Name: an iodide-yellow fluorescent protein-gap junction-intercellular communication assay
Uploaded: 2019-02-01T14:00:00
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Cette recherche a été financée par le programme de recherche sciences fondamentales grâce à la fondation de la recherche nationale de Corée (NRF) financé par le ministère de l’éducation (2011-0023701, 2016R1D1A1A02937397 et 2018R1A6A1A03023718).

1. génération de lentivirus exprimant YFPQL et SLC26A4
<ol><li>La croissance de cellules humaines embryonnaires de rein HEK293T à 80 % confluency sur les plaques de culture de 100 mm. Modifié Eagle (DMEM de Dulbecco) additionné de sérum de veau fœtal 10 %, 100 U/mL de pénicilline et 100 µg/mL de streptomycine est le milieu de culture utilisé dans tout le protocole pour maintenir HEK293T et autres cellules mentionnées ci-dessous.</li>
	<li>Plaques 6 puits culture manteau en ajoutant 2 mL de 0,005 %...

<ol>
	<li>Goodenough, D. a., Goliger, J. a., Paul, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexins,+connexons,+and+Intercellular+Communication.">Connexins, connexons, and Intercellular Communication.</a> Annual Review of Biochemistry. 65, 475-502 (1996).</li><li>Upham, B. L., Weis, L. M., Trosko, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulated+Gap+Junctional+Intercellular+Communication+as+a+Biomarker+of+PAH+Epigenetic+Toxicity:+Structure-Function+Relationship.">Modulated Gap Junctional Intercellular Communication as a Biomarker of PAH Epigenetic Toxicity: Structure-Function Relationship.</a> Environmental Health Perspectives. 106, 975 (1998).</li><li>U, J. E. T., Chang, C., Upham, B., Wilson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+toxicology+as+toxicant-induced+changes+in+intracellular+signalling+leading+to+altered+gap+junctional+intercellular+communication.">Epigenetic toxicology as toxicant-induced changes in intracellular signalling leading to altered gap junctional intercellular communication.</a> Toxicology Letters. , 71-78 (1998).</li><li>Yamasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+disrupted+gap+junctional+intercellular+communications+in+detection+and+characterization+of+carcinogens.">Role of disrupted gap junctional intercellular communications in detection and characterization of carcinogens.</a> Mutation Research - Reviews in Genetic Toxicology. , (1996).</li><li>Yamasaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctional+intercellular+communication+and+cell+proliferation+during+rat+liver+carcinogenesis.">Gap junctional intercellular communication and cell proliferation during rat liver carcinogenesis.</a> Environmental Health Perspectives. 101, 191-197 (1993).</li><li>Vinken, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctional+intercellular+communication+as+a+target+for+liver+toxicity+and+carcinogenicity.">Gap junctional intercellular communication as a target for liver toxicity and carcinogenicity.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 44, 201-222 (2009).</li><li>Fonseca, C. G., Green, C. R., Nicholson, L. F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+in+astrocytic+connexin+43+gap+junction+levels+may+exacerbate+generalized+seizures+in+mesial+temporal+lobe+epilepsy.">Upregulation in astrocytic connexin 43 gap junction levels may exacerbate generalized seizures in mesial temporal lobe epilepsy.</a> Brain Research. 929 (1), 105-116 (2002).</li><li>Garbelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+connexin+43+in+the+human+epileptic+and+drug-resistant+cerebral+cortex.">Expression of connexin 43 in the human epileptic and drug-resistant cerebral cortex.</a> Neurology. 76 (10), 895-902 (2011).</li><li>Schulz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+43+is+an+emerging+therapeutic+target+in+ischemia/reperfusion+injury,+cardioprotection+and+neuroprotection.">Connexin 43 is an emerging therapeutic target in ischemia/reperfusion injury, cardioprotection and neuroprotection.</a> Pharmacology and Therapeutics. 153, 90-106 (2015).</li><li>Sarrouilhe, D., Dejean, C., Mesnil, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+gap+junction+channels+in+the+pathophysiology+of+migraine+with+aura.">Involvement of gap junction channels in the pathophysiology of migraine with aura.</a> Frontiers in Physiology. , (2014).</li><li>Patel, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junction+inhibition+prevents+drug-induced+liver+toxicity+and+fulminant+hepatic+failure.">Gap junction inhibition prevents drug-induced liver toxicity and fulminant hepatic failure.</a> Nature Biotechnology. 30 (2), 179-183 (2012).</li><li>Kandyba, E. E., Hodgins, M. B., Martin, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+living+skin+equivalent+amenable+to+live-cell+imaging:+analysis+of+the+roles+of+connexins+in+the+epidermis.">A murine living skin equivalent amenable to live-cell imaging: analysis of the roles of connexins in the epidermis.</a> Journal of Investigative Dermatology. 128 (4), 1039-1049 (2008).