Name: isolation of embryonic tissues and formation of quail-chicken chimeric organs using the thymus example
Uploaded: 2019-02-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Embryonic Tissues and Formation of Quail-Chicken Chimeric Organs Using The Thymus Example at JoVE.com

Författarna är tacksamma att Isabel Alcobia för den kritiska behandlingen av manuskript, Mário Henriques för video berättande samt Vitor Proa från tjänsten histologi av Instituto de Histologia e Biologia gör skattemyndigheten, Rio de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa, för teknisk support. Vi är särskilt tacksamhetsskuld till Paulo Caeiro och Hugo Silva från det Unidade de audiovisuais (audiovisuella enheten), Rio de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa för deras enastående engagemang för produktionen av denna video. Vi erkänner Leica Microsystems för vänligt att ge ett stereoskop utrustad med en video-system och Interaves - Sociedade Agro-Pecuária, S.A för att bidra med vaktel befruktade ägg. Detta arbete stöds av Rio de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).

Alla dessa experiment följa djurens vård och etiska riktlinjer vid Centro Académico de Medicina de Lisboa.
1. befruktade vaktel och kyckling ägg inkubation
<ol><li>Plats befruktade ägg av japansk vaktel (Coturnix coturnix japonica) i en 38 ° C befuktade inkubator för 3 dagar. Ruva äggen (ägg trubbiga änden) uppåt i luftkammaren. Obs: Den befuktade miljön uppnås genom att placera en vattenbehållare längst ned i inkubatorn.</li>
	<li>Inkubera befruktade ägg kyckling...

<ol>
	<li>Le Douarin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nogent+Institute--50+years+of+embryology.">The Nogent Institute--50 years of embryology.</a> The International Journal of Developmental Biology. 49 (2-3), 85-103 (2005).</li><li>Le Douarin, N. M., Teillet, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+migration+of+neural+crest+cells+to+the+wall+of+the+digestive+tract+in+avian+embryo.">The migration of neural crest cells to the wall of the digestive tract in avian embryo.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 30 (1), 31-48 (1973).</li><li>Le Douarin, N. M., Jotereau, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+of+cells+of+the+avian+thymus+through+embryonic+life+in+interspecific+chimeras.">Tracing of cells of the avian thymus through embryonic life in interspecific chimeras.</a> Journal of Experimental Medicine. 142 (1), 17-40 (1975).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.+1951.">A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951.</a> Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).</li><li>Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Bmp4+signalling+in+the+epithelial-mesenchymal+interactions+that+take+place+in+early+thymus+and+parathyroid+development+in+avian+embryos.">Modulation of Bmp4 signalling in the epithelial-mesenchymal interactions that take place in early thymus and parathyroid development in avian embryos.</a> Developmental Biology. 361 (2), 208-219 (2012).</li><li>Takahashi, Y., Bontoux, M., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelio--mesenchymal+interactions+are+critical+for+Quox+7+expression+and+membrane+bone+differentiation+in+the+neural+crest+derived+mandibular+mesenchyme.">Epithelio--mesenchymal interactions are critical for Quox 7 expression and membrane bone differentiation in the neural crest derived mandibular mesenchyme.</a> Embo Journal. 10 (9), 2387-2393 (1991).</li><li>Figueiredo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+and+Hedgehog+in+the+thymus/parathyroid+common+primordium:+Crosstalk+in+organ+formation.">Notch and Hedgehog in the thymus/parathyroid common primordium: Crosstalk in organ formation.</a> Developmental Biology. 418 (2), 268-282 (2016).</li><li>Figueiredo, M., Neves, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+Approach+to+Explore+Early-and+Late-stages+of+Organ+Formation+in+the+Avian+Model:+The+Thymus+and+Parathyroid+Glands+Organogenesis+Paradigm+Video+Link.">Two-step Approach to Explore Early-and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm Video Link.</a> Journal of Visualuzed Experiments. , (2018).</li><li>Nehls, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+genetically+separable+steps+in+the+differentiation+of+thymic+epithelium.">Two genetically separable steps in the differentiation of thymic epithelium.</a> Science (New York, N.Y.). 272 (5263), 886-889 (1996).</li><li>Morahan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nu+gene+acts+cell-autonomously+and+is+required+for+differentiation+of+thymic+epithelial+progenitors.">The nu gene acts cell-autonomously and is required for differentiation of thymic epithelial progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (12), 5742-5746 (1996).</li><li>Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DiGeorge+syndrome+phenotype+in+mice+mutant+for+the+T-box+gene,+Tbx1.">DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1.</a> Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).</li><li>Nie, X., Brown, C. B., Wang, Q., Jiao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+Bmp4+from+the+Tbx1+expression+domain+causes+abnormal+pharyngeal+arch+artery+and+cardiac+outflow+tract+remodeling.">Inactivation of Bmp4 from the Tbx1 expression domain causes abnormal pharyngeal arch artery and cardiac outflow tract remodeling.</a> Cells Tissues Organs. 193 (6), 393-403 (2011).</li><li>Zou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+of+the+third+pharyngeal+pouch+into+thymus/parathyroid+by+Six+and+Eya1.">Patterning of the third pharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1.</a> Developmental Biology. 293 (2), 499-513 (2006).</li><li>Davey, M. G., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chicken+as+a+model+for+embryonic+development.">The chicken as a model for embryonic development.</a> Cytogenetic and Genome Research. 117 (1-4), 231-239 (2007).</li><li>Nowak-sliwinska, P., Segura, T., Iruela-arispe, M. L., Angeles, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chicken+chorioallantoic+membrane+model+in+biology,+medicine+and+bioengineering.">The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering.</a> Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).</li><li>Uematsu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+in+ovo+chorioallantoic+membrane+engraftment+to+culture+testes+from+neonatal+mice.">Use of in ovo chorioallantoic membrane engraftment to culture testes from neonatal mice.</a> Comparative Medicine. 64 (4), 264-269 (2014).</li><li>Martyn, I., Kanno, T. Y., Ruzo, A., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+a+human+organizer+by+combined+Wnt+and+Nodal+signaling.">Self-organization of a human organizer by combined Wnt and Nodal signaling.</a> Nature. 558 (7708), 132-135 (2018).</li></ol>

