Name: isolation of embryonic tissues and formation of quail-chicken chimeric organs using the thymus example
Uploaded: 2019-02-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Embryonic Tissues and Formation of Quail-Chicken Chimeric Organs Using The Thymus Example at JoVE.com

Forfatterne er takknemlig til Isabel Alcobia for kritisk lesing av manuskriptet, Mário Henriques for video lydkommentarer og Vitor Proa fra tjenesten Histology Instituto de Histologia e Biologia gjøre Desenvolvimento, Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa, kundestøtte. Vi er spesielt gjeld til Paulo Caeiro og Hugo Silva fra Unidade de audiovisuais (audiovisuelle enhet), Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa for deres enestående engasjement for produksjon av denne videoen. Vi erkjenner Leica Microsystems for vennlig å gi en stereoscope utstyrt med en system og Interaves - Sociedade Agro-Pecuária, sa for å bidra med vaktelegg befruktede egg. Dette arbeidet ble støttet av Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).

Alle disse eksperimentene følger dyr omsorg og etiske retningslinjer på Centro Académico de Medicina de Lisboa.
1. befruktet vaktel og kylling egg inkubasjon
<ol><li>Sted befruktet egg av japansk vaktel (Coturnix coturnix japonica) i en 38 ° C fuktet inkubator for 3 dager. Ruge egg (egg sløv slutten) vender i luften kammeret. Merk: Fuktet miljøet er oppnådd ved å plassere en vann beholder nederst i inkubator.</li>
	<li>Ruge befruktede egg av kylling (Gallus gallus</em...

<ol>
	<li>Le Douarin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nogent+Institute--50+years+of+embryology.">The Nogent Institute--50 years of embryology.</a> The International Journal of Developmental Biology. 49 (2-3), 85-103 (2005).</li><li>Le Douarin, N. M., Teillet, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+migration+of+neural+crest+cells+to+the+wall+of+the+digestive+tract+in+avian+embryo.">The migration of neural crest cells to the wall of the digestive tract in avian embryo.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 30 (1), 31-48 (1973).</li><li>Le Douarin, N. M., Jotereau, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+of+cells+of+the+avian+thymus+through+embryonic+life+in+interspecific+chimeras.">Tracing of cells of the avian thymus through embryonic life in interspecific chimeras.</a> Journal of Experimental Medicine. 142 (1), 17-40 (1975).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.+1951.">A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951.</a> Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).</li><li>Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Bmp4+signalling+in+the+epithelial-mesenchymal+interactions+that+take+place+in+early+thymus+and+parathyroid+development+in+avian+embryos.">Modulation of Bmp4 signalling in the epithelial-mesenchymal interactions that take place in early thymus and parathyroid development in avian embryos.</a> Developmental Biology. 361 (2), 208-219 (2012).</li><li>Takahashi, Y., Bontoux, M., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelio--mesenchymal+interactions+are+critical+for+Quox+7+expression+and+membrane+bone+differentiation+in+the+neural+crest+derived+mandibular+mesenchyme.">Epithelio--mesenchymal interactions are critical for Quox 7 expression and membrane bone differentiation in the neural crest derived mandibular mesenchyme.</a> Embo Journal. 10 (9), 2387-2393 (1991).</li><li>Figueiredo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+and+Hedgehog+in+the+thymus/parathyroid+common+primordium:+Crosstalk+in+organ+formation.">Notch and Hedgehog in the thymus/parathyroid common primordium: Crosstalk in organ formation.</a> Developmental Biology. 418 (2), 268-282 (2016).</li><li>Figueiredo, M., Neves, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+Approach+to+Explore+Early-and+Late-stages+of+Organ+Formation+in+the+Avian+Model:+The+Thymus+and+Parathyroid+Glands+Organogenesis+Paradigm+Video+Link.">Two-step Approach to Explore Early-and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm Video Link.</a> Journal of Visualuzed Experiments. , (2018).</li><li>Nehls, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+genetically+separable+steps+in+the+differentiation+of+thymic+epithelium.">Two genetically separable steps in the differentiation of thymic epithelium.</a> Science (New York, N.Y.). 272 (5263), 886-889 (1996).</li><li>Morahan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nu+gene+acts+cell-autonomously+and+is+required+for+differentiation+of+thymic+epithelial+progenitors.">The nu gene acts cell-autonomously and is required for differentiation of thymic epithelial progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (12), 5742-5746 (1996).</li><li>Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DiGeorge+syndrome+phenotype+in+mice+mutant+for+the+T-box+gene,+Tbx1.">DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1.</a> Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).</li><li>Nie, X., Brown, C. B., Wang, Q., Jiao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+Bmp4+from+the+Tbx1+expression+domain+causes+abnormal+pharyngeal+arch+artery+and+cardiac+outflow+tract+remodeling.">Inactivation of Bmp4 from the Tbx1 expression domain causes abnormal pharyngeal arch artery and cardiac outflow tract remodeling.</a> Cells Tissues Organs. 193 (6), 393-403 (2011).</li><li>Zou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+of+the+third+pharyngeal+pouch+into+thymus/parathyroid+by+Six+and+Eya1.">Patterning of the third pharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1.</a> Developmental Biology. 293 (2), 499-513 (2006).</li><li>Davey, M. G., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chicken+as+a+model+for+embryonic+development.">The chicken as a model for embryonic development.</a> Cytogenetic and Genome Research. 117 (1-4), 231-239 (2007).</li><li>Nowak-sliwinska, P., Segura, T., Iruela-arispe, M. L., Angeles, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chicken+chorioallantoic+membrane+model+in+biology,+medicine+and+bioengineering.">The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering.</a> Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).</li><li>Uematsu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+in+ovo+chorioallantoic+membrane+engraftment+to+culture+testes+from+neonatal+mice.">Use of in ovo chorioallantoic membrane engraftment to culture testes from neonatal mice.</a> Comparative Medicine. 64 (4), 264-269 (2014).</li><li>Martyn, I., Kanno, T. Y., Ruzo, A., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+a+human+organizer+by+combined+Wnt+and+Nodal+signaling.">Self-organization of a human organizer by combined Wnt and Nodal signaling.</a> Nature. 558 (7708), 132-135 (2018).</li></ol>