</li><li>Upham, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+roles+of+2+,+6+,+and+8+carbon+ceramides+on+the+modulation+of+gap+junctional+communication+and+apoptosis+during+carcinogenesis.">Differential roles of 2 , 6 , and 8 carbon ceramides on the modulation of gap junctional communication and apoptosis during carcinogenesis.</a> Cancer Letters. 191, 27-34 (2003).</li><li>Upham, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-activity-dependent+regulation+of+cell+communication+by+perfluorinated+fatty+acids+using+in+vivo+and+in+vitro+model+systems.">Structure-activity-dependent regulation of cell communication by perfluorinated fatty acids using in vivo and in vitro model systems.</a> Environmental Health Perspectives. 117 (4), 545-551 (2009).</li><li>Weis, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bay+or+Baylike+Regions+of+Polycyclic+Aromatic+Hydrocarbons+Were+Potent+Inhibitors+of+Gap+Intercellular+Communication.">Bay or Baylike Regions of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons Were Potent Inhibitors of Gap Intercellular Communication.</a> Environmental Health Perspectives. 106 (1), 17-22 (1998).</li><li>el-Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scrape-Loading+and+Dye+Transfer:+A+Rapid+and+Simple+Technique+to+Study+Gap+Junctional+Intercellular+Communication.">Scrape-Loading and Dye Transfer: A Rapid and Simple Technique to Study Gap Junctional Intercellular Communication.</a> Experimental Cell Research. 168 (2), 422-430 (1987).</li><li>Wade, M. H., Trosko, J. E., Schindler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching+Assay+of+Gap+Junction-+Mediated+Communication+Between+Human+Cells.">Photobleaching Assay of Gap Junction- Mediated Communication Between Human Cells.</a> Advancement of Science. 232 (4749), 525-528 (2010).</li><li>Abbaci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+characterization+of+gap+junctional+intercellular+communication+by+gap-FRAP+technique.">In vitro characterization of gap junctional intercellular communication by gap-FRAP technique.</a> Proceedings of SPIE. , 585909 (2005).</li><li>Neyton, J., Trautmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-channel+currents+of+an+intercellular+junction.">Single-channel currents of an intercellular junction.</a> Nature. 317 (6035), 331-335 (1985).</li><li>Wilders, R., Jongsma, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+the+dual+voltage+clamp+method+in+assaying+conductance+and+kinetics+of+gap+junction+channels.">Limitations of the dual voltage clamp method in assaying conductance and kinetics of gap junction channels.</a> Biophysical Journal. 63 (4), 942-953 (1992).</li><li>Lee, J. Y., Choi, E. J., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+high-throughput+screening-compatible+gap+junctional+intercellular+communication+assay.">A new high-throughput screening-compatible gap junctional intercellular communication assay.</a> BMC Biotechnology. 15 (1), 1-9 (2015).</li><li>Galietta, L. J. V., Haggie, P. M., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein-based+halide+indicators+with+improved+chloride+and+iodide+affinities.">Green fluorescent protein-based halide indicators with improved chloride and iodide affinities.</a> FEBS Letters. 499 (3), 220-224 (2001).</li><li>Lee, J. Y., Yoon, S. M., Choi, E. J., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terbinafine+inhibits+gap+junctional+intercellular+communication.">Terbinafine inhibits gap junctional intercellular communication.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 307, 102-107 (2016).</li><li>Hughes, J., Rees, S., Kalindjian, S., Philpott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+early+drug+discovery.">Principles of early drug discovery.</a> British Journal of Pharmacology. 162 (6), 1239-1249 (2011).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays.">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Upham, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Integrative+Signaling+Through+Gap+Junctions+in+Toxicology.">Role of Integrative Signaling Through Gap Junctions in Toxicology.</a> Current Protocols in Toxicology. , (2011).</li><li>Schalper, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+gap+junction+channels+and+hemichannels+by+growth+factors.">Modulation of gap junction channels and hemichannels by growth factors.</a> Molecular BioSystems. 8 (3), 685-698 (2012).</li><li>Kulkarni, G. V., Mcculloch, C. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+deprivation+induces+apoptotic+cell+death+in+a+subset+of+Balb+/+c+3T3+fibroblasts.">Serum deprivation induces apoptotic cell death in a subset of Balb / c 3T3 fibroblasts.</a> Journal of Cell Science. 1179, 1169-1179 (1994).</li><li>Harris, A. L., Locke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+of+Connexin+Channels.">Permeability of Connexin Channels.</a> Connexins. , 165-206 (2009).</li><li>Choi, E. J., Yeo, J. H., Yoon, S. M., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gambogic+Acid+and+Its+Analogs+Inhibit+Gap.">Gambogic Acid and Its Analogs Inhibit Gap.</a> Junctional Intercellular Communication. 9, 1-10 (2018).</li></ol>