Det förfarande för isolering av embryonal vävnad som anges här har förbättrats från tidigare tekniker för att producera vaktel-kyckling chimära embryon i olika biologiska sammanhang3,5,6.
Denna metod är lämplig att isolera ren embryonala vävnader utan att genetisk manipulation eller användning av vävnad-specifika markörer, som ofta är obestämd, begränsa användningen av genetiskt mod...

I början av 1970, har en elegant vaktel-kyckling chimera-systemet utvecklats av Le Douarin, öppna nya vägar för att förstå rollen av cellmigration och cellulära interaktioner under utveckling1,2. Modellen som utformades på förutsättningen att cellen utbyte mellan de två arterna avsevärt inte skulle störa embryogenes, bekräftade senare när används för att studera många utvecklingsprocesser, inklusive bildandet av nervsystemet och den hematopoetiska system1. Tar den senare som ett exempel, de cykliska vågorna av hematopoetiska progenitorceller kolonisera den thymic epitelial rudiment observerades först använder vaktel-kyckling chimera system3. För det var tymus, endoderm av de tredje och fjärde faryngala påsarna (3/4PP), blivande territorium mekaniskt och enzymatiskt isolerad från vaktel (q) embryon på 15 till 30 - somite Stadium [embryonala dag (E) 1,5-E2.5]. Dessa stadier motsvarar kyckling hamburgare och Hamilton4 (HH) - arrangerar 12-17. Förfaranden som isolering började med användning av trypsin att enzymatiskt sära endoderm från den bifogade mesenchyme. Isolerade endoderm var ympade in i somatopleura regionen av en värd kyckling (c) embryo på E3-E3.5 (HH-stadier 20-21). Detta heterologa mesenchyme ansågs ”tillåtande” thymic epitel utvecklingen bidrar också till orgel bildandet3. Efteråt, infiltrerat successiva vågor av kyckling värd blodburna stamceller vaktel givare thymic epitelial motstyckena bidrar till brässen bildas i värd embryo3.
Mer nyligen, en modifierad version av detta synsätt var också visat sig vara viktigt för att studera epitelial-mesenkymala interaktioner tidigt skede-thymus bildandet5. I detta avseende var vävnaderna som är inblandade i bildandet av ektopisk bräss i chimära embryon3 isolerad, båda från givare och värd embryon, och tillhörande ex vivo. Ett förbättrat protokoll användes för att isolera vaktel 3/4PP endoderm (E2.5-E3) och kyckling somatopleura mesoderm (E2.5-E3). Kort, embryonala vävnader var isolerade av mikrokirurgi och omfattas av in vitro-pankreatin matsmältningen. Dessutom var villkoren för enzymatisk nedbrytning, temperatur och tid för inkubation optimerad enligt vävnadstyp och utvecklingsstadier (tabell 1).
Nästa, isolerade vävnader var förenade i en organotypic i vitro system för 48 h, som tidigare rapporterats5,6. In vitro-föreningen av vävnader härmar de lokala cellulära interaktioner i embryot, övervinna vissa begränsningar av invivo manipulation. Detta system är särskilt användbart för att studera cellulära interaktioner i komplexa morfogena händelser, såsom utveckling av faryngeal apparaten.
Varje vävnad i thymus histogenesis bidrag, liksom möjligheten för föreningen heterospecific att generera en bräss kan vara ytterligare utforskas med hjälp av CAM metodik, tidigare detaljerade5,7,8. Kortfattat, var odlade vävnader ympade på CAM cE8 embryon och får utvecklas i ovo för 10 dagar. Sedan utvärderades bräss bildandet av Morfologisk analys i de skördade bladsticklingar. Som i den klassiska vaktel-kyckling studier3koloniserades vaktel thymic epitelet av hematopoetiska stamceller (HPCs) härrör från kyckling embryot, som senare visades att bidra till orgel utveckling9,10 . HPCs migrerade från embryot till ektopisk chimära tymus genom den högt vaskulariserad CAM5,7,8. Vaktel härledda thymic epitel kan identifieras genom immunhistokemi med artspecifika antikroppar (dvs. QCPN - MAb vaktel perinukleära), övervinna behovet vävnadsspecifika molekylära markörer.
Denna experimentella metod, tillåter som den tvåstegsstrategi som rapporterats i tidigare publikation8, moduleringen av signalvägar genom regelbunden administrering av farmakologiska agenter under in vitro- och ovo utveckling. Dessutom kan bladsticklingar skördas vid någon tidpunkt av de experiment8.
Slutligen, isolering protokollet här detaljerade tillåter bevarandet av de naturliga egenskaperna och 3D-arkitekturen av embryonala vävnader, särskilt användbart för detailing jordbaserad gen-uttryck mönster av embryonala territorier annars otillgängliga av konventionella metoder. Dessutom kan transkriptom analys metoder, inklusive RNA-seq eller microarrays, också tillämpas i isolerade vävnader utan att genetiska markörer samtidigt som den ger en vävnadsspecifika hög genomströmning ”omics” analys.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1279px;" width="1277">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:379px;">Chicken fertilized eggs (Gallus gallus)</td>
			<td style="width:306px;">Pintobar, Portugal</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:445px;">Poultry farm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:379px;">Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix)</td>
			<td>Interaves, Portugal</td>
			<td></td>
