Name: isolation of embryonic tissues and formation of quail-chicken chimeric organs using the thymus example
Uploaded: 2019-02-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Embryonic Tissues and Formation of Quail-Chicken Chimeric Organs Using The Thymus Example at JoVE.com

Yazarlar Isabel Alcobia için el yazması, eleştirel okuma için minnettarız yapmak video anlatımı için Mário Henriques ve Vitor Proa Instituto de Histologia e Biologia Histoloji hizmetinden Desenvolvimento, Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa, teknik destek için. Unidade de audiovisuais (görsel-işitsel birimi), Faculdade de Paulo Caeiro ve Hugo Silva için özellikle borçlu olduğumuzu Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa olağanüstü bağlılıklarını bu video üretimi için. Lütfen Interaves ve video sistemi ile donatılmış bir stereoscope sağlamak için Leica Microsystems anıyoruz - Sociedade Agro-Pecuária, S.A bıldırcın ile katkıda bulunmak için yumurta döllenmiş. Bu eser Faculdade de tarafından desteklenen Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).

Bu deneylerin hayvan bakımı ve Centro Académico de Medicina de etik kuralları izleyin Lisboa.
1. bıldırcın ve tavuk yumurta kuluçka döllenmiş
<ol><li>Yer yumurta Japon bıldırcın (Coturnix coturnix japonica) 38 ° C oksijen kuluçka makinesine 3 gün boyunca döllenmiş. Yukarı dönük olacak şekilde hava odasında yumurta (yumurta künt son) kuluçkaya. Not: Kuluçka makinesi alt kısmında bir su kabı yerleştirerek oksijen ortamı elde edilir.</li>
	<li>Döllenm...

<ol>
	<li>Le Douarin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nogent+Institute--50+years+of+embryology.">The Nogent Institute--50 years of embryology.</a> The International Journal of Developmental Biology. 49 (2-3), 85-103 (2005).</li><li>Le Douarin, N. M., Teillet, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+migration+of+neural+crest+cells+to+the+wall+of+the+digestive+tract+in+avian+embryo.">The migration of neural crest cells to the wall of the digestive tract in avian embryo.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 30 (1), 31-48 (1973).</li><li>Le Douarin, N. M., Jotereau, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+of+cells+of+the+avian+thymus+through+embryonic+life+in+interspecific+chimeras.">Tracing of cells of the avian thymus through embryonic life in interspecific chimeras.</a> Journal of Experimental Medicine. 142 (1), 17-40 (1975).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.+1951.">A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951.</a> Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).</li><li>Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Bmp4+signalling+in+the+epithelial-mesenchymal+interactions+that+take+place+in+early+thymus+and+parathyroid+development+in+avian+embryos.">Modulation of Bmp4 signalling in the epithelial-mesenchymal interactions that take place in early thymus and parathyroid development in avian embryos.</a> Developmental Biology. 361 (2), 208-219 (2012).</li><li>Takahashi, Y., Bontoux, M., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelio--mesenchymal+interactions+are+critical+for+Quox+7+expression+and+membrane+bone+differentiation+in+the+neural+crest+derived+mandibular+mesenchyme.">Epithelio--mesenchymal interactions are critical for Quox 7 expression and membrane bone differentiation in the neural crest derived mandibular mesenchyme.</a> Embo Journal. 10 (9), 2387-2393 (1991).</li><li>Figueiredo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+and+Hedgehog+in+the+thymus/parathyroid+common+primordium:+Crosstalk+in+organ+formation.">Notch and Hedgehog in the thymus/parathyroid common primordium: Crosstalk in organ formation.</a> Developmental Biology. 418 (2), 268-282 (2016).</li><li>Figueiredo, M., Neves, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+Approach+to+Explore+Early-and+Late-stages+of+Organ+Formation+in+the+Avian+Model:+The+Thymus+and+Parathyroid+Glands+Organogenesis+Paradigm+Video+Link.">Two-step Approach to Explore Early-and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm Video Link.</a> Journal of Visualuzed Experiments. , (2018).</li><li>Nehls, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+genetically+separable+steps+in+the+differentiation+of+thymic+epithelium.">Two genetically separable steps in the differentiation of thymic epithelium.</a> Science (New York, N.Y.). 272 (5263), 886-889 (1996).</li><li>Morahan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nu+gene+acts+cell-autonomously+and+is+required+for+differentiation+of+thymic+epithelial+progenitors.">The nu gene acts cell-autonomously and is required for differentiation of thymic epithelial progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (12), 5742-5746 (1996).</li><li>Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DiGeorge+syndrome+phenotype+in+mice+mutant+for+the+T-box+gene,+Tbx1.">DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1.</a> Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).</li><li>Nie, X., Brown, C. B., Wang, Q., Jiao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+Bmp4+from+the+Tbx1+expression+domain+causes+abnormal+pharyngeal+arch+artery+and+cardiac+outflow+tract+remodeling.">Inactivation of Bmp4 from the Tbx1 expression domain causes abnormal pharyngeal arch artery and cardiac outflow tract remodeling.</a> Cells Tissues Organs. 193 (6), 393-403 (2011).</li><li>Zou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+of+the+third+pharyngeal+pouch+into+thymus/parathyroid+by+Six+and+Eya1.">Patterning of the third pharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1.</a> Developmental Biology. 293 (2), 499-513 (2006).</li><li>Davey, M. G., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chicken+as+a+model+for+embryonic+development.">The chicken as a model for embryonic development.</a> Cytogenetic and Genome Research. 117 (1-4), 231-239 (2007).</li><li>Nowak-sliwinska, P., Segura, T., Iruela-arispe, M. L., Angeles, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chicken+chorioallantoic+membrane+model+in+biology,+medicine+and+bioengineering.">The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering.</a> Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).</li><li>Uematsu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+in+ovo+chorioallantoic+membrane+engraftment+to+culture+testes+from+neonatal+mice.">Use of in ovo chorioallantoic membrane engraftment to culture testes from neonatal mice.</a> Comparative Medicine. 64 (4), 264-269 (2014).</li><li>Martyn, I., Kanno, T. Y., Ruzo, A., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+a+human+organizer+by+combined+Wnt+and+Nodal+signaling.">Self-organization of a human organizer by combined Wnt and Nodal signaling.</a> Nature. 558 (7708), 132-135 (2018).</li></ol>