Embryonale vev isolasjon prosedyren finnesher ble forbedret fra tidligere metoder for å produsere vaktel-kylling chimeric embryoer i ulike biologiske sammenhenger3,5,6.
Denne tilnærmingen er egnet til å isolere ren embryonale vev uten at genetisk manipulasjon eller bruk av vev-spesifikke markører, som ofte ikke fastslått, begrense bruk av genmodifiserte dyr modeller. Det kan brukes å studere epi...

I 1970, ble en elegant vaktel-kylling-chimera-systemet utviklet av Le Douarin, åpner nye muligheter for å forstå rollen av celle migrasjon og mobilnettet interaksjoner under utvikling1,2. Modellen ble utviklet på premisset om at cellen utveksling mellom de to artene ikke ville betydelig forstyrre embryogenesis, senere bekreftet når studere mange utviklingsprosesser, inkludert dannelsen av nervøse og den blodkreft systemer1. Tar sistnevnte som et eksempel, syklisk bølger blodkreft progenitors kolonisere thymic epithelial rudiment ble først observert med vaktel-kylling chimera systemet3. For at var potensielle territorium thymus, endoderm av tredje og fjerde pharyngeal poser (3/4PP), mekanisk og enzymatisk isolert fra vaktel (q) embryo på 15 til 30 - somite scenen [embryonale dag (E) 1.5-E2.5]. Disse fasene tilsvarer kylling Hamburger og Hamilton4 (HH) - stadier 12-17. Isolering prosedyrer startet med bruk av trypsin å enzymatisk dissociate endoderm fra den tilknyttede mesenchyme. Den isolerte endoderm ble podet inn i somatopleura regionen en vert kylling (c) embryo på E3-E3.5 (HH-stadier 20-21). Denne heterologous mesenchyme ble ansett som "ettergivende" thymic epitel utvikling bidrar også til orgel formasjon3. Etter infiltrert påfølgende bølger av kylling vert blodbårne progenitor celler vaktel donor thymic epitel motparten bidrar thymus formasjonen i vert embryoet3.
Nylig en modifisert versjon av denne tilnærmingen ble også vist seg for å være viktig for å studere epithelial-mesenchymal interaksjoner i tidlige stadier av thymus formasjon5. I denne forbindelse ble vev involvert i dannelsen av ektopisk thymus i chimeric embryo3 isolert, både fra giver og vert embryoer, og tilhørende ex vivo. En forbedret protokollen ble brukt til å isolere vaktel 3/4PP endoderm (E2.5-E3) og kylling somatopleura mesoderm (E2.5-E3). Kort, embryonale vev ble isolert av mikrokirurgi med i vitro pancreatin fordøyelsen. Også var betingelsene for enzymatisk fordøyelsen, temperatur og tid med inkubering optimalisert vev-type og utviklingsstadiet (tabell 1).
Deretter ble isolert vev assosiert i en organotypic i vitro system for 48t, som tidligere rapportert5,6. I vitro foreningen av vev etterligner de lokale mobilnettet interaksjonene i embryo, overvinne noen begrensninger av i vivo manipulering. Dette systemet er spesielt nyttig å studere mobilnettet interaksjoner i komplekse morphogenic hendelser, for eksempel utvikling av pharyngeal apparatet.
Bidraget fra hver vev i thymus histogenesis og til heterospecific Association til å generere en thymus kan videre utforsket bruke CAM metodikk, tidligere detaljert5,7,8. Konsist, var kulturperler vev podet på CAM av cE8 embryo og bygge i ovo 10 dager. Deretter ble thymus formasjon evaluert av morfologisk analyse i høstet explants. Som de vaktel-kylling Realencyclopädie3, ble vaktel thymic epitel kolonisert av blodkreft stamfar celler (HPCs) fra kylling embryoet, som ble vist å bidra til orgel utvikling9,10 . HPCs overført fra embryoet til ektopisk chimeric thymus gjennom svært vascularized CAM5,7,8. Vaktel avledede thymic epitel kan identifiseres av immunhistokjemi ved hjelp av artsspesifikke antistoffer (dvs. QCPN - MAb vaktel PeriNuclear), overvinne behov for vev-spesifikke molekylære markører.
Denne eksperimentell metode, lar som i two-step rapportert i forrige publikasjonen8, modulering av signal av vanlige administrasjonen av farmakologiske agenter i vitro og ovo utvikling. Explants kan også høstes på noe tidspunkt i løpet av eksperimentet8.
Til slutt, isolasjon protokollen her detaljert tillater bevaring av de naturlige egenskapene og 3D-arkitektur embryonale vev, spesielt nyttig for detaljering i situ genuttrykk mønstre av embryonale territorier ellers utilgjengelig som konvensjonelle metoder. I tillegg kan transcriptome analyse tilnærminger, inkludert RNA-seq eller microarrays, også brukes i isolerte vev uten genetiske markører samtidig som en vev-spesifikke høy gjennomstrømning "omics" analyse.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1279px;" width="1277">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:379px;">Chicken fertilized eggs (Gallus gallus)</td>
			<td style="width:306px;">Pintobar, Portugal</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:445px;">Poultry farm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:379px;">Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix)</td>
			<td>Interaves, Portugal</td>
			<td></td>
			<td style="width:445px;">Bird farm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">15 mL PP centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430052</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">50 mL PP centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430290</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">60 x 20 mm pyrex dishes</td>