			<td style="width:445px;">Bird farm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">15 mL PP centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430052</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">50 mL PP centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430290</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">60 x 20 mm pyrex dishes</td>
			<td>Duran group</td>
			<td style="width:149px;">21 755 41</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">100 x 20 mm pyrex dishes</td>
			<td>Duran group</td>
			<td style="width:149px;">21 755 48</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Metal grid</td>
			<td>Goodfellows</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:445px;">fine meshed&#160; stainless steel grid</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Membrane filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td style="width:149px;">DTTP01300</td>
			<td style="width:445px;">0.6 mm Isopore membrane filter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Petri dish, 35 x 10 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:149px;">P5112&#160;</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">60 x 30 mm pyrex bowls (Small size)</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:445px;">from supermarket&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">100 x 50 mm pyrex bowls (Large size)</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:445px;">from supermarket&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Transfer pipettes</td>
			<td>Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2041S</td>
			<td style="width:445px;">2 mL plastic pipet</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Glass pasteur pipette</td>
			<td>Normax</td>
			<td style="width:149px;">5426015</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Clear plastic tape</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:445px;">from supermarket&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:379px;">Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5</td>
			<td>BMA Biomedicals</td>
			<td>T-1302</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td style="width:445px;">Standart FBS</td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:379px;">Pancreatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-3292</td>
			<td style="width:445px;">Prepare a 25 mg/mL solution according to manufacturer&#39;s instructions; centrifuge and filter prior to aliquote and store at -20&#186;C. Aliquots can be kept frozen for several years.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>GIBCO, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">QCPN antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>QCPN</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement&#160;</td>
			<td>GIBCO, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>61870010</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit</td>
			<td>ELKEM/Silmid</td>
			<td>RH141001KG</td>
			<td style="width:445px;">To prepare the back base for petri dish</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">11251-30&#160;</td>
			<td style="width:445px;">Thin forceps</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Extra fine Bonn scissors, curved</td>
			<td style="width:306px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">14085-08</td>
			<td style="width:445px;">Curved scissors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Insect pins&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">26001-30</td>
			<td style="width:445px;">0.3 mm Stainless steel pin</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Micro spatula&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">10087-12</td>
			<td style="width:445px;">Transplantation spoon</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Minutien Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">26002-20</td>
			<td style="width:445px;">0.2 mm Stainless steel microscalpel</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Minutien Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">26002-10</td>
			<td style="width:445px;">0.1 mm Stainless steel microscalpel</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Moria Nickel Plated Pin Holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">26016-12</td>
			<td style="width:445px;">Nickel plated pin holder</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Moria Perforated Spoon</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">10370-17</td>
			<td style="width:445px;">Skimmer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Wecker Eye Scissor</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">15010-11</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Camera</td>
			<td>Leica Microsystems&#160;</td>
			<td style="width:149px;">MC170 HD</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems&#160;</td>
			<td style="width:149px;">DM2500</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">NanoZoomer&#160;S360 Digital&#160;slide scanner&#160;</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:149px;">C13220-01</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Stereoscope</td>
			<td>Leica Microsystems&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Leica M80</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of embryonic tissues and formation of quail-chicken chimeric organs using the thymus example