Burada verilen embriyonik doku yalıtım yordam bıldırcın-tavuk chimeric bebekleri farklı biyolojik bağlamlarda3,5,6üretmek için önceki teknik geliştirildi.
Bu yaklaşım genetik manipülasyon veya belirsiz, genetiği değiştirilmiş hayvan modelleri kullanımını sınırlama çoğu kez doku özgü işaretleri kullanımı gerektirmeden saf embriyonik doku yalıtmak uygundur. Mezenkimal epit...

1970'lerin başında, bir zarif bıldırcın-tavuk chimera sistem Le Douarin, geliştirme1,2sırasında hücre göç ve hücresel etkileşimlerin rolünü anlamak için yeni yollar açma tarafından geliştirilmiştir. Hücre değişimi iki tür arasındaki önemli ölçüde embriyogenez, daha sonra gergin oluşumu ve hematopoetik dahil olmak üzere çok sayıda gelişimsel süreçleri çalışmaya kullanıldığında doğruladı rahatsız değil öncül modeli geliştirildi sistemleri1. İkinci örnek olarak alırsak, hematopoetik ataları timik epitel rudiment kolonize döngüsel dalgaları ilk gözlenen bıldırcın-tavuk chimera sistem3kullanarak. Bunun için timus, üçüncü ve dördüncü faringeal torbalar (3/4PP), endoderm aday bölge 15-30 - somite aşamada [embriyonik gün (E) 1.5-E2.5] bıldırcın (q) embriyo mekanik ve enzimatik izole edildi. Bu aşamalar tavuk Hamburger ve Hamilton4 (HH) - aşamaları 12-17 karşılık gelir. Yalıtım yordamlar tripsin enzimatik endoderm ekli Mezenşim dan ayırmak için kullanımı ile başladı. İzole endoderm ana tavuk (c) embriyo E3-E3.5 (SS-aşamaları 20-21), somatopleura bölgeye aşılı. Bu Contegra Mezenşim timik epitel gelişimine de katkıda organ oluşumu3' e "keyfi" olarak kabul edildi. Daha sonra art arda gelen dalgalar tavuk ev sahibi kan yoluyla progenitör hücrelerin ana bilgisayar embriyo3timus oluşumunda katkıda bulunmak ve bıldırcın donör timik epitel muadili sızmış.
Son zamanlarda, bu yaklaşım değiştirilmiş bir sürümü de erken-evrelerinde timus oluşumu5mezenkimal epitel etkileşimleri eğitimi için önemli olduğu kanıtlanmış oldu. Bu bağlamda, ektopik timus chimeric embriyo3 oluşumu dahil dokular, donör ve ana bilgisayar embriyolar, her ikisi de izole ve ex vivo ilişkili. Bıldırcın 3/4PP endoderm (E2.5-E3) ve tavuk somatopleura mesoderm (E2.5-E3) izole etmek için kullanılan gelişmiş bir protokol. Kısaca, embriyonik doku mikrocerrahi ve tüp bebek Pankreatin sindirim tabi izole edildi. Ayrıca, enzimatik sindirim, sıcaklığı ve süresi, kuluçka koşulları doku ve gelişimsel sahne (Tablo 1) göre optimize.
Ardından, izole dokular bir organotypic vitro sistemde 48 h, daha önce bildirilen5,6ilişkili. Tüp bebek derneğin dokuların içinde vivo manipülasyon bazı sınırlamalar üstesinden embriyo, yerel hücresel etkileşimlerde taklit eder. Bu sistem geliştirme faringeal cihazları gibi karmaşık morphogenic olaylarda hücresel etkileşimlerin çalışmaya özellikle yararlıdır.
Timus doku her dokusunda katkısını yanı sıra yetenek bir timus oluşturmak için heterospecific derneğin keşfedilmeyi kullanarak daha fazla CAM metodolojisi, daha önce ayrıntılı5,7,8olabilir. Kısaca, kültürlü dokulara cE8 embriyo CAM aşılı ve 10 gün boyunca ovo içinde geliştirmek için izin. O zaman, timus oluşumu hasat explants morfolojik analizi ile değerlendirilmiştir. Olduğu gibi klasik bıldırcın-tavuk çalışmalar3, bıldırcın timik epitel hematopoetik progenitör hücreler (HPCs) daha sonra organ gelişimi9' a,10 katkıda bulunmak için gösterildi tavuk embriyo elde tarafından kolonize . HPCs ile son derece bozukluklarına CAM5,7,8chimeric ektopik timus embriyo göç. Bıldırcın türetilmiş timik epitel doku özel moleküler işaretleyiciler ihtiyacını üstesinden species-specific antikorlar (yani, QCPN - MAb bıldırcın Perinükleer), kullanarak immünhistokimya belirlenebilir.
Bu deneysel Yöntem, önceki yayın8' de bildirilen iki aşamalı yaklaşım olarak sinyalleme yollarının modülasyonu düzenli yönetim sırasında tüp bebek ve ovo geliştirme farmakolojik ajanlar tarafından sağlar. Ayrıca, explants herhangi bir zaman-noktada deneme8tabii hasat edilebilir.
Son olarak, burada ayrıntılı yalıtım Protokolü doğal özellikleri korunması ve 3D-mimari embriyonik dokuların, aksi takdirde yerinde gen ekspresyonu desenleri embriyonik'in ayrıntılı için özellikle yararlı tarafından erişilemeyen sağlar geleneksel yöntemleri. Buna ek olarak, transcriptome analiz yaklaşımları, RNA-seq veya microarrays, dahil olmak üzere de izole dokularda bir doku özgü yüksek üretilen iş "omics" analiz sağlarken genetik işaretler gerek kalmadan uygulanabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1279px;" width="1277">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:379px;">Chicken fertilized eggs (Gallus gallus)</td>
			<td style="width:306px;">Pintobar, Portugal</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:445px;">Poultry farm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:379px;">Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix)</td>
			<td>Interaves, Portugal</td>
			<td></td>
			<td style="width:445px;">Bird farm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">15 mL PP centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430052</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">50 mL PP centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430290</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">60 x 20 mm pyrex dishes</td>
