Name: isolation of embryonic tissues and formation of quail-chicken chimeric organs using the thymus example
Uploaded: 2019-02-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Embryonic Tissues and Formation of Quail-Chicken Chimeric Organs Using The Thymus Example at JoVE.com

Gli autori sono grati a Isabel Alcobia per la lettura critica del manoscritto, Mário Henriques per video narrazione e Vitor Proa dal servizio istologia dell'Instituto de Histologia e Biologia Desenvolvimento, Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa, per il supporto tecnico. Siamo particolarmente grati a Paulo Caeiro e Hugo Silva dalla Unidade de audiovisuais (unità audiovisivi), Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa per il loro eccezionale impegno alla produzione di questo video. Riconosciamo Leica Microsystems per gentilmente fornire uno stereoscopio equipaggiato con un sistema di video e di Interaves - Sociedade Agro-Pecuária, s. a per aver contribuito con Quaglia fecondate le uova. Questo lavoro è stato supportato da Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).

Tutti questi esperimenti seguono la cura degli animali e orientamenti etici del Centro Académico de Medicina de Lisboa.
1. l'incubazione delle uova di quaglia e pollo fertilizzato
<ol><li>Posto fecondate le uova di quaglia giapponese (Coturnix japonica del coturnix) in un incubatore di 38 ° C per 3 giorni. Incubare le uova (estremità smussata uovo) rivolto verso l'alto nella camera d'aria. Nota: L'ambiente umidificato si ottiene inserendo un contenitore di acqua nella parte in...

<ol>
	<li>Le Douarin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nogent+Institute--50+years+of+embryology.">The Nogent Institute--50 years of embryology.</a> The International Journal of Developmental Biology. 49 (2-3), 85-103 (2005).</li><li>Le Douarin, N. M., Teillet, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+migration+of+neural+crest+cells+to+the+wall+of+the+digestive+tract+in+avian+embryo.">The migration of neural crest cells to the wall of the digestive tract in avian embryo.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 30 (1), 31-48 (1973).</li><li>Le Douarin, N. M., Jotereau, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+of+cells+of+the+avian+thymus+through+embryonic+life+in+interspecific+chimeras.">Tracing of cells of the avian thymus through embryonic life in interspecific chimeras.</a> Journal of Experimental Medicine. 142 (1), 17-40 (1975).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.+1951.">A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951.</a> Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).</li><li>Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. 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A., Papaioannou, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DiGeorge+syndrome+phenotype+in+mice+mutant+for+the+T-box+gene,+Tbx1.">DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1.</a> Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).</li><li>Nie, X., Brown, C. B., Wang, Q., Jiao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+Bmp4+from+the+Tbx1+expression+domain+causes+abnormal+pharyngeal+arch+artery+and+cardiac+outflow+tract+remodeling.">Inactivation of Bmp4 from the Tbx1 expression domain causes abnormal pharyngeal arch artery and cardiac outflow tract remodeling.</a> Cells Tissues Organs. 193 (6), 393-403 (2011).</li><li>Zou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+of+the+third+pharyngeal+pouch+into+thymus/parathyroid+by+Six+and+Eya1.">Patterning of the third pharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1.</a> Developmental Biology. 293 (2), 499-513 (2006).</li><li>Davey, M. G., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chicken+as+a+model+for+embryonic+development.">The chicken as a model for embryonic development.</a> Cytogenetic and Genome Research. 117 (1-4), 231-239 (2007).</li><li>Nowak-sliwinska, P., Segura, T., Iruela-arispe, M. L., Angeles, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chicken+chorioallantoic+membrane+model+in+biology,+medicine+and+bioengineering.">The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering.</a> Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).</li><li>Uematsu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+in+ovo+chorioallantoic+membrane+engraftment+to+culture+testes+from+neonatal+mice.">Use of in ovo chorioallantoic membrane engraftment to culture testes from neonatal mice.</a> Comparative Medicine. 64 (4), 264-269 (2014).</li><li>Martyn, I., Kanno, T. Y., Ruzo, A., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+a+human+organizer+by+combined+Wnt+and+Nodal+signaling.">Self-organization of a human organizer by combined Wnt and Nodal signaling.</a> Nature. 558 (7708), 132-135 (2018).</li></ol>

La procedura di isolamento del tessuto embrionale dettagliata qui è stata migliorata dalle precedenti tecniche per produrre gli embrioni chimerici quaglia-pollo in diversi contesti biologici3,5,6.
Questo approccio è adatto per isolare i tessuti embrionali puri senza la necessità di manipolazione genetica o l'uso di marcatori tessuto-specifici, che spesso sono indeterminati, limitando l'uso di model...