Le test j’ai-YFP-CIJL peut être utilisé pour HTS parce qu’il est robuste, rapide et peu coûteux. Un dosage HTS est considéré comme robuste si la Z'-facteur est supérieure à 0,525. Voir Zhang et coll. pour obtenir une description de l’analyse statistique utilisée pour évaluer l’adéquation des HTS essais25. Lorsque des cellules LN215 ont été utilisées, le Z'-facteur était > 0,5 sans aucune optimisation de dosage. Si les autres types de cellules sont util...

Jonctions lacunaires (JL) agissent comme des canaux intercellulaires pour permettre la diffusion de petites molécules de < 1 kDa comme nutriments, métabolites et molécules de signalisation entre des cellules adjacentes. Les éléments jonctionnelles comprennent un hémicanaux ou connexon dans chaque cellule et chaque connexon constitue six connexines (CX)1. JL et CX ont été utilisés dans les essais de toxicologie des carcinogènes comme les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP), qui sont des inhibiteurs GJ2,3,4. CIJL perturbée a été associée par génotoxiques carcinogenèse5,6. Comme une cible thérapeutique potentielle, implication GJ a signalé en particuliers sous-types de saisies7,8, protection du cardiaques et cérébrales ischémie/reperfusion injury9, migraine avec aura10, lésion hépatique induite par le médicament6,11et12de cicatrisation. Tests de dépistage (HTS) haut débit sont nécessaires pour identifier les produits chimiques modulant GJ ou des anticorps pour la découverte de médicaments, pour les tests de toxicologie et d’identifier de nouveaux régulateurs cellulaires d’activité GJ. Tests de HTS permet également d’étudier les relations structure-activité de GJ modulateurs2,13,14,15.
Certains tests CIJL comprennent le transfert de teinture ou de techniques de double patch clamp. Lucifer jaune CH (LY) et calcéine acétoxyméthyl ester (calcéine-AM) ont été utilisés dans des essais de transfert de la teinture. Les cellules ne sont pas perméables à LY, qui est introduit par micro-injection, gratter chargement ou électroporation. Une fois à l’intérieur de la cellule, LY se répand dans les voisins des cellules via GJs et GJ l’activité est mesurée par l’ampleur de la migration de LY16. Tests de Calcéine-AM impliquent généralement récupération de gap-fluorescence après Photoblanchiment17,18. Calcéine-AM est un colorant cellulaire perméable est transformé intracellulairement calcéine imperméable par une estérase intrinsèque. Le test nécessite un microscope confocal pour observer le transfert de calcéine-AM dans une cellule de ceux qui l’entourent après Photoblanchiment laser. Si JL fonctionnels est présents, calcéine-AM dans des cellules adjacentes pénètre dans les cellules de la photobleached et la fluorescence est récupérée. GJ l’activité est mesurée par le degré de récupération de la fluorescence des cellules photobleached. Le transfert de teinture dosages sont laborieux et fastidieux ou ont une sensibilité faible. Patch double serrage est une méthode électrophysiologique qui mesure la conductance jonctionnelle. Il est relativement sensible, avec une dépendance directe de la conductance sur le nombre d’open JL19; Toutefois, il est techniquement difficile, chronophage et coûteux20. Le je-YFP-CIJL a été développé pour une utilisation en HTS