			<td>Duran group</td>
			<td style="width:149px;">21 755 41</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">100 x 20 mm pyrex dishes</td>
			<td>Duran group</td>
			<td style="width:149px;">21 755 48</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Metal grid</td>
			<td>Goodfellows</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:445px;">fine meshed&#160; stainless steel grid</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Membrane filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td style="width:149px;">DTTP01300</td>
			<td style="width:445px;">0.6 mm Isopore membrane filter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Petri dish, 35 x 10 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:149px;">P5112&#160;</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">60 x 30 mm pyrex bowls (Small size)</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:445px;">from supermarket&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">100 x 50 mm pyrex bowls (Large size)</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:445px;">from supermarket&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Transfer pipettes</td>
			<td>Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2041S</td>
			<td style="width:445px;">2 mL plastic pipet</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Glass pasteur pipette</td>
			<td>Normax</td>
			<td style="width:149px;">5426015</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Clear plastic tape</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:445px;">from supermarket&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:379px;">Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5</td>
			<td>BMA Biomedicals</td>
			<td>T-1302</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td style="width:445px;">Standart FBS</td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:379px;">Pancreatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-3292</td>
			<td style="width:445px;">Prepare a 25 mg/mL solution according to manufacturer&#39;s instructions; centrifuge and filter prior to aliquote and store at -20&#186;C. Aliquots can be kept frozen for several years.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>GIBCO, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">QCPN antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>QCPN</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement&#160;</td>
			<td>GIBCO, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>61870010</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit</td>
			<td>ELKEM/Silmid</td>
			<td>RH141001KG</td>
			<td style="width:445px;">To prepare the back base for petri dish</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">11251-30&#160;</td>
			<td style="width:445px;">Thin forceps</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Extra fine Bonn scissors, curved</td>
			<td style="width:306px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">14085-08</td>
			<td style="width:445px;">Curved scissors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Insect pins&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">26001-30</td>
			<td style="width:445px;">0.3 mm Stainless steel pin</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Micro spatula&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">10087-12</td>
			<td style="width:445px;">Transplantation spoon</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Minutien Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">26002-20</td>
			<td style="width:445px;">0.2 mm Stainless steel microscalpel</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Minutien Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">26002-10</td>
			<td style="width:445px;">0.1 mm Stainless steel microscalpel</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Moria Nickel Plated Pin Holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">26016-12</td>
			<td style="width:445px;">Nickel plated pin holder</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Moria Perforated Spoon</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">10370-17</td>
			<td style="width:445px;">Skimmer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Wecker Eye Scissor</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:149px;">15010-11</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Camera</td>
			<td>Leica Microsystems&#160;</td>
			<td style="width:149px;">MC170 HD</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems&#160;</td>
			<td style="width:149px;">DM2500</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">NanoZoomer&#160;S360 Digital&#160;slide scanner&#160;</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:149px;">C13220-01</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Stereoscope</td>
			<td>Leica Microsystems&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Leica M80</td>
			<td style="width:445px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of embryonic tissues and formation of quail-chicken chimeric organs using the thymus example