Förmåga att isolera embryonala vävnader var ett viktigt steg för att fastställa vaktel-kyckling chimera systemet, vilket i sin tur har lämnat obestritt bidrag till avtäckningen nyckelprocesser i utvecklingsbiologi.
Är häri beskrivs en optimerad metod för att isolera embryonala vävnader från vaktel och höns av mikrokirurgi och enzymatisk nedbrytning samtidigt bevara sin biologiska egenskaper. Efter isolering, vävnader från båda arterna är associerade på in vitro-organotypic test för 48 h. vaktel och kyckling vävnader kan diskrimineras av olika nukleära funktioner och molekylära markörer så att studiet av den cellulära överhörning mellan heterospecific föreningen i vävnader. Detta tillvägagångssätt är därför ett användbart verktyg för att studera komplexa vävnad interaktioner i utvecklingsprocesser med högdynamiska rumsliga modifieringar, såsom de som inträffat under faryngala morfogenes och bildandet av framtarmen endoderm-derived organ. Detta experimentella tillvägagångssätt utvecklades först för att studera de epiteliala-mesenkymala interaktionerna tidigt skede-av tymus bildandet. I detta, den endoderm-derived blivande thymic rudiment och mesoderm-derived mesenchyme, var isolerade från vaktel och kyckling embryon, respektive.
De omkringliggande vävnaderna förmåga att generera organ kan testas ytterligare genom ympning dem på det chorioallantoic membranet (CAM) av en kyckling embryo. CAM ger näringsämnen och gas utbyte till explanterad vävnader. Efter 10 dagars ovo utveckling, kan chimär organ analyseras i de skördade bladsticklingar av konventionella morfologiska metoder. Detta förfarande kan också studera vävnadsspecifika bidrag under organ kan bildas, från dess ursprungliga utveckling (in vitro-utveckling) till slutskedet av organogenesen (i ovo utveckling).
Slutligen, förbättrad isolering metoden också ger tredimensionellt (3D) bevarade embryonala vävnader, som också kan användas för högupplösta topografisk analys av vävnadsspecifika-genuttryck mönster.

Protokollet beskrivs en metod för att isolera aviär embryonala vävnader som ska användas i flera cellulär och utvecklingsbiologi tekniska metoder. Denna metod var tidigare anställd att studera epitelial-mesenkymala interaktioner under tidiga stadier av tymus bildandet5. Häri, visas nya resultaten i figur 1 och figur 2, med liknande metoder.
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Embryonic Tissues and Formation of Quail-Chicken Chimeric Organs Using The Thymus Example at JoVE.com

Isolation of Embryonic Tissues and Formation of Quail-Chicken Chimeric Organs Using The Thymus Example

Denna artikel ger en metod för att isolera ren embryonala vävnader från vaktel och kyckling embryon som kan kombineras för att bilda ex vivo chimära organ.