Agli inizi del 1970, un sistema elegante quaglia-pollo chimera è stato sviluppato da Le Douarin, aprendo nuove vie per comprendere il ruolo della migrazione cellulare e interazioni cellulari durante lo sviluppo1,2. Il modello è stato ideato sulla premessa che scambio di cellule tra le due specie non vorrei disturbare notevolmente l'embriogenesi, successivamente confermato quando utilizzati per lo studio di numerosi processi di sviluppo, tra cui la formazione del sistema nervoso e l'ematopoietiche sistemi1. Prendendo quest'ultimo come un esempio, le onde cicliche dei progenitori ematopoietici colonizzando il rudimento epiteliale del timo in primo luogo è stata osservata mediante quaglia-pollo chimera system3. Per questo, il territorio prospettico del timo, l'endoderma dei sacchetti di terzi e quarto pharyngeal (3/4PP), era meccanicamente ed enzimaticamente isolato da embrioni di quaglia (q) in 15-30 - fase somite [giorno embrionale (E) 1.5-E2.5]. Queste fasi corrispondono al pollo Hamburger e Hamilton4 (HH) - fasi 12-17. Le procedure di isolamento iniziato con l'uso di tripsina enzimaticamente dissociare l'endoderma dal mesenchima allegato. L'endoderma isolato è stato innestato nella regione somatopleura di embrione di pollo (c) ospite presso E3-E3.5 (HH-fasi 20-21). Questo mesenchima eterologa è stato considerato "permissivo" allo sviluppo di epitelio timico che contribuiscono anche alla formazione dell'organo3. In seguito, ondate successive di cellule progenitrici ematica di pollo ospite infiltrato la controparte quaglia donatore timici epiteliali che contribuiscono alla formazione di timo in embrione host3.
Più recentemente, una versione modificata di questo approccio è stato anche dimostrata di essere importante per lo studio delle interazioni epiteliale-mesenchymal durante le prime fasi della formazione di timo5. A questo proposito, i tessuti coinvolti nella formazione del timo ectopico in embrioni chimerici3 erano isolati, sia da donatore e host embrioni e associati ex vivo. Un protocollo migliorato è stato usato per isolare l'endoderma 3/4PP di quaglia (E2.5-E3) e il mesoderma somatopleura di pollo (E2.5-E3). Brevemente, i tessuti embrionali sono stati isolati di microchirurgia e soggetto a digestione in vitro pancreatina. Inoltre, le condizioni di digestione enzimatica, temperatura e tempo di incubazione sono state ottimizzate secondo tessuto tipo e Stadio di sviluppo (tabella 1).
Successivamente, i tessuti isolati sono stati associati in un organotipiche sistema in vitro per 48 h, come precedentemente segnalato5,6. L'associazione in vitro di tessuti imita il locale interazioni cellulari nell'embrione, superando alcune restrizioni della manipolazione in vivo. Questo sistema è particolarmente utile per studiare le interazioni cellulari in eventi morfogenetici complessi, quali lo sviluppo dell'apparato faringeo.
Il contributo di ogni tessuto nell'istogenesi di timo, così come la capacità dell'associazione heterospecific per generare un timo può essere ulteriormente esplorato utilizzando la metodologia di CAM, precedentemente dettagliate5,7,8. Succintamente, i tessuti coltivati sono stati innestati la CAM di embrioni cE8 e ha permesso di sviluppare in ovo per 10 giorni. Quindi, formazione di timo è stata valutata mediante analisi morfologica in espianti di raccolti. Come gli studi classici di quaglia-pollo3, l'epitelio timico quaglia è stata colonizzata da cellule progenitrici ematopoietiche (HPC) derivate da un embrione di pollo, che più successivamente è stato indicato per contribuire allo sviluppo di organo9,10 . La HPCs migrati dall'embrione al timo ectopico chimerico attraverso l'altamente vascularized CAM5,7,8. Quaglia epitelio timico derivata può essere identificato mediante immunoistochimica utilizzando anticorpi specie-specifici (cioè, QCPN - MAb Quaglia perinucleare), superando la necessità di marcatori molecolari del tessuto-specifica.
Questo metodo sperimentale, come l'approccio in due fasi segnalato nella precedente pubblicazione8, consente la modulazione della trasduzione del segnale dalla regolare somministrazione di agenti farmacologici durante in vitro e in sviluppo di ovo. Inoltre, espianti possono essere raccolto in qualsiasi momento del corso dell' esperimento8.
Infine, il protocollo di isolamento qui dettagliato consente la conservazione delle proprietà naturali e 3D-architettura di tessuti embrionali, particolarmente utili per dettagliare modelli di espressione genica in situ dei territori embrionali altrimenti inaccessibili da metodi convenzionali. Inoltre, approcci di analisi del trascrittoma, tra cui RNA-seq o microarrays, possono anche applicarsi in tessuti isolati senza la necessità di marcatori genetici, fornendo un'analisi di tessuto-specifico elevato throughput "omics".

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1279px;" width="1277">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:379px;">Chicken fertilized eggs (Gallus gallus)</td>
			<td style="width:306px;">Pintobar, Portugal</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:445px;">Poultry farm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:379px;">Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix)</td>
			<td>Interaves, Portugal</td>
			<td></td>
			<td style="width:445px;">Bird farm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">15 mL PP centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430052</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">50 mL PP centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430290</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">60 x 20 mm pyrex dishes</td>
			<td>Duran group</td>
			<td style="width:149px;">21 755 41</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">100 x 20 mm pyrex dishes</td>
			<td>Duran group</td>
			<td style="width:149px;">21 755 48</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Metal grid</td>
			<td>Goodfellows</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:445px;">fine meshed&#160; stainless steel grid</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Membrane filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td style="width:149px;">DTTP01300</td>
			<td style="width:445px;">0.6 mm Isopore membrane filter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Petri dish, 35 x 10 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:149px;">P5112&#160;</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">60 x 30 mm pyrex bowls (Small size)</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:445px;">from supermarket&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">100 x 50 mm pyrex bowls (Large size)</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:445px;">from supermarket&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Transfer pipettes</td>
			<td>Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2041S</td>
			<td style="width:445px;">2 mL plastic pipet</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Glass pasteur pipette</td>
			<td>Normax</td>
			<td style="width:149px;">5426015</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Clear plastic tape</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:445px;">from supermarket&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:379px;">Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5</td>
			<td>BMA Biomedicals</td>
			<td>T-1302</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td style="width:445px;">Standart FBS</td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:379px;">Pancreatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-3292</td>
			<td style="width:445px;">Prepare a 25 mg/mL solution according to manufacturer&#39;s instructions; centrifuge and filter prior to aliquote and store at -20&#186;C. Aliquots can be kept frozen for several years.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>GIBCO, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">QCPN antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>QCPN</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement&#160;</td>
			<td>GIBCO, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>61870010</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit</td>
			<td>ELKEM/Silmid</td>
			<td>RH141001KG</td>
			<td style="width:445px;">To prepare the back base for petri dish</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">11251-30&#160;</td>
			<td style="width:445px;">Thin forceps</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Extra fine Bonn scissors, curved</td>
			<td style="width:306px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">14085-08</td>
			<td style="width:445px;">Curved scissors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Insect pins&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">26001-30</td>
			<td style="width:445px;">0.3 mm Stainless steel pin</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Micro spatula&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">10087-12</td>
			<td style="width:445px;">Transplantation spoon</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Minutien Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">26002-20</td>
			<td style="width:445px;">0.2 mm Stainless steel microscalpel</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Minutien Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">26002-10</td>
			<td style="width:445px;">0.1 mm Stainless steel microscalpel</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Moria Nickel Plated Pin Holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">26016-12</td>
			<td style="width:445px;">Nickel plated pin holder</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Moria Perforated Spoon</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">10370-17</td>
			<td style="width:445px;">Skimmer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Wecker Eye Scissor</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">15010-11</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Camera</td>
			<td>Leica Microsystems&#160;</td>
			<td style="width:149px;">MC170 HD</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems&#160;</td>
			<td style="width:149px;">DM2500</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">NanoZoomer&#160;S360 Digital&#160;slide scanner&#160;</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:149px;">C13220-01</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Stereoscope</td>
			<td>Leica Microsystems&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Leica M80</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of embryonic tissues and formation of quail-chicken chimeric organs using the thymus example

La capacità di isolare i tessuti embrionali era un passo essenziale per stabilire il sistema di quaglia-pollo chimera, che a sua volta ha fornito contributi indiscussi per svelare processi chiave nella biologia inerente allo sviluppo.
Qui è descritto un metodo ottimizzato per isolare i tessuti embrionali da quaglie e polli di microchirurgia e digestione enzimatica pur conservando le sue proprietà biologiche. Dopo l'isolamento, tessuti da entrambe le specie sono associati in un saggio in vitro organotipiche per 48 h. Quaglia e tessuti di pollo possono essere discriminate da distinte caratteristiche nucleari e marcatori molecolari, permettendo lo studio del cellulare cross-talk tra Associazione heterospecific dei tessuti. Questo approccio è, pertanto, uno strumento utile per lo studio delle interazioni complesse del tessuto in processi di sviluppo con modifiche spaziali altamente dinamiche, come quelle che si verificano durante la morfogenesi della faringe e la formazione della del foregut endoderma-derivato organi. Questo approccio sperimentale è stato sviluppato per studiare le interazioni epiteliale-mesenchymal durante le prime fasi di formazione di timo. In questo, l'endoderma-derivato prospettico rudimento timico e mesenchima derivato dal mesoderma, sono state isolate da embrioni di pollo e quaglia, rispettivamente.
La capacità dei tessuti associati per generare gli organi possa essere ulteriormente testata mediante innesto li sulla membrana corio-allantoidea (CAM) di un embrione di pollo. Il CAM fornisce le sostanze nutrienti e consente lo scambio di gas ai tessuti espiantati. Dopo 10 giorni di sviluppo di ovo, gli organi chimerici possono essere analizzati in espianti di raccolti con i metodi morfologici convenzionali. Questa procedura permette anche di studiare tessuto-specifici contributi durante la formazione dell'organo, dal suo iniziale sviluppo (sviluppo in vitro) alle fasi finali dell'organogenesi (in sviluppo di ovo).
Infine, il metodo migliore isolamento fornisce anche tridimensionale (3D) conservato tessuti embrionali, che possono essere utilizzati anche per analisi topografiche ad alta risoluzione dei modelli di espressione genica tessuto-specifica.

Il protocollo in dettaglio un metodo per isolare i tessuti embrionali aviaria per essere utilizzato in diversi approcci tecnici di biologia cellulare e dello sviluppo. Questo metodo è stato precedentemente impiegato per studiare le interazioni epiteliale-mesenchymal durante le prime fasi della formazione di timo5. Nel presente documento, nuovi risultati sono mostrati nella Figura 1 e Figura 2, utilizzando...

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Isolation of Embryonic Tissues and Formation of Quail-Chicken Chimeric Organs Using The Thymus Example

Questo articolo fornisce un metodo per isolare puri tessuti embrionali da embrioni di pollo e quaglie che possono essere combinati per formare ex vivo chimerico organi.

Isolamento dei tessuti embrionali e formazione degli organi chimerici quaglia-pollo, utilizzando l'esempio di timo

The capacity to isolate embryonic tissues was an essential step for establishing the quail-chicken chimera system, which in turn has provided undisputed ...