Embriyonik Doku yalıtmak için kapasite sırayla gelişim biyolojisi örtüsünü açmak temel süreçleri tartışmasız katkılar sağlamıştır bıldırcın-tavuk chimera sistemi kurulması için önemli bir adım oldu.
Burada olduğunu bıldırcın ve Mikrocerrahi ve biyolojik özelliklerini koruyarak süre enzimatik sindirim tarafından tavuk embriyonik dokulardan yalıtmak için en iyi duruma getirilmiş bir yöntemi açıklanmıştır. Yalıtım sonra her iki tür dokulardan bir tüp bebek organotypic tahlil 48 h. bıldırcın için ilişkili ve tavuk dokuları farklı nükleer özellikleri ve moleküler işaretleyiciler hücresel çapraz konuşma arasında çalışma izin tarafından ayrımcılığa dokuların heterospecific Derneği. Bu yaklaşım, bu nedenle, karmaşık doku etkileşimleri gelişim süreçlerinde olanlar faringeal morfogenez ve foregut oluşumu sırasında meydana gelen gibi son derece dinamik uzamsal değişiklikler ile çalışmak için yararlı bir araçtır endoderm elde edilen organlar. Bu deneysel yaklaşım ilk mezenkimal epitel etkileşimleri erken-evrelerinde timus oluşumu incelemek için geliştirilmiştir. Bu, potansiyel timik rudiment endoderm kaynaklı ve Mezenşim mesoderm kaynaklı, sırasıyla bıldırcın ve tavuk embriyo izole edildi.
Organları oluşturmak için kapasite ilişkili dokuların daha fazla tavuk embriyo chorioallantoic membran (CAM) aşılama tarafından test edilecek. CAM besin sağlar ve explanted dokulara gaz alışverişi sağlar. Ovo geliştirme 10 gün sonra chimeric organ hasat explants geleneksel morfolojik yöntemlerle analiz edilebilir. Bu yordam ayrıca organogenesis (ovo gelişiminde) son dönemlerinde için ilk gelişimi (tüp bebek geliştirme) üzerinden organ oluşumu sırasında doku özgü katkıları eğitim verir.
Son olarak, geliştirilmiş yalıtım yöntemini sağlar ayrıca üç boyutlu (3D) doku özel gen ekspresyonu desenleri yüksek çözünürlüklü topografik analizi için de kullanılabilir embriyonik dokular, korunmuş.