Isolering av embryonala vävnader och bildandet av vaktel-kyckling chimära organ med exemplet bräss

The capacity to isolate embryonic tissues was an essential step for establishing the quail-chicken chimera system, which in turn has provided undisputed ...

Det övergripande målet med detta förfarande är att presentera en optimerad experimentell metod för att isolera embryonala vävnader från vaktel och kyckling embryon. Med denna teknik får vi rena embryonala vävnader som kan användas i genuttrycksstudier och funktionella analyser. Vävnader från vaktel och kyckling embryon är isolerade av mikrokirurgi och föremål för in vitro enzymatisk matsmältning samtidigt bevara dess biologiska egenskaper.Efter isolering, de tredimensionella bevarade vävnader kan användas för hög upplösning topografiska gen uttryck mönster analys. Detta tillvägagångssätt är särskilt användbart för att specificera in situ genuttryck i embryonala territorier annars otillgängliga med konventionella metoder. Dessutom kan transkriptomanalysansatser också tillämpas i isolerade vävnader utan att genetiska markörer krävs, samtidigt som en vävnadsspecifik hög genomströmningsanalys.Alternativt kan de isolerade vävnaderna från båda arterna associeras i en in vitro-organotypisk analys i 48 timmar. Detta tillvägagångssätt gör det möjligt att studera vävnader interaktioner, eftersom vaktel och kycklingceller kan diskrimineras av distinkta nukleära funktioner och molekylära markörer. Kapaciteten hos kulturvävnaderna att bilda organ kan testas ytterligare av i ovo-analys.Denna metod är därför ett användbart verktyg för att studera komplexa vävnadsinteraktioner i utvecklingsprocesser med mycket dynamiska spacialmodifikationer och kan också bidra till att avslöja potentialen hos specifika embryonala territorier till bildandet av organ. Som ett exempel, häri beskrivs bildandet av vaktel-kyckling chimär bräss från isolerade embryonala vävnader. Först endoderm av den tredje och fjärde faryngeal påsar, den blivande thymic rudiment är isolerade från faryngeal regionen vaktel embryon med tre dagar av utveckling.Sedan, denna vävnad är associerad med en mesenchyme som kan stödja dess utveckling, den somatopleura mesoderm. Slutligen är den heterospecifika sammanslutningen av vävnader odlade in vitro och i ovo för att bilda en chimär bräss. Utför alla förfaranden ägg manipulation i sterila förhållanden med hjälp av en horisontell laminär flöde huva och steriliserade instrument och material.Befruktade vaktelägg ruvades med luftkammaren uppåt. Till att börja, ta bort vaktel ägg från ruvmaskinen. Förbered en stor borosilikatglasskål fylld med kall PBS.Med böjd sax, peka och skär ett cirkulärt hål i skalet av ett vaktel ägg med tre dagars inkubering. Gör hålet i motsatt sida av ägget trubbig, och överföra äggulan till skålen med kalla PBS. Avlägsna embryot från äggulan genom att klippa vitellinemembranet utvändigt till extraembryoniska kärl.Med hjälp av tunna tärnor, överför embryot till en liten skål fylld med kall PBS, flytta sedan embryot till en petriskål med svart bas med en skimmer. Avlägsna faryngealregionen som innehåller den tredje och fjärde faryngeal portionspåsar som beskrivs i tidigare Jove SPA-ligatur. Sedan överför den tredje och fjärde faryngalbågeregionen till ett glas som är fyllt med kall pankreatin och ruvar i en timme, på is, för enzymatisk matsmältning.Observera att inkubationstiden för enzymatisk matsmältning beror på utvecklingsstadiet. Placera glasfatet under stereomikroskopet och isolera endolmet från den tredje och fjärde faryxbågsregionen, med hjälp av två mikroskalpell i en hållare. Placera först faryngealregionen med ryggsidan upp, visar internt endodermen och ektodermen i den yttre ytan.Observera ektoderm, endoderm, mesenchyme, hjärtrör, och ventrala delen av neuralröret. Ta bort neuralröret och mesodermen som är fäst vid den dorsala ytan av faryngeal endoderm. Observera endoderm av svalget, den fjärde och tredje faryngeal påsar, och hjärtat röret.Med ryggsidan uppåt lossar och avlägsnar du försiktigt mesenkymen mellan faryngealvalven och exponerar faryngealpåsarna. Utför denna procedur i den andra sidan av faryngealregionen. Ta bort mesenchymen fäst vid den mest bakre delen av endodermen och observera den fjärde faryngeal påsen.Med bakre sidan upp, observera både vänster och höger fjärde faryngeal påsar. Fortsätt genom att ta bort mesenchymen som är fäst vid den mest bakre delen av endodermen och till den andra påsen. Ta bort hjärtröret och mesenchymen som omger de inre portionspåsarna.Med ventrala sidan upp, observera svalget endoderm, och den högra sidan av den andra faryngeal bågen. I detta skede bör endodermen av sköldkörteln rudiment vara synlig. Lösgör ektodermen i den andra och tredje faryngeal valv och försiktigt ta bort mesenchyme av bågarna.Observera avlägsnandet av mesenchymen av den andra faryngeal bågen på höger sida. Observera placeringen av den fjärde och tredje portionspåsar och sköldkörtel rudiment. Ta bort resterna till mesenkymala celler som är fästa vid faryngealpåsarna.Observera den tredje och fjärde portionspåsar av höger sida och den fjärde påsen från vänster sida. Upprepa mesenchyme lossnar på vänster sida. Observera nu den tredje påsen av vänster sida.Observera mesenchyme lossnar av den andra bågen på vänster sida. Observera att alla ytor och lösningar bör hållas kalla under denna procedur. Byt till en ny kall pankreaslösning och maträtt vid lång tid att dissekera vävnaderna.Slutligen gör en tvärgående snitt mellan den andra och tredje faryngeal påsar för att ta bort den andra portionspåsar och sköldkörteln rudiment. Vid denna punkt, den isolerade endoderm är sammansatt av den tredje och fjärde faryngeal påsar och den bakre spetsen av svalget. Ta bort resterna fristående mesenchyme med hjälp av två mikro-skalpell.