière d’agents pharmacologiques pendant in vitro et dans le développement d’ovo. En outre, des explants peuvent être récoltées en tout temps-point du cours de l’expérience de8.
Enfin, le protocole détaillé ici permet la préservation des propriétés naturelles et 3D-architecture des tissus embryonnaires, particulièrement utiles pour détailler les modèles d’expression génique in situ des territoires embryonnaires autrement inaccessibles par méthodes conventionnelles. En outre, transcriptome analysis approches, y compris les RNA-seq ou microarrays, peuvent également être appliquées dans les tissus isolés sans nécessiter de marqueurs génétiques tout en fournissant une analyse de « omiques » de tissu-spécifiques à haut débit.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1279px;" width="1277">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:379px;">Chicken fertilized eggs (Gallus gallus)</td>
			<td style="width:306px;">Pintobar, Portugal</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:445px;">Poultry farm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:379px;">Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix)</td>
			<td>Interaves, Portugal</td>
			<td></td>
			<td style="width:445px;">Bird farm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">15 mL PP centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430052</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">50 mL PP centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430290</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">60 x 20 mm pyrex dishes</td>
			<td>Duran group</td>
			<td style="width:149px;">21 755 41</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">100 x 20 mm pyrex dishes</td>
			<td>Duran group</td>
			<td style="width:149px;">21 755 48</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Metal grid</td>
			<td>Goodfellows</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:445px;">fine meshed&#160; stainless steel grid</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Membrane filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td style="width:149px;">DTTP01300</td>
			<td style="width:445px;">0.6 mm Isopore membrane filter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Petri dish, 35 x 10 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:149px;">P5112&#160;</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">60 x 30 mm pyrex bowls (Small size)</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:445px;">from supermarket&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">100 x 50 mm pyrex bowls (Large size)</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:445px;">from supermarket&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Transfer pipettes</td>
			<td>Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2041S</td>
			<td style="width:445px;">2 mL plastic pipet</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Glass pasteur pipette</td>
			<td>Normax</td>
			<td style="width:149px;">5426015</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Clear plastic tape</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:445px;">from supermarket&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:379px;">Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5</td>
			<td>BMA Biomedicals</td>
			<td>T-1302</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td style="width:445px;">Standart FBS</td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:379px;">Pancreatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-3292</td>
			<td style="width:445px;">Prepare a 25 mg/mL solution according to manufacturer&#39;s instructions; centrifuge and filter prior to aliquote and store at -20&#186;C. Aliquots can be kept frozen for several years.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>GIBCO, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">QCPN antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>QCPN</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement&#160;</td>
			<td>GIBCO, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>61870010</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit</td>
			<td>ELKEM/Silmid</td>
			<td>RH141001KG</td>
			<td style="width:445px;">To prepare the back base for petri dish</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">11251-30&#160;</td>
			<td style="width:445px;">Thin forceps</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Extra fine Bonn scissors, curved</td>
			<td style="width:306px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">14085-08</td>
			<td style="width:445px;">Curved scissors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Insect pins&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">26001-30</td>
			<td style="width:445px;">0.3 mm Stainless steel pin</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Micro spatula&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">10087-12</td>
			<td style="width:445px;">Transplantation spoon</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Minutien Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">26002-20</td>
			<td style="width:445px;">0.2 mm Stainless steel microscalpel</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Minutien Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">26002-10</td>
			<td style="width:445px;">0.1 mm Stainless steel microscalpel</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Moria Nickel Plated Pin Holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">26016-12</td>
			<td style="width:445px;">Nickel plated pin holder</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Moria Perforated Spoon</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">10370-17</td>
			<td style="width:445px;">Skimmer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Wecker Eye Scissor</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">15010-11</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Camera</td>
			<td>Leica Microsystems&#160;</td>
			<td style="width:149px;">MC170 HD</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems&#160;</td>
			<td style="width:149px;">DM2500</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">NanoZoomer&#160;S360 Digital&#160;slide scanner&#160;</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:149px;">C13220-01</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Stereoscope</td>
			<td>Leica Microsystems&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Leica M80</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of embryonic tissues and formation of quail-chicken chimeric organs using the thymus example

La capacité d’isoler les tissus embryonnaires constituait une étape essentielle pour établir le système de caille-poulet chimère, qui à son tour a contribué incontesté au dévoilement des processus clés en biologie du développement.
Dans les présentes est décrit une méthode optimisée pour isoler des tissus embryonnaires de cailles et de poulets par la microchirurgie et la digestion enzymatique tout en conservant ses propriétés biologiques. Après l’isolement, les tissus de ces deux espèces sont associés lors d’un test in vitro organotypique pendant 48 h. caille et tissus de poulet peuvent être distinguées par caractéristiques nucléaires distinctes et des marqueurs moléculaires permettant l’étude de la diaphonie cellulaire entre hétérospécifiques association des tissus. Cette approche est donc un outil utile pour étudier les interactions de tissu complexe dans le processus de développement avec des modifications spatiales très dynamiques, telles que celles survenant au cours de la morphogénèse du pharynx et de la formation de l’intestin antérieur organes dérivés endoderme. Cette approche expérimentale a été développée afin d’étudier les interactions épithéliale-mésenchymateuse durant le début de la formation du thymus. À cet égard, l’endoderme dérivés de prospective rudiment thymique et dérivés mesoderm mésenchyme, ont été isolés des embryons de caille et de poulet, respectivement.
La capacité des tissus associés à produire des organes peut être analysée plus loin en leur greffant sur la membrane Chorio-(CAM) d’un embryon de poulet. La came fournit des nutriments et permet les échanges gazeux dans les tissus explantés. Après 10 jours de développement ovo, les organes chimériques peuvent être analysés dans les explants récoltés par les méthodes morphologiques classiques. Cette procédure permet également étudier des contributions spécifiques des tissus au cours de la formation des organes, de ses initial (développement in vitro) pour la phase finale de l’organogenèse (en développement ovo).
Enfin, la méthode d’isolation améliorée fournit également en trois dimensions (3D) préserver les tissus embryonnaires, qui peuvent également être utilisés pour une analyse topographique haute résolution des modèles d’expression génique spécifique aux tissus.

Le protocole décrit une méthode pour isoler les tissus embryonnaires aviaires pour être utilisé dans plusieurs approches de techniques de biologie cellulaire et du développement. Cette méthode a été précédemment employée pour étudier les interactions épithéliale-mésenchymateuse durant les premiers stades de formation de thymus5. Dans les présentes, nouveaux résultats sont indiqués dans la Figure 1 et <strong class="xf...

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Isolation of Embryonic Tissues and Formation of Quail-Chicken Chimeric Organs Using The Thymus Example

Cet article fournit une méthode pour isoler les tissus embryonnaires pures de caille et poulet des embryons qui peuvent être combinés pour former ex vivo organes chimérique.

Isolement des tissus embryonnaires et la Formation des organes chimériques caille-poulet à l’aide de l’exemple du Thymus

The capacity to isolate embryonic tissues was an essential step for establishing the quail-chicken chimera system, which in turn has provided undisputed ...