İletişim kuralı birkaç hücresel ve gelişim biyolojisi teknik yaklaşım içinde kullanılmak üzere kuş embriyonik doku yalıtmak için bir yöntemi ayrıntıları. Bu yöntem daha önce timus oluşumu5erken evrelerinde mezenkimal epitel etkileşimleri çalışmaya istihdam edildi. Burada, yeni sonuçları Şekil 1 ve Şekil 2benzer yaklaşımları kullanarak, gösterilir.
<p class="jove_content...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Embryonic Tissues and Formation of Quail-Chicken Chimeric Organs Using The Thymus Example at JoVE.com

Isolation of Embryonic Tissues and Formation of Quail-Chicken Chimeric Organs Using The Thymus Example

Bu makalede embriyonik dokulardan saf formu ex vivo chimeric organları için bir araya getirilebilen bıldırcın ve tavuk embriyolar izole etmek için bir yöntem sağlar.

Yalıtım embriyonik doku ve timus örnek kullanarak bıldırcın-tavuk Chimeric organ oluşumu

The capacity to isolate embryonic tissues was an essential step for establishing the quail-chicken chimera system, which in turn has provided undisputed ...

Bu işlemin genel amacı bıldırcın ve tavuk embriyolarından embriyonik dokuları izole etmek için optimize edilmiş deneysel bir yaklaşım sunmaktır. Bu teknikle gen ekspresyonu çalışmalarında ve fonksiyonel tahlillerde kullanılabilecek saf embriyonik dokular elde ediyoruz. Bıldırcın ve tavuk embriyolarından elde edilen dokular mikrocerrahi ile izole edilir ve biyolojik özelliklerini korurken in vitro enzimatik sindirime tabi tutulur.İzolasyondan sonra, üç boyutlu korunmuş dokular yüksek çözünürlüklü topografik gen ekspresyon kalıpları analizi için kullanılabilir. Bu yaklaşım, geleneksel yöntemlerle erişilemeyen embriyonik bölgelerde situ gen ekspresyonunu detaylandırmak için özellikle yararlıdır. Buna ek olarak, transkripsiyon analizi yaklaşımları genetik belirteçler gerektirmeden izole dokularda da uygulanabilir, dokuya özgü yüksek iş artışı omik analizi sağlarken.Alternatif olarak, her iki türün izole dokular bir in vitro organotipik tsay ilişkili olabilir 48 saat. Bıldırcın ve tavuk hücreleri farklı nükleer özellikler ve moleküler belirteçler tarafından ayrımcılığa uğrayabildiği için bu yaklaşım doku etkileşimlerinin incelenmesine olanak sağlar. Kültür dokularının organ oluşturma kapasitesi ovo testiile daha da test edilebilir.Bu nedenle bu yöntem, son derece dinamik aralıklı modifikasyonlar ile gelişimsüreçlerinde karmaşık doku etkileşimlerini incelemek için yararlı bir araçtır ve aynı zamanda organların oluşumuna belirli embriyonik bölgelerin potansiyelini ortaya çıkarmak için yardımcı olabilir. Örnek olarak, burada izole embriyonik dokulardan bıldırcın-tavuk şimerik timus oluşumu açıklanmıştır. Birincisi, üçüncü ve dördüncü faringeal keselerin endodermi, prospektif timik ilkellik gelişme üç gün ile bıldırcın embriyolarının faringeal bölgeden izole edilir.Sonra, Bu doku gelişimini destekleyen yeteneğine sahip bir mezenchyme ile ilişkilidir, somatopleura mezoderm. Son olarak, dokuların heterospesifik ilişkisi bir şeymerik timus oluşturmak için in vitro ve ovo kültürlü. Yatay laminar akış başlığı ve steril ize edilmiş alet ve malzemeleri kullanarak steril koşullarda tüm yumurta manipülasyon işlemlerini gerçekleştirin.Döllenmiş bıldırcın yumurtaları hava odası yukarı bakacak şekilde kuluçkaya yatırıldı. Başlamak için, bıldırcın yumurtalarını kuvözden çıkarın. Soğuk PBS ile dolu büyük bir borosilikat cam kase hazırlayın.Kavisli makas ile, dokunun ve kuluçka üç gün ile bir bıldırcın yumurtası kabuğunda dairesel bir delik kesti. Yumurtanın karşı tarafındaki deliği künt yapın ve sarısını soğuk PBS ile kaseye aktarın. Ekstraembriyonik damarlara dışarıdan vitellin membran keserek sarısı embriyo çıkarın.