Överför den isolerade endoderm till en glas skålen fylld med kalla fetala nötkreatur serum och hålla den på is under framställningen av in vitro-analysen. Ägg placerades i horisontellt läge och den övre sidan markerad för att använda en träkol. Till att börja, ta bort äggen från ruvmaskinen.Med en böjd sax, öppna ett litet hål i skalet, sätt in en nål och aspirera två milliliter albumin med en 10 milliliter spruta. Öppna ett cirkulärt hål i den markerade regionen av skalet och skär vitellinemembranet utvändigt till de extra embryonala kärlen medan du håller embryot med tunna tlys. Under ett stereomikroskop placerar du embryot i en petriskål med svart bas som innehåller kall PBS.Använd fyra insektsstift för att hålla embryot till botten av plattan. Placera stiften i extraembryonic regionen bildar en kvadratisk form. Utför två skärsår mellan somiterna 19 och 24 transversal till embryoaxeln och korsar embryot.Släpp detta avsnitt genom att skära de marginella embryonala kanterna. Observera den laterala plattan, neuralrör, och somiter. Aspirera och överför vävnaderna till en glasrätt fylld med kall pankreatin.Inkubera i 30 minuter på is för enzymatisk matsmältning. Under stereomikroskopet isolera mesodermen från de omgivande vävnaderna med hjälp av två mikroskalper hos hållare. Observera somatopleura mesoderm, splanchnopleura, neuralrör, och ektoderm.Ta först bort ektodermen vid ytan. Observera den somatopleura mesoderm som dissocieras från ektodermen. Därefter, försiktigt lossa ventrally ligger splanchnopleura från somatopleura.Observera den högra laterala mesoderm av somatopleura. Släpp det genom att skära den i en parallell rörelse till neuralröret. Observera att alla ytor och lösningar bör hållas kalla under denna procedur.Byt till en ny kall pankreaslösning och maträtt vid lång tid att dissekera vävnaderna. Observera den vänstra laterala mesoderm av somatopleura, somiter, neuralrör, och ektoderm. Upprepa mesoderm release av denna sida.Gör långsamma rörelser med mikro-skalpell. De exponerade extracellulära matrisproteinerna sitter genom vävnader och instrument, vilket förhindrar vätskerörelser. Skär försiktigt somatopleura i en parallell rörelse till neuralröret.Överför den isolerade mesoderm till en glasrätt fylld med kalla fetala nötkreatur serum och hålla den på is under framställningen av in vitro-analys. Placera en finmaskig metall galler i en Petri-skålen och fyll med odling medium. Ta bort de alltför stora vätskorna för att jämna medelytan med toppen av gallret.Med hjälp av tunna tynor, doppa ett membranfilter i odlingsmediet och försiktigt placera det på toppen av gallret för att ha en yta i kontakt med henne. Under stereomikroskopet överför du den isolerade endodermen från glasfatet till membranfiltret genom skonsam glidning med hjälp av spatel och tunna tutent. Upprepa denna procedur för den isolerade mesodermen.Med hjälp av en mikro-skalpell, blanda vävnaderna för att maximera det är association. Placera noggrant de tillhörande vävnaderna i en befuktad inkubator på 37 grader med 5%CO2 i 48 timmar. Efter inkubationsperioden ympa odlingsvävnaderna på coriolantypmembranet och låta den utvecklas i ovalt i ytterligare 10 dagar för att slutföra organbildningen enligt tidigare beskrivning.Här är den retikulära metoden som gör det möjligt att använda isolering av aviära embryonala vävnader i distinkta experimentella tillvägagångssätt. Som ett exempel utvärderades också uttrycket av gener som man vet är inblandade i bildandet av de faryngeala portionspåsarna en isolerad endoderm som innehåller den andra, tredje och fjärde faryngeal påsar från kyckling embryon på embryonala dag tre och en halv av hela fästet in situ hybridisering. Uttrycket av Sonic Hedgehog upptäcktes i endoderm av den centrala svalget och utesluts från pouches, medan BMP7 uttrycktes i endoderm av den andra och tredje faryngeal påsar och utesluts från den centrala svalget och fjärde faryngeal påse.Isolerade vävnader kan också vara vitro specifikt associerade in vitro i 48 timmar, transplantat på coriolan typ membran, och får utvecklas i ytterligare 10 dagar. Explants kan analyseras genom konventionella histologi och immunohistokemi. Några representativa resultat av associering av vaktel endoderm från den tredje och fjärde faryngeal påsar med kyckling somatopleura mesoderm är följande-Ympkvistar visade en fullt bildade chimeric bräss med vaktel härledd thymic epitelial celler positiva för QCPN och kyckling lymfoida celler.Dessutom visade cytokeratin positiva thymic epitel normala morfologiska funktioner, visar en typisk reticular arkitektur. Efter att ha sett den här videon, bör du ha en god förståelse hur man isolerar vaktel och kyckling embryonala vävnader som kan användas i genuttryck studier och genom att bilda chimär organ kan också hjälpa dechiffrera komplexiteten i organgenetik.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transkriptom Profilering av<em&gt; In-Vivo</em&gt; Producerad Bovina Preimplantatorisk embryon med hjälp av två-färg microarray plattform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Epigenetisk reglering av hjärt Differentiering av embryonala stamceller och vävnader