			<td>Duran group</td>
			<td style="width:149px;">21 755 41</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">100 x 20 mm pyrex dishes</td>
			<td>Duran group</td>
			<td style="width:149px;">21 755 48</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Metal grid</td>
			<td>Goodfellows</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:445px;">fine meshed&#160; stainless steel grid</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Membrane filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td style="width:149px;">DTTP01300</td>
			<td style="width:445px;">0.6 mm Isopore membrane filter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Petri dish, 35 x 10 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:149px;">P5112&#160;</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">60 x 30 mm pyrex bowls (Small size)</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:445px;">from supermarket&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">100 x 50 mm pyrex bowls (Large size)</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:445px;">from supermarket&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Transfer pipettes</td>
			<td>Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2041S</td>
			<td style="width:445px;">2 mL plastic pipet</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Glass pasteur pipette</td>
			<td>Normax</td>
			<td style="width:149px;">5426015</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Clear plastic tape</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:445px;">from supermarket&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:379px;">Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5</td>
			<td>BMA Biomedicals</td>
			<td>T-1302</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td style="width:445px;">Standart FBS</td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:379px;">Pancreatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-3292</td>
			<td style="width:445px;">Prepare a 25 mg/mL solution according to manufacturer&#39;s instructions; centrifuge and filter prior to aliquote and store at -20&#186;C. Aliquots can be kept frozen for several years.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>GIBCO, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">QCPN antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>QCPN</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement&#160;</td>
			<td>GIBCO, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>61870010</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit</td>
			<td>ELKEM/Silmid</td>
			<td>RH141001KG</td>
			<td style="width:445px;">To prepare the back base for petri dish</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">11251-30&#160;</td>
			<td style="width:445px;">Thin forceps</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Extra fine Bonn scissors, curved</td>
			<td style="width:306px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">14085-08</td>
			<td style="width:445px;">Curved scissors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Insect pins&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">26001-30</td>
			<td style="width:445px;">0.3 mm Stainless steel pin</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Micro spatula&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">10087-12</td>
			<td style="width:445px;">Transplantation spoon</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Minutien Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">26002-20</td>
			<td style="width:445px;">0.2 mm Stainless steel microscalpel</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Minutien Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">26002-10</td>
			<td style="width:445px;">0.1 mm Stainless steel microscalpel</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Moria Nickel Plated Pin Holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">26016-12</td>
			<td style="width:445px;">Nickel plated pin holder</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Moria Perforated Spoon</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">10370-17</td>
			<td style="width:445px;">Skimmer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Wecker Eye Scissor</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">15010-11</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Camera</td>
			<td>Leica Microsystems&#160;</td>
			<td style="width:149px;">MC170 HD</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems&#160;</td>
			<td style="width:149px;">DM2500</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">NanoZoomer&#160;S360 Digital&#160;slide scanner&#160;</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:149px;">C13220-01</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Stereoscope</td>
			<td>Leica Microsystems&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Leica M80</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of embryonic tissues and formation of quail-chicken chimeric organs using the thymus example

Kapasitet til å isolere embryonale vev var et viktig skritt for å etablere vaktel-kylling chimera systemet, som i sin tur har gitt ubestridte bidrag til avsløring nøkkelprosesser i utviklingsbiologi.
Her er beskrevet en optimalisert metode for å isolere embryonale vev fra vaktel og kyllinger mikrokirurgi og enzymatiske fordøyelsen, mens bevare sin biologiske egenskaper. Etter isolasjon, vev fra begge arter er knyttet på en i vitro organotypic analysen for 48 h. vaktel og kylling vev kan bli diskriminert distinkte kjernefysiske egenskaper og molekylære markører slik at studiet av den cellulære kryss-snakk mellom heterospecific tilordning av vev. Denne tilnærmingen er derfor et nyttig verktøy for å studere komplekse vev interaksjoner i utviklingsprosesser med svært dynamiske romlige modifikasjoner, som de oppstår under pharyngeal morphogenesis og dannelsen av foregut endoderm-avledet organer. Denne eksperimentelle ble først utviklet for å studere epithelial-mesenchymal interaksjoner i tidlige stadier av thymus formasjon. I dette, den endoderm-avledet potensielle thymic rudiment og mesoderm-avledet mesenchyme, ble isolert fra vaktel og kylling embryoer, henholdsvis.
Kapasiteten til de tilknyttete vev å generere organer kan videre testes av pode dem på chorioallantoic membran (CAM) av en kylling fosteret. CAM gir næringsstoffer og gir gass utvekslinger på explanted vev. Etter 10 dager i ovo utvikling, kan chimeric organer analyseres i høstet explants av konvensjonelle morfologiske metoder. Denne fremgangsmåten kan også studere vev-spesifikke bidrag under orgel formasjon, fra den første utviklingen (i vitro utvikling) til sluttfasen av organogenesen (i ovo utvikling).
Til slutt forbedret isolasjon metoden også gir tredimensjonalt (3D) bevart embryonale vev, som også kan brukes for høy oppløsning topografiske analyse av vev-spesifikke genuttrykk mønstre.

Protokollen detaljer en metode for å isolere avian embryonale vev i flere mobilnettet og utviklingspsykologi biologi tekniske tilnærminger. Denne metoden var tidligere ansatt å studere epithelial-mesenchymal interaksjoner i tidlige stadier av thymus formasjon5. Her, er nye resultater vist i figur 1 og figur 2, bruke lignende tilnærminger.
<im...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Embryonic Tissues and Formation of Quail-Chicken Chimeric Organs Using The Thymus Example at JoVE.com

Isolation of Embryonic Tissues and Formation of Quail-Chicken Chimeric Organs Using The Thymus Example

Denne artikkelen inneholder en metode for å isolere ren embryonale vev fra vaktel og kylling embryoer som kan kombineres til skjemaet ex vivo chimeric organer.

Isolering av embryonale vev og dannelse av vaktel-kylling Chimeric organer Thymus eksemplet

The capacity to isolate embryonic tissues was an essential step for establishing the quail-chicken chimera system, which in turn has provided undisputed ...

Det overordnede målet med denne prosedyren er å presentere en optimalisert eksperimentell tilnærming for å isolere embryonale vev fra vaktel og kylling embryoer. Med denne teknikken får vi rene embryonale vev som kan brukes i genuttrykksstudier og funksjonelle analyser. Vev fra vaktel og kylling embryoer er isolert av mikrokirurgi og utsatt for in vitro enzymatisk fordøyelse samtidig bevare sine biologiske egenskaper.Etter isolasjon kan de tredimensjonale bevarte vevene brukes til høyoppløsnings topografiske genuttrykksmønstreanalyse. Denne tilnærmingen er spesielt nyttig for detaljering in situ genuttrykk i embryonale områder ellers utilgjengelig ved konvensjonelle metoder. I tillegg kan transkripsjonsanalyse tilnærminger også brukes i isolert vev uten å kreve genetiske markører, samtidig som det gir en vevsspesifikk høy gjennomstrømning omic analyse.Alternativt kan det isolerte vevet fra begge artene være forbundet i en in vitro organotypisk analyse i 48 timer. Denne tilnærmingen gjør det mulig å studere vev interaksjoner, siden vaktel og kylling celler kan diskrimineres av distinkte kjernefysiske funksjoner og molekylære markører. Kapasiteten til kulturvevet for å danne organer kan testes videre av i ovo analyse.Denne metoden er derfor et nyttig verktøy for å studere komplekse vevsinteraksjoner i utviklingsprosesser med svært dynamiske spacial modifikasjoner og kan også bidra til å avsløre potensialet i spesifikke embryonale territorier til dannelsen av organer. Som et eksempel er heri beskrevet dannelsen av vaktel-kylling chimeric thymus fra isolert embryonale vev. For det første er endeodermet av den tredje og fjerde svelgeposene, den potensielle thymiske rudimenten isolert fra svelgområdet av vaktelembryoer med tre utviklingsdager.Deretter er dette vevet forbundet med et mesenchyme som er i stand til å støtte utviklingen, somatopleura mesoderm. Til slutt er den heterospesifikke foreningen av vev dyrket in vitro og i ovo for å danne en kimerisk thymus. Utfør alle eggmanipuleringsprosedyrer under sterile forhold ved hjelp av en horisontal laminær strømningshette og steriliserte instrumenter og materialer.Befruktede vaktelegg ble inkubert med luftkammeret vendt opp. For å begynne, fjern vakteleggene fra inkubatoren. Forbered en stor borosilikatglassbolle fylt med kald PBS.Med buet saks, trykk og kutt et sirkulært hull i skallet på et vaktegg med tre dager med inkubasjon. Gjør hullet i motsatt side av egget sløv, og overfør eggeplommen til bollen med kald PBS. Fjern embryoet fra eggeplommen ved å kutte vitellinmembranen eksternt til ekstraembryoniske kar.Ved hjelp av tynne tang, overfør embryoet til en liten bolle fylt med kald PBS, og flytt deretter embryoet til en petriskål med svart base med en skimmer. Fjern svelgeregionen som inneholder den tredje og fjerde svelgeposene som beskrevet i tidligere Jove SPA-ligation. Deretter overfører du den tredje og fjerde svelgealbueregionen til et glass som er fylt med kaldt pankreatin og inkubere i en time, på is, for enzymatisk fordøyelse.Legg merke til at inkubasjonsperioden for enzymatisk fordøyelse avhenger av utviklingsstadiet. Plasser glassfatet under stereomikroskopet og isolere endodermen fra tredje og fjerde svelgebueregion, ved hjelp av to mikroskalpell i en holder. Først plasserer svelgeregionen med dorsalsiden opp, og viser internt endodermen og ectoderm i den ytre overflaten.Vær oppmerksom på ectoderm, endoderm, mesenchyme, hjerterør og ventral del av nevrale røret. Fjern nevrale røret og mesodermen festet til den dorsale overflaten av svelget endoderm. Vær oppmerksom på endodermen i svelget, den fjerde og tredje svelgeposene og hjerterøret.Med dorsalsiden opp, ta forsiktig av og fjern mesenchymen mellom svelgebuene og utsett svelgposene. Utfør denne prosedyren på den andre siden av svelgeregionen. Fjern mesenchyme festet til den mest bakre delen av endodermen og observere den fjerde svelgeposen.Med bakre side opp, observere både venstre og høyre fjerde svelgeposer. Fortsett med å fjerne mesenchyme festet til den mest bakre delen av endodermen og til den andre posen. Fjern hjerterøret og mesenchyme rundt de indre posene.Med ventral side opp, observere svelget endoderm, og høyre side av den andre svelgebuen. På dette stadiet bør endodermen av skjoldbrusk rudiment være synlig. Løsne ectoderm av den andre og tredje pharyngeal buer og forsiktig fjerne mesenchyme av buene.Vær oppmerksom på fjerning av mesenchyme av den andre svelgealbuen på høyre side. Legg merke til plasseringen av fjerde og tredje poser og skjoldbrusk rudiment. Fjern restene til mesenchymale celler festet til svelgeposene.Vær oppmerksom på den tredje og fjerde posene på høyre side og den fjerde posen fra venstre side. Gjenta mesenchyme løsrivelse av venstre side. Vær nå den tredje posen på venstre side.Vær oppmerksom på mesenchyme løsrivelse av den andre buen på venstre side. Vær oppmerksom på at alle overflater og løsninger skal holdes kalde under denne prosedyren. Bytt til en ny kald pankreatisk løsning og rett i tilfelle det tar lang tid å dissekere vevet.Til slutt, gjør