L’objectif global de cette procédure est de présenter une approche expérimentale optimisée pour isoler les tissus embryonnaires des embryons de caille et de poulet. Avec cette technique, nous obtenons des tissus embryonnaires purs qui peuvent être utilisés dans les études d’expression génétique et les analyses fonctionnelles. Les tissus des embryons de caille et de poulet sont isolés par microchirurgie et sujets à une digestion enzymatique in vitro tout en préservant ses propriétés biologiques.Après isolement, les tissus préservés tridimensionnels peuvent être utilisés pour l’analyse des modèles d’expression topographique à haute résolution des gènes. Cette approche est particulièrement utile pour détailler l’expression in situ des gènes dans les territoires embryonnaires autrement inaccessibles par les méthodes conventionnelles. En outre, les approches d’analyse transcriptome peuvent également être appliquées dans les tissus isolés sans nécessiter de marqueurs génétiques, tout en fournissant une analyse omique à haut débit spécifique aux tissus.Alternativement, les tissus isolés des deux espèces peuvent être associés dans un essai organotypique in vitro pendant 48 heures. Cette approche permet d’étudier les interactions tissulaires, puisque les cellules de caille et de poulet peuvent être discriminées par des caractéristiques nucléaires distinctes et des marqueurs moléculaires. La capacité des tissus de culture à former des organes peut être encore testée par assay ovo.Cette méthode est donc un outil utile pour étudier les interactions tissulaires complexes dans les processus de développement avec des modifications spaciales très dynamiques et peut également aider à révéler le potentiel de territoires embryonnaires spécifiques à la formation d’organes. À titre d’exemple, on décrit ci-après la formation du thymus chimérique caille-poulet à partir de tissus embryonnaires isolés. Tout d’abord, l’endoderm des troisième et quatrième poches pharyngéales, le rudiment thymique potentiel est isolé de la région pharyngéale des embryons de caille avec trois jours de développement.Ensuite, ce tissu est associé à un mésenchyme capable de soutenir son développement, le mésoderm somatopleura. Enfin, l’association hétérospécifique des tissus est cultivé in vitro et in ovo pour former un thymus chimérique. Effectuez toutes les procédures de manipulation des œufs dans des conditions stériles à l’aide d’une hotte d’écoulement laminaire horizontale et d’instruments et de matériaux stérilisés.Des oeufs fertilisés de caille ont été incubés avec la chambre d’air faisant face vers le haut. Pour commencer, retirer les œufs de caille de l’incubateur. Préparer un grand bol en verre borosilicate rempli de PBS froid.À l’aide de ciseaux incurvés, appuyez sur et coupez un trou circulaire dans la coquille d’un œuf de caille avec trois jours d’incubation. Faire le trou dans le côté opposé de l’œuf émoussé, et transférer le jaune dans le bol avec pbs froid. Retirer l’embryon du jaune en coupant la membrane vitelline à l’extérieur aux vaisseaux extraembryoniques.À l’aide de forceps minces, transférer l’embryon dans un petit bol rempli de PBS froid, puis déplacer l’embryon dans une boîte de Pétri à base noire avec un écumoire. Enlevez la région pharyngéale contenant les troisième et quatrième sachets pharyngéels comme décrit dans la ligature précédente de SPA de Jove. Ensuite, transférez la troisième et quatrième région de l’arc pharyngeal dans un verre rempli de pancréatine froide et incubez pendant une heure, sur la glace, pour une digestion enzymatique.Notez que la période d’incubation de la digestion enzymatique dépend du stade de développement. Placez le plat en verre sous le microscope stéréo et isolez l’endoderm de la troisième et quatrième région de l’arc pharyngeal, à l’aide de deux micro-scalpel dans un support. Placez d’abord la région pharyngéale avec le côté dorsal vers le haut, montrant intérieurement l’endoderm et l’ectoderm dans la surface externe.Observez l’ectoderm, l’endoderm, le mésenchyme, le tube cardiaque et la partie ventrale du tube neural. Retirez le tube neural et le mésoderm fixé à la surface dorsale de l’endoderm pharyngéal. Observez l’endoderm du pharynx, les quatrième et troisième poches pharyngéales, et le tube cardiaque.Avec le côté dorsal vers le haut, détachez soigneusement et enlevez le mesenchyme entre les arcs pharyngeal et exposez les poches pharyngeal. Effectuez cette procédure de l’autre côté de la région pharyngéale. Retirez le mesenchyme attaché à la partie la plus postérieure de l’endoderm et observez la quatrième poche pharyngéale.Avec le côté postérieur vers le haut, observez les poches pharyngeal de quatrième gauche et droite. Continuer en enlevant le mésenchyme attaché à la partie la plus postérieure de l’endoderm et à la deuxième poche. Retirer le tube cardiaque et le mesenchyme entourant les poches intérieures.Avec le côté ventral vers le haut, observez l’endoderm de pharynx, et le côté droit du deuxième arc pharyngeal. À ce stade, l’endoderm du rudiment thyroïdien doit être visible. Détachez l’ectoderme des deuxième et troisième arcs pharyngéels et retirez soigneusement le mésenchyme des arcs.Observez l’enlèvement du mesenchyme du deuxième arc pharyngeal sur le côté droit. Notez l’emplacement des quatrième et troisième poches et rudiment thyroïdien. Enlever les restes aux cellules mésenchymales attachées aux poches pharyngéales.Observez les troisième et quatrième pochettes du côté droit et la quatrième poche du côté gauche. Répétez le détachement mesenchyme du côté gauche. Observez maintenant la troisième poche du côté gauche.Observez le détachement mesenchyme de la deuxième arche sur le côté gauche. Notez que toutes les surfaces et solutions doivent être maintenues au froid pendant cette procédure. Passer à une nouvelle solution de pancréatine froide et plat en cas de prendre beaucoup de temps pour disséquer les tissus.Enfin, faire une coupe transversale entre la deuxième et la troisième poches pharyngéales pour enlever les deuxièmes poches et le rudiment thyroïdien. À ce stade, l’endoderm isolé est composé des troisième et quatrième poches pharyngéales et de la pointe postérieure du pharynx. Retirer les restes détachés mesenchyme à l’aide de deux micro-scalpels.Transférer l’endoderme isolé dans un plat en verre rempli de sérum bovin fœtal froid et le garder sur la glace pendant la préparation de l’essai in vitro. Les oeufs ont été placés en position horizontale et le côté supérieur marqué pour l’utilisation d’un charbon de bois. Pour commencer, retirer les œufs de l’incubateur.