L'obiettivo generale di questa procedura è presentare un approccio sperimentale ottimizzato per isolare i tessuti embrionali dalla quaglia e dagli embrioni di pollo. Con questa tecnica, otteniamo tessuti embrionali puri che possono essere utilizzati negli studi di espressione genica e nei test funzionali. I tessuti provenienti da embrioni di quaglia e pollo sono isolati dalla microchirurgia e sottoposti a digestione enzimatica in vitro preservandone le proprietà biologiche.Dopo l'isolamento, i tessuti conservati tridimensionali possono essere utilizzati per l'analisi dei modelli di espressione genica topografica ad alta risoluzione. Questo approccio è particolarmente utile per dettagliare l'espressione genica in situ in territori embrionali altrimenti inaccessibili con metodi convenzionali. Inoltre, gli approcci di analisi del trascritoma possono anche essere applicati in tessuti isolati senza richiedere marcatori genetici, fornendo al contempo un'analisi omica ad alta produttività specifica dei tessuti.In alternativa, i tessuti isolati di entrambe le specie possono essere associati in un saggio organotipico in vitro per 48 ore. Questo approccio consente di studiare le interazioni dei tessuti, poiché le cellule di quaglia e pollo possono essere discriminate da caratteristiche nucleari distinte e marcatori molecolari. La capacità dei tessuti di coltura di formare organi può essere ulteriormente testata mediante saggio ovo.Questo metodo è quindi uno strumento utile per studiare complesse interazioni tissutali in processi di sviluppo con modifiche uciali altamente dinamiche e può anche aiutare a rivelare il potenziale di specifici territori embrionali alla formazione di organi. Ad esempio, nel presente documento viene descritta la formazione di timo chimerico di quaglia-pollo da tessuti embrionali isolati. In primo luogo, l'endoderma del terzo e quarto sacchetto faringeo, la potenziale rudimento timica è isolata dalla regione faringea degli embrioni di quaglia con tre giorni di sviluppo.Quindi, questo tessuto è associato a un mesenchima in grado di sostenere il suo sviluppo, il mesoderma somatopleura. Infine, l'associazione eterospecifica dei tessuti viene coltivata in vitro e in ovo per formare un timo chimerico. Eseguire tutte le procedure di manipolazione delle uova in condizioni sterili utilizzando una cappa orizzontale a flusso laminare e strumenti e materiali sterilizzati.Le uova di quaglia fecondate sono state incubate con la camera d'aria rivolta verso l'alto. Per iniziare, rimuovere le uova di quaglia dall'incubatrice. Preparare una grande ciotola di vetro borosilicato piena di PBS freddo.Con forbici curve, toccare e tagliare un foro circolare nel guscio di un uovo di quaglia con tre giorni di incubazione. Rendere il foro sul lato opposto dell'uovo smussato e trasferire il tuorlo nella ciotola con PBS freddo. Rimuovere l'embrione dal tuorlo tagliando esternamente la membrana vitellina ai vasi extraembrionici.Con l'aiuto di forcep sottili, trasferire l'embrione in una piccola ciotola piena di PBS freddo, quindi spostare l'embrione in una piastra di Petri con base nera con uno skimmer. Rimuovere la regione faringea contenente il terzo e il quarto sacchetti faringei come descritto nella precedente legatura di Jove SPA. Quindi, trasferire la terza e la quarta regione dell'arco faringeo in un bicchiere riempito con pancreatina fredda e incubare per un'ora, sul ghiaccio, per la digestione enzimatica.Si noti che il periodo di incubazione della digestione enzimatica dipende dallo stadio di sviluppo. Posizionare la lapide di vetro al microscopio stereo e isolare l'endoderma dalla terza e dalla quarta regione dell'arco faringeo, utilizzando due micro-bisturi in un supporto. In primo luogo la regione faringea con il lato dorsale verso l'alto, mostrando internamente l'endoderma e l'ectoderma nella superficie esterna.Osserva l'ectoderma, l'endoderma, il mesenchima, il tubo cardiaco e la porzione ventrale del tubo neurale. Rimuovere il tubo neurale e il mesoderma attaccato alla superficie dorsale dell'endoderma faringeo. Osserva l'endoderma della faringe, il quarto e il terzo sacchetto faringeo e il tubo cardiaco.Con il lato dorsale verso l'alto, staccare con cura e rimuovere il mesenchima tra gli archi faringei ed esporre i sacchetti faringei. Eseguire questa procedura nell'altro lato della regione faringea. Rimuovere il mesenchima attaccato alla parte più posteriore dell'endoderma e osservare la quarta busta faringea.Con il lato posteriore verso l'alto, osservare