et tverrgående kutt mellom andre og tredje svelgeposer for å fjerne de andre posene og skjoldbrusk rudimentet. På dette punktet består den isolerte endodermen av den tredje og fjerde svelgeposene og den bakre spissen av svelget. Fjern restene frittliggende mesenchyme ved hjelp av to mikroskalper.Overfør det isolerte endodermet til en glassfat fylt med kaldt fosterbovinserum og hold det på is under fremstillingen av in vitro-analysen. Egg ble plassert i horisontal stilling og oversiden merket for bruk av kull. For å begynne, fjern eggene fra inkubatoren.Med en buet saks, åpne et lite hull i skallet, sett inn en nål og aspirer to milliliter albumin med en 10 milliliter sprøyte. Åpne et sirkulært hull i det merkede området av skallet og kutt vitellinmembranen eksternt til de ekstra embryonale karene mens du holder embryoet med tynne tang. Under et stereomikroskop plasserer du embryoet i en petriskål med svart base som inneholder kald PBS.Bruk fire insektpinner for å holde embryoet til bunnen av platen. Plasser pinnene i den ekstraembryonic regionen danner en firkantet form. Utfør to kutt mellom somites 19 og 24 transversalt til embryoaksen og kryssing av embryoet.Slipp denne delen ved å kutte de marginale embryonale kantene. Vær oppmerksom på sideplaten, nevrale rør og somites. Aspirer og overfør vevet til en glassrett fylt med kaldt pankreatin.Inkuber i 30 minutter på is for enzymatisk fordøyelse. Under stereomikroskopet isolerer du mesodermen fra det omkringliggende vevet ved hjelp av to mikroskalper i holdere. Vær oppmerksom på somatopleura mesoderm, splanchnopleura, nevralrør og ectoderm.Først fjerner du ectoderm på overflaten. Vær oppmerksom på somatopleura mesoderm dissosiert fra ectoderm. Deretter må du forsiktig koble ventrally plassert splanchnopleura fra somatopleura.Vær oppmerksom på høyre lateral mesoderm av somatopleura. Slipp den ved å kutte den i en parallell bevegelse til nevrale røret. Vær oppmerksom på at alle overflater og løsninger skal holdes kalde under denne prosedyren.Bytt til en ny kald pankreatisk løsning og rett i tilfelle det tar lang tid å dissekere vevet. Vær oppmerksom på venstre lateral mesoderm av somatopleura, somites, nevralrør og ectoderm. Gjenta mesoderm utgivelsen av denne siden.Gjør langsomme bevegelser med mikroskalpellen. De eksponerte ekstracellulære matriseproteinene sitter gjennom vev og instrumenter, og forhindrer væskebevegelser. Skjær forsiktig somatopleuraen i en parallell bevegelse til nevrale røret.Overfør det isolerte mesodermet til en glassfat fylt med kaldt fosterbovinserum og hold det på is under fremstilling av in vitro-analyse. Legg en finmasket metallrist i en petriskål og fyll med kulturmedium. Fjern de store væskene for å jevne ut mediumoverflaten med toppen av risten.Ved hjelp av tynne tang dypper du et membranfilter i kulturmediet og legg det forsiktig på toppen av risten for å ha en overflate i kontakt med henne. Under stereomikroskopet overfører du det isolerte endeodermet fra glassfatet til membranfilteret ved å skånsom skyve ved hjelp av slikkepott og tynne tang. Gjenta denne prosedyren for det isolerte mesodermet.Ved hjelp av en mikroskalpell, bland vevet for å maksimere sin tilknytning. Plasser forsiktig det tilhørende vevet i en fuktet inkubator ved 37 grader med 5% CO2 i 48 timer. Etter inkubasjonsperioden transplanterer kulturvevet på coriolantypemembranen og lar den utvikle seg i oval i ytterligere 10 dager for å fullføre organdannelse som tidligere beskrevet.Her er retikulær metode som gjør at isolering av fugleembryonale vev kan brukes i forskjellige eksperimentelle tilnærminger. Som et eksempel ble uttrykket av gener som er kjent for å være involvert i dannelsen av svelgposene også evaluert en isolert endoderm som inneholder andre, tredje og fjerde svelgeposer fra kyllingembryoer på embryonale dag tre og en halv av en halv av en halv mount in situ hybridisering. Uttrykket av Sonic Hedgehog ble oppdaget i endeodermet av den sentrale svelget og ekskludert fra posene, mens BMP7 ble uttrykt i endepunktet av den andre og tredje svelgeposer og ekskludert fra den sentrale svelget og fjerde svelgepose.Isolert vev kan også være vitro spesielt forbundet in vitro i 48 timer, transplantere på coriolan type membran, og lov til å utvikle seg i ytterligere 10 dager. Explants kan analyseres ved konvensjonell histologi og immunohistochemistry. Noen representative resultater av foreningen av vaktel endoderm fra tredje og fjerde svelgeposer med kylling somatopleura mesoderm er følgende grafts viste en fullt dannet kimeriske thymus med vaktel avledet thymic epitelceller positivt for QCPN og kylling lymfoidceller.I tillegg viste cytokeratinpositivthymic epitel normale morfologiske egenskaper, og viste en typisk retikulær arkitektur. Etter å ha sett denne videoen, bør du ha en god forståelse av hvordan du isolerer vaktel og kylling embryonale vev som kan brukes i genuttrykksstudier, og ved å danne kimeriske organer kan også bidra til å tyde kompleksiteten i organgenetikk.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transkriptom profilering av<em&gt; In-Vivo</em&gt; Produserte Bovine Pre-implantasjon Embryoet ved hjelp av to-farge microarray plattform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Epigenetisk regulering av Cardiac Differensiering av embryonale stamceller og vev