À l’aide d’un ciseaux incurvé, ouvrir un petit trou dans la coquille, insérer une aiguille et aspirer deux millilitres d’albumine à l’aide d’une seringue de 10 millilitres. Ouvrez un trou circulaire dans la région marquée de la coquille et coupez la membrane vitelline à l’extérieur aux vaisseaux embryonnaires supplémentaires tout en tenant l’embryon avec de minces forceps. Au microscope stéréo, placer l’embryon dans une boîte de Pétri avec une base noire contenant du PBS froid.Utilisez quatre broches à insectes pour maintenir l’embryon au fond de la plaque. Placez les broches dans la région extraembryonique formant une forme carrée. Effectuer deux coupures entre les somites 19 et 24 transversalement à l’axe embryonnaire et traverser l’embryon.Relâchez cette section en coupant les bords embryonnaires marginaux. Observez la plaque latérale, le tube neural et les somites. Aspirer et transférer les tissus dans un plat en verre rempli de pancréatine froide.Incuber pendant 30 minutes sur la glace pour une digestion enzymatique. Sous le microscope stéréo, isoler le mésoderm des tissus environnants à l’aide de deux micro-scalpels chez les détenteurs. Observez le mesoderm somatopleura, le splanchnopleura, le tube neural et l’ectoderm.Tout d’abord, retirez l’ectoderm à la surface. Observez le mesoderm somatopleura dissocié de l’ectoderme. Puis, détachez soigneusement le splanchnopleura ventrally situé de la somatopleura.Observez le mésoderm latéral droit de la somatopleura. Relâchez-le en le coupant dans un mouvement parallèle au tube neural. Notez que toutes les surfaces et solutions doivent être maintenues au froid pendant cette procédure.Passer à une nouvelle solution de pancréatine froide et plat en cas de prendre beaucoup de temps pour disséquer les tissus. Observez le mésoderm latéral gauche du somatopleura, des somites, du tube neural et de l’ectoderm. Répétez la libération mesoderm de ce côté.Faites des mouvements lents avec le micro-scalpel. Les protéines de matrice extracellulaires exposées se trouvent à travers les tissus et les instruments, empêchant les mouvements des fluides. Couper délicatement le somatopleura en mouvement parallèle au tube neural.Transférer le mésoderm isolé dans un plat en verre rempli de sérum bovin fœtal froid et le garder sur la glace pendant la préparation de l’analyse in vitro. Placer une grille en métal fine dans une boîte de Pétri et remplir de milieu de culture. Retirer les liquides excessifs pour niveler la surface moyenne avec le dessus de la grille.À l’aide de forceps minces, trempez un filtre membranaire dans le milieu de culture et placez-le soigneusement sur le dessus de la grille pour avoir une surface en contact avec elle. Sous le microscope stéréo, transférer l’endoderm isolé du plat en verre au filtre membranaire en glissant doucement à l’aide de spatules et de forceps minces. Répétez cette procédure pour le mésoderm isolé.À l’aide d’un micro-scalpel, mélanger les tissus pour maximiser son association. Placez soigneusement les tissus associés dans un incubateur humidifié à 37 degrés avec 5% de CO2 pendant 48 heures. Après la période d’incubation, greffer les tissus de culture sur la membrane de type coriolan et lui permettre de se développer en ovale pendant encore 10 jours pour compléter la formation d’organes comme décrit précédemment.Voici la méthode réticulaire qui permet d’utiliser l’isolement des tissus embryonnaires aviaires dans des approches expérimentales distinctes. À titre d’exemple, l’expression de gènes connus pour être impliqués dans la formation des poches pharyngéales a également été évaluée un endoderm isolé contenant les deuxième, troisième et quatrième sachets pharyngéels des embryons de poulet au troisième jour embryonnaire et demi par hybridation in situ de montage entier. L’expression de Sonic Hedgehog a été détectée dans l’endoderm du pharynx central et exclue des sachets, tandis que BMP7 a été exprimée dans l’endoderm des deuxième et troisième poches pharyngéales et exclue du pharynx central et de la quatrième poche pharyngéale.Les tissus isolés peuvent également être associés in vitro pendant 48 heures, greffer sur la membrane de type coriolan, et laisser se développer pendant encore 10 jours. Les explantations peuvent être analysées par histologie conventionnelle et immunohistochimie. Quelques résultats représentatifs de l’association de l’endoderm de caille des troisième et quatrième sachets pharyngeal avec le mesoderm de somatopleura de poulet sont les suivants-Greffes ont montré un thymus chimérique entièrement formé avec des cellules épithéliales thymiques dérivées de caille positives pour QCPN et cellules lymphoïdes de poulet.En outre, l’épithélium thymique positif de cytokeratin a montré des dispositifs morphologiques normaux, affichant une architecture réticulaire typique. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler les tissus embryonnaires de caille et de poulet qui peuvent être utilisés dans les études d’expression génétique et en formant des organes chimériques peuvent également aider à déchiffrer la complexité de la génétique des organes.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome profilage des<em&gt; In-Vivo</em&gt; embryons de bovins pré-implantation à l&#39;aide de deux couleurs Microarray Plate-forme

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Recherche

Biologie du développement

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Régulation épigénétique de Cardiac Différenciation des cellules et tissus souches embryonnaires

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues

Isolement et différenciation des cellules souches adipeuses de porcines sous-cutanée des tissus adipeux

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

Isolement des cellules embryonnaires murines Hemogenic endothéliales

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

Culture de murines embryonnaires Métatarsiens: un modèle physiologique de endochondrale ossification

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

Protocoles pour Visualizing stéroïdogénique organes et leurs organes interactifs avec Immunostaining dans le Fruit Fly<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

À l’aide de In Vivo et tissulaire et cellulaire Explant approches à l’étude de la morphogénèse et la pathogenèse de l’aorte embryonnaire et périnatale

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic ...

Two-step Approach to Explore Early- and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm

Approche en deux étapes pour explorer et fin-début de la Formation des organes dans le modèle aviaire : le Thymus et des glandes parathyroïdes organogenèse paradigme

The avian embryo, as an experimental model, has been of utmost importance for seminal discoveries in developmental biology. Among several approaches, the ...

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Culture organotypique en trois dimensions des organes sensoriels vestibulaires et auditives

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...

A Familial Hypercholesterolemia Human Liver Chimeric Mouse Model Using Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocytes

Un modèle de souris chimériques du foie humain de l’hypercholestérolémie utilisant des hépatocytes de dérivés de cellules souches pluripotentes induites

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