İnce püskler yardımıyla, soğuk PBS ile dolu küçük bir kase embriyo transfer, sonra bir kaymaz ile siyah taban ile bir Petri kabına embriyo taşıyın. Önceki Jove SPA ligasyonunda açıklandığı gibi üçüncü ve dördüncü faringeal keseleri içeren faringeal bölgeyi çıkarın. Daha sonra, enzimatik sindirim için, buz üzerinde, bir saat boyunca soğuk pankreatin ve kuluçka ile dolu bir bardağa üçüncü ve dördüncü faringeal kemer bölge aktarın.Enzimatik sindirimin kuluçka süresinin gelişim aşamasına bağlı olduğunu unutmayın. Stereo mikroskop altında cam çanak yerleştirin ve bir tutucu iki mikro-neşter kullanarak, üçüncü ve dördüncü faringeal kemer bölgeden endoderm izole. İlk dış yüzeyde endoderm ve ektoderm gösteren, dorsal tarafı ile faringeal bölge yerleştirin.Nöral tüpün ektoderm, endoderm, mezenkim, kalp tüpü ve ventral kısmını gözlemleyin. Faringeal endoderm in dorsal yüzeyine bağlı nöral tüp ve mezoderm çıkarın. Farinks endoderm gözlemlemek, dördüncü ve üçüncü faringeal torbalar, ve kalp tüpü.Dorsal tarafı yukarı ile, dikkatle ayırmak ve faringeal kemerler arasında mezenchyme kaldırmak ve faringeal torbalar ortaya çıkarmak. Bu yordamı faringeal bölgenin diğer tarafında gerçekleştirin. Endodermin en posterior kısmına iliştirilen mezenchyme çıkarın ve dördüncü faringeal kese gözlemlemek.Arka tarafı yukarı, hem sol hem de sağ dördüncü faringeal torbalar gözlemleyin. Endodermin en arka kısmına ve ikinci kese bağlı mezenchyme kaldırarak devam edin. Kalp tüpünü ve iç keseleri çevreleyen mezenchyme çıkarın.Ventral tarafı yukarı ile, farinks endoderm gözlemlemek, ve ikinci faringeal kemer sağ tarafında. Bu aşamada tiroid rudiment endoderm görünür olmalıdır. İkinci ve üçüncü faringeal kemerlerin ektoderm'ini ayırın ve kemerlerin mezenchyme'sini dikkatlice çıkarın.Sağ tarafta ikinci faringeal kemer mezenchyme kaldırılması gözlemleyin. Dördüncü ve üçüncü poşetlerin ve tiroid ilkelerinin bulunduğu yere dikkat edin. Faringeal torbalara bağlı mezenkimal hücrelere kalıntıları çıkarın.Sağ tarafın üçüncü ve dördüncü keselerini ve sol taraftan dördüncü keseyi gözlemleyin. Sol tarafın mezenchyme müfrezesini tekrarlayın. Şimdi sol tarafın üçüncü kesesini gözlemleyin.Sol tarafta ikinci kemer mezenchyme müfreze gözlemleyin. Bu işlem sırasında tüm yüzeylerin ve çözeltilerin soğuk tutulması gerektiğini unutmayın. Dokuların kesilmesi uzun zaman alan durumda yeni bir soğuk pankreatin çözeltisi ve çanak değiştirin.Son olarak, ikinci ve üçüncü faringeal torbalar arasında bir transversal kesim ikinci torbalar ve tiroid rudiment kaldırmak için olun. Bu noktada, izole endoderm üçüncü ve dördüncü faringeal torbalar ve farinks arka ucu oluşur. Kalıntıları iki mikro-neşter yardımıyla müstakil mezenchyme çıkarın.İzole endodermi soğuk fetal sığır serumu ile dolu bir cam çanağa aktarın ve in vitro tahsin in hazırlanması sırasında buz üzerinde tutun. Yumurtalar yatay pozisyonda, üst tarafı ise kömür kullanmak için işaretlenmiştir. Başlamak için, kuvözden yumurtaları çıkarın.Kavisli bir makasile, kabukta küçük bir delik açın, bir iğne yerleştirin ve 10 mililitrelik şırınga ile iki mililitre albümin aspire edin. Kabuğun işaretli bölgesinde dairesel bir delik açın ve ince forceps ile embriyo tutarken ekstra embriyonik damarlara dışvian membran kesti. Bir stereo mikroskop altında, soğuk PBS içeren siyah baz ile bir Petri kabına embriyo yerleştirin.Embriyoyu tabağın dibine tutmak için dört böcek iğnesi kullanın. Pimleri kare şeklinde ki ekstraembriyonik bölgeye yerleştirin. 