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues

Isolasjon og Differensiering av adipose-avledet stamceller fra svine Subkutan fettvev

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

Isolering av Murine Embryonic Hemogenic endotelceller

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

Culture of Murine embryonale metatarsals: en fysiologisk modell av endochondral Forbening

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

Protokoller for Visualisering Steroidogenic organer og deres Interaktiv organer med Farging i bananflue<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Bruke i Vivo og vev og celle Explant tilnærminger å studere Morphogenesis og patogenesen av embryonale og Perinatal Aorta

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic ...

Two-step Approach to Explore Early- and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm

To-trinns tilnærming til utforske tidlig og sent-etappene Organ-formasjonen i Avian modellen: Thymus og Parathyroid Glands organogenesen paradigme

The avian embryo, as an experimental model, has been of utmost importance for seminal discoveries in developmental biology. Among several approaches, the ...

Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

Tredimensjonale Organotypic kulturer av Vestibular og auditiv Sanseorganer

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...

A Familial Hypercholesterolemia Human Liver Chimeric Mouse Model Using Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocytes

En familiær hyperkolesterolemi menneskelige leveren Chimeric musemodell med indusert Pluripotent Stamcelle-avledet hepatocytter

Familial hypercholesterolemia (FH) is mostly caused by low-density lipoprotein receptor (LDLR) mutations and results in an increased risk of early-onset ...