sia la quarta sacchetti faringea sinistra che destra. Continuare rimuovendo il mesenchima attaccato alla parte più posteriore dell'endoderma e alla seconda busta. Rimuovere il tubo cardiaco e il mesenchima che circonda i sacchetti interni.Con il lato ventrale verso l'alto, osserva la faringe endoderma e il lato destro del secondo arco faringeo. In questa fase, l'endoderma del rudimento tiroideo dovrebbe essere visibile. Staccare l'ectoderma del secondo e del terzo arco faringeo e rimuovere con cura il mesenchima degli archi.Osservare la rimozione del mesenchima del secondo arco faringeo sul lato destro. Si noti la posizione del quarto e terzo sacchetto e rudimento tiroideo. Rimuovere i resti alle cellule mesenchimali attaccate ai sacchetti faringei.Osservare la terza e la quarta busta del lato destro e la quarta busta dal lato sinistro. Ripetere il distacco del mesenchima del lato sinistro. Osserva ora la terza busta del lato sinistro.Osservare il distacco del mesenchima del secondo arco sul lato sinistro. Si noti che tutte le superfici e le soluzioni devono essere mantenute fredde durante questa procedura. Passare a una nuova soluzione di pancreatina fredda e piatto in caso di tempo necessario per sezionare i tessuti.Infine, fai un taglio trasversale tra il secondo e il terzo sacchetto faringeo per rimuovere i secondi sacchetti e il rudimento tiroideo. A questo punto, l'endoderma isolato è composto dalla terza e quarta sacchettia e dalla punta posteriore della faringe. Rimuovere i resti staccati mesenchima con l'aiuto di due micro-bisturi.Trasferire l'endoderma isolato in un piatto di vetro riempito con siero bovino fetale freddo e tenerlo sul ghiaccio durante la preparazione del saggio in vitro. Le uova sono state poste in posizione orizzontale e il lato superiore contrassegnato per l'uso di un carbone. Per iniziare, rimuovere le uova dall'incubatrice.Con una forbice curva, aprire un piccolo foro nel guscio, inserire un ago e aspirare due millilitri di albumina con una siringa da 10 millilitri. Aprire un foro circolare nella regione marcata del guscio e tagliare la membrana vitellina esternamente ai vasi embrionali extra tenendo l'embrione con force sottili. Al microscopio stereo, posizionare l'embrione in una piastra di Petri con base nera contenente PBS freddo.Usa quattro spilli per insetti per tenere l'embrione sul fondo del piatto. Posizionare i perni nella regione extraembrionica formando una forma quadrata. Eseguire due tagli tra i somiti 19 e 24 trasversalmente all'asse embrionale e attraversare l'embrione.Rilasciare questa sezione tagliando i bordi embrionali marginali. Osservare la piastra laterale, il tubo neurale e le somiti. Aspirare e trasferire i tessuti in un piatto di vetro riempito con pancreatina fredda.Incubare per 30 minuti sul ghiaccio per la digestione enzimatica. Al microscopio stereo, isolare il mesoderma dai tessuti circostanti usando due micro-bisturi nei supporti. Osserva il mesoderma somatopleura, lo splanchnopleura, il tubo neurale e l'ectoderma.In primo luogo, rimuovere l'ectoderma sulla superficie. Osservare il mesoderma somatopleura dissociato dall'ectoderma. Quindi, staccare con cura la splancnopleura posizionata ventralmente dal somatopleura.Osservare il mesoderma laterale destro del somatopleura. Rilascialo tagliandolo in un movimento parallelo al tubo neurale. Si noti che tutte le superfici e le soluzioni devono essere mantenute fredde durante questa procedura.Passare a una nuova soluzione di pancreatina fredda e piatto in caso di tempo necessario per sezionare i tessuti. Osservare il mesoderma laterale sinistro del somatopleura, dei somiti, del tubo neurale e dell'ectoderma. Ripetere il rilascio di mesoderma di questo lato.Fai movimenti lenti con il micro-bisturi. Le proteine della matrice extracellulare esposte siedono attraverso tessuti e strumenti, prevenendo i movimenti dei fluidi. Tagliare con cura il somatopleura in un movimento parallelo al tubo neurale.Trasferire il mesoderma isolato in un piatto di vetro riempito con siero bovino fetale freddo e tenerlo sul ghiaccio durante la preparazione del saggio in vitro. Mettere una griglia metallica a maglie fini in una piastra di Petri e riempire con mezzo di coltura. Rimuovere i liquidi eccessivi per livellare la superficie media con la parte superiore della griglia.Con l'aiuto di pinza sottile, immergere un filtro a membrana nel mezzo di coltura e posizionarlo con cura sulla parte superiore della griglia per avere una superficie a contatto con lei. Al microscopio