19 ve 24 kromozomlar arasında embriyo eksenine transversvesi arasında iki kesik yapın ve embriyoyu geçerek.Marjinal embriyonik kenarları keserek bu bölümü bırakın. Lateral plaka, nöral tüp ve somites gözlemleyin. Aspire ve soğuk pankreatin dolu bir cam çanak dokuları aktarın.Enzimatik sindirim için buz üzerinde 30 dakika kuluçka. Stereo mikroskop altında, tutucularda iki mikro-neşter kullanarak çevredeki dokulardan mezoderm izole. Somatopleura mezoderm, splanchnopleura, nöral tüp ve ektoderm gözlemleyin.İlk olarak, yüzeydeki ektodermi çıkarın. Ektodermden ayrıştırılan somatopleura mezoderm'i gözlemleyin. Daha sonra, dikkatle somatopleura gelen ventrally bulunan splanchnopleura ayırmak.Somatopleura sağ lateral mezoderm gözlemleyin. Nöral tüpe paralel bir hareketle keserek serbest bırakın. Bu işlem sırasında tüm yüzeylerin ve çözeltilerin soğuk tutulması gerektiğini unutmayın.Dokuların kesilmesi uzun zaman alan durumda yeni bir soğuk pankreatin çözeltisi ve çanak değiştirin. Somatopleura sol lateral mezoderm gözlemlemek, somites, nöral tüp, ve ektoderm. Bu tarafın mezoderm salınımını tekrarlayın.Mikro-neşter ile yavaş hareketler yapın. Maruz kalan ekstrasellüler matriks proteinleri doku ve aletler arasında oturup sıvı hareketlerini önlerler. Dikkatle nöral tüp paralel bir hareketle somatopleura kesti.İzole mezodermi soğuk fetal büyükbaş serumu ile dolu bir cam çanağa aktarın ve in vitro tahsin in hazırlanması sırasında buz üzerinde tutun. Bir Petri kabına ince bir meshed metal rendeyerleştirin ve kültür ortamı ile doldurun. Orta yüzeyi ızgaranın üst kısmıyla eşitlemek için aşırı sıvıları çıkarın.İnce pratisyen ler yardımıyla, bir membran filtresini kültür ortamına batırın ve onunla temas eden bir yüzeye sahip olmak için dikkatlice ızgaranın üstüne yerleştirin. Stereo mikroskop altında, spatula ve ince çerofma yardımı ile hafif çeşni ile membran filtreye izole endoderm aktarın. İzole mezoderm için bu yordamı tekrarlayın.Bir mikro-neşter yardımıyla, bu dernek maksimize etmek için dokuları karıştırın. İlişkili dokuları 37 derecede nemlendirilmiş bir kuvözde 48 saat boyunca %5 CO2 ile dikkatlice yerleştirin. Kuluçka döneminden sonra kültür dokularını koriolan tipi membranüzerine aşılayın ve daha önce açıklandığı gibi organ oluşumunu tamamlamak için 10 gün daha oval olarak gelişmesini bekleyin.Burada kuş embriyonik dokuların izolasyon uyrkunluğu farklı deneysel yaklaşımlarda kullanılmak üzere izin retiküler yöntemdir. Örnek olarak, faringeal keselerin oluşumunda rol aldığı bilinen genlerin ekspresyonu da embriyonik üçüncü günde tavuk embriyolarından ikinci, üçüncü ve dördüncü faringeal keseleri içeren izole edilmiş bir endoderm değerlendirildi. Sonic Kirpi ifadesi merkezi yutak endoderm tespit edildi ve torbalar dışında, BMP7 ikinci ve üçüncü faringeal torbalar endoderm ifade edildi ve merkezi yutak ve dördüncü yutak kese dışında.İzole dokular da 48 saat boyunca özellikle in vitro ilişkili olabilir, koriolan tipi membran üzerine greft, ve daha fazla geliştirmek için izin 10 gün. Eksplorasyonlar konvansiyonel histoloji ve immünohistokimya ile analiz edilebilir. Tavuk somatopleura mezoderm ile üçüncü ve dördüncü faringeal torbalar bıldırcın endoderm ilişkisinin bazı temsili sonuçları aşağıdaki-Greftler qcpn ve tavuk lenfoid hücreleri için pozitif timik epitel hücreleri elde edilen bıldırcın türetilmiş tam biçimli bir şemerik timus gösterdi.Ayrıca, sitokatin pozitif timik epitel normal morfolojik özellikler gösterdi, tipik bir retiküler mimari gösteren. Bu videoyu izledikten sonra, nasıl bıldırcın ve tavuk embriyonik dokular gen ekspresyonu çalışmalarında kullanılabilir izole etmek için iyi bir anlayışa sahip olmalı ve şemerik organlar oluşturarak da organ genetiğinin karmaşıklığını çözmeye yardımcı olabilir.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profil<em&gt; In-vivo</emİki renkli Mikroarray Platformu Kullanma&gt; Üretilen Sığır pre-implantasyon Embriyolar