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues

Isolering och differentiering av Fett-Derived stamceller från svin subkutan fettvävnad

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

Isolering av murina embryonala Hemogenic endotelceller

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

Odling av Murina embryonala fotbenen: En fysiologisk modell av endokondral benbildning

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

Protokoll för Visualisering steroidogena organ och deras interaktiva organ med immunfärgning i fruktflugan<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Med hjälp av In Vivo och vävnad och Cell Explant metoder att studera morfogenes och patogenes av embryonala och Perinatal Aorta

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic ...

Two-step Approach to Explore Early- and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm

Tvåstegsstrategi att utforska och sen-början av Organ kan bildas i aviär modellen: den brässen och bisköldkörtlarna organogenesen Paradigm

The avian embryo, as an experimental model, has been of utmost importance for seminal discoveries in developmental biology. Among several approaches, the ...

Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

Tredimensionella Organotypic kulturer av vestibulära och auditiv sinnesorgan

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...

A Familial Hypercholesterolemia Human Liver Chimeric Mouse Model Using Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocytes

En familjär hyperkolesterolemi mänskliga levern chimär musmodell med inducerade pluripotenta stamceller-derived hepatocyter

Familial hypercholesterolemia (FH) is mostly caused by low-density lipoprotein receptor (LDLR) mutations and results in an increased risk of early-onset ...