La figure 1 illustre les composants et les étapes du test j’ai-YFP CIJL, qui utilise des cellules accepteur exprimant une variante YFP iodure sensibles portant H148Q et I152L (YFPQL) et donneur de cellules exprimant un transporteur iodure (SLC26A4)21 . Les deux mutations portées par YFPQL permettent l’extinction de fluorescence par iodure22. Iodures sont ajoutés à l’accepteur co cultivée et les cellules du donneur ; ils n’entrent pas dans les cellules de l’accepteur, mais sont absorbés par les transporteurs SLC26A4 présents sur les cellules du donneur. Iodures dans les cellules du donneur diffusent à travers de JL fonctionnel dans les cellules adjacentes accepteur où ils étancher la fluorescence YFPQL . Si JL est fermés ou bloqués par les inhibiteurs, iodure ne peut pas entrer les cellules accepteur pour étancher la fluorescence. Le taux d’extinction YFPQL reflète l’activité GJ. Le mode OPERATOIRE j’ai-YFP CIJL n’est ni compliqué ni votre temps. Il est compatible avec HTS et peut être utilisé pour tester les effets d’un grand nombre de composés sur l’activité GJ dans une période relativement courte. Il faut seulement accepteur et cellules du donneur et deux solutions salines équilibrées. Le protocole décrit ci-dessous est basé sur LN215 cellules dont Cx majeur est Cx4321. Le récepteur LN215-YFPQL et LN215-j’ai− cellules du donneur ont été générés par transduction avec lentivirus exprimant YFPQL ou SLC26A421,23.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:629px;" width="630">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">96-well plate</td>
			<td style="width:72px;">SPL</td>
			<td style="width:123px;">30096</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td style="width:72px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">C5670</td>
			<td>I-solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:72px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">G7021</td>
			<td>C-solution, I-solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:72px;">sigma</td>
			<td style="width:123px;">276855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">HEPES</td>
			<td style="width:72px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">RES6003H-B7</td>
			<td>C-solution, I-solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:72px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">11668-027</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:268px;">Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2 6H2O)</td>
			<td style="width:72px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">M2393</td>
			<td>C-solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:268px;">Microplate reader&#160;</td>
			<td style="width:72px;">BMG LabTech&#160;</td>
			<td style="width:123px;">POLARstar Omega 415-1618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMD2.G&#160;</td>
			<td style="width:72px;">Addgene</td>
			<td>#12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Polybrene</td>
			<td style="width:72px;">sigma</td>
			<td style="width:123px;">H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Poly-L-lysine solution</td>
			<td style="width:72px;">sigma</td>
			<td style="width:123px;">P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Potassium chloride (KCl)</td>
			<td style="width:72px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P5405</td>
			<td>C-solution, I-solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">psPAX2&#160;</td>
			<td style="width:72px;">Addgene</td>
			<td style="width:123px;">&#160;#12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td style="width:72px;">sigma</td>
			<td style="width:123px;">P8833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:72px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">S5886</td>
			<td>C-solution, I-solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Sodium hyroxide (NaOH)</td>
			<td style="width:72px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">S2770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Sodium Iodide (NaI)</td>
			<td style="width:72px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">383112</td>
			<td>I-solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an iodide-yellow fluorescent protein-gap junction-intercellular communication assay