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Embriyonik Kök Hücre ve Doku Kardiyak Farklılaşma epigenetik Yönetmelik

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues

Domuz Subkutan yağ dokularındaki İzolasyonu ve Yağ-Türetilmiş Kök Hücre Farklılaşması

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

Fare Embriyonik Hemogenic endotel hücrelerinin izolasyonu

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

Fare Embriyonik metatarsallara Kültürü: endokondral Kemikleşmenin bir Fizyolojik Modeli

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

Sineği boyanmasına ile steroidogenik organları ve İnteraktif Organlar görselleştirme için Protokoller<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Morfogenez ve embriyonik ve Perinatal aort patogenezi okumaya vivo içinde ve doku ve hücre Explant yaklaşımları kullanma

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic ...

Two-step Approach to Explore Early- and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm

İlk - ve geç-aşamalarında Organ oluşumu kuş modelindeki keşfetmek için iki adımlı yaklaşım: timus ve paratiroid bezleri Organogenesis paradigma

The avian embryo, as an experimental model, has been of utmost importance for seminal discoveries in developmental biology. Among several approaches, the ...

Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

Vestibüler ve işitme duyu organları kültürleri üç boyutlu Organotypic

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...

A Familial Hypercholesterolemia Human Liver Chimeric Mouse Model Using Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocytes

İndüklenmiş Pluripotent kök hücre kaynaklı tetkikine kullanarak ailesel hiperkolesterolemi insan karaciğer Chimeric fare modeli

Familial hypercholesterolemia (FH) is mostly caused by low-density lipoprotein receptor (LDLR) mutations and results in an increased risk of early-onset ...