stereo, trasferire l'endoderma isolato dalla piastra di vetro al filtro a membrana scivolando delicatamente con l'aiuto di spatole e forcep sottili. Ripetere questa procedura per il mesoderma isolato.Con l'aiuto di un micro-bisturi, mescolare i tessuti per massimizzare la sua associazione. Posizionare con cura i tessuti associati in un'incubatrice umidificata a 37 gradi con 5%CO2 per 48 ore. Dopo il periodo di incubazione, innestare i tessuti di coltura sulla membrana di tipo coriolano e consentirgli di svilupparsi in ovale per ulteriori 10 giorni per completare la formazione di organi come descritto in precedenza.Ecco il metodo reticolare che permette l'isolamento dei tessuti embrionali aviari da utilizzare in distinti approcci sperimentali. Ad esempio, l'espressione di geni noti per essere coinvolti nella formazione dei sacchetti faringei è stata anche valutata un endoderma isolato contenente la seconda, terza e quarta sacchetti faringei dagli embrioni di pollo al terzo giorno e mezzo embrionale per ibridazione in situ montata intera. L'espressione di Sonic Hedgehog è stata rilevata nell'endoderma della faringe centrale ed è stata esclusa dai sacchetti, mentre BMP7 è stata espressa nell'endoderma della seconda e della terza busta faringea ed esclusa dalla faringe centrale e dalla quarta busta faringea.I tessuti isolati possono anche essere vitro specificamente associati in vitro per 48 ore, innesto sulla membrana di tipo coriolano e permesso di svilupparsi per ulteriori 10 giorni. Le espianto possono essere analizzate mediante istologia convenzionale e immunoistochimica. Alcuni risultati rappresentativi dell'associazione dell'endoderma di quaglia dal terzo e quarto sacchetto faringeo con mesoderma di somatopleura di pollo sono i seguenti-Innesti hanno mostrato un timo chimerico completamente formato con cellule epiteliali timiche derivate dalla quaglia positive per qcpn e cellule linfoidi di pollo.Inoltre, l'epitelio timomico positivo alla citocheratina mostrò caratteristiche morfologiche normali, mostrando una tipica architettura reticolare. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare le quaglie e i tessuti embrionali di pollo che possono essere utilizzati negli studi di espressione genica e formando organi chimerici possono anche aiutare a decifrare la complessità della genetica degli organi.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Trascrittoma Profiling di<em&gt; In-Vivo</em&gt; Embrioni bovini pre-impianto prodotto con piattaforma microarray a due colori

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Regolazione epigenetica del Cardiac differenziazione delle cellule staminali embrionali e Tessuti

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues

Isolamento e differenziazione delle cellule staminali derivate da tessuto adiposo sottocutaneo da Suini tessuti adiposi

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

Isolamento di cellule murine embrionali Hemogenic endoteliali

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

Cultura della murini embrionali Metatarso: Un modello fisiologico di endocondrale Ossificazione

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

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Protocolli per la visualizzazione steroidogenica organi e dei loro organi interattivi con Immunocolorazione nella mosca della frutta<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

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Usando In Vivo e del tessuto e delle cellule Explant approcci per studiare la morfogenesi e la patogenesi dell'Aorta embrionale e perinatale

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic ...

Two-step Approach to Explore Early- and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm

Approccio in due fasi per esplorare e tardo-fasi iniziali di formazione dell'organo nel modello aviaria: il timo e le ghiandole paratiroidali organogenesi paradigma

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Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

Colture organotipiche tridimensionale degli organi sensoriali uditivi e vestibolari

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A Familial Hypercholesterolemia Human Liver Chimeric Mouse Model Using Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocytes

Un modello di Mouse chimerici del fegato umano di ipercolesterolemia familiare facendo uso degli epatociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte

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