Jonctions lacunaires (JL) sont des canaux de la membrane cellulaire qui permettent la diffusion des molécules plus petite que 1 kDa entre des cellules adjacentes. Car ils ont des rôles physiologiques et pathologiques, on besoin de haut débit (HTS) de dépistage tests pour identifier les modulateurs GJ lors d’essais de toxicologie et découverte de drogue. Un dosage de jonction intercellulaire communication (I-YFP-CIJL) roman iodure-jaune fluorescent protein-gap répond à ce besoin. C’est un essai sur les cellules dont les cellules accepteur et donateurs qui ont été conçues pour exprimer stablement une variante de la protéine fluorescente jaune (YFP), dont la fluorescence est sensiblement piégée par iodure ou SLC26A4, un transporteur d’iodure, respectivement. Lorsque l’iodure est ajouté à une culture mixte des deux types cellulaires, ils entrer dans les cellules du donneur via le transporteur SLC26A4 et diffusent vers les cellules adjacentes accepteur via GJs où ils étancher la fluorescence de la YFP. YFP fluorescence est mesurée bien par bien en mode cinétique. Le taux d’extinction YFP reflète l’activité GJ. Le test est fiable et assez rapide à utiliser pour HTS Le protocole de l’essai j’ai-YFP-CIJL à l’aide des LN215 des cellules, cellules de gliome humain, est décrite.

Vingt-neuf plaques de 96 puits de culture ont été utilisées pour écran 2 320 produits chimiques afin d’identifier de nouveaux modulateurs CIJL essai CIJL YFP-j’ai de la LN215-YFPQL et LN215-j’ai− cellules. Les résultats obtenus avec une plaque représentante sont présentés dans la Figure 2. Le pourcentage de la fluorescence de la YFP dans chaque puits s’affiche comme un ligne graphique en Figure 2</s...

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An Iodide-Yellow Fluorescent Protein-Gap Junction-Intercellular Communication Assay

Un essai de Communication intercellulaire-jonction iodure-jaune Fluorescent Protein-Gap

Nous présentons ici un protocole pour un dosage de communication intercellulaire de jonction gap roman conçu pour le criblage à haut débit de gap junction-modulation produits chimiques pour la découverte et l’évaluation toxicologique.

Gap junctions (GJs) are cell membrane channels that allow diffusion of molecules smaller than 1 kDa between adjacent cells. As they have physiological and ...

Des jonctions d’écart ont été suggérées comme cibles de drogue. L’analyse Iodide-YFP-GJIC est compatible avec le criblage à haut débit pour découvrir les modulateurs de jonction d’écart. Il a été utilisé pour tester les effets d’un grand nombre de composés sur les activités de jonction des écarts dans une période relativement courte.L’analyse Iodide-YFP-GJIC est simple, robuste, reproductible et peu coûteuse. Cet essai ne nécessite que des cellules acceptatrices et donneuses et deux solutions de sel équilibrées. Aucun reagent supplémentaire comme Lucifer jaune et Calcein AM n’est nécessaire.En outre, il mesure les activités totales de jonction de l’écart des cellules dans un seul puits, ce qui entraîne une faible variabilité entre les puits. Pour commencer cette procédure, faire croître les cellules LN215 à 80% de confluence dans le DMEM complété tel que décrit dans le protocole de texte. Un jour avant la transduction laver les cellules deux fois avec 10 millilitres de PBS.Ajouter deux millilitres de 0,25% trypsine EDTA aux cellules et incuber à 37 degrés Celsius pendant trois minutes. À l’aide d’une pipette sérologique de 10 millilitres, resuspendez les cellules en cinq millilitres de milieu de culture et ajustez la densité cellulaire à 50 000 cellules par millilitre. Ajouter 400 microlitres de médias qui contiennent 20 000 cellules à chaque puits d’une plaque de culture de 24 puits.Incuber à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Le lendemain, transduire deux puits en remplaçant le milieu de culture par 400 microlitres d’un mélange un-à-un d’un lentivirus et d’un milieu de culture frais complété par du polybrene à une concentration finale de quatre microgrammes par millilitre. Pour les contrôles sans virus remplacer le milieu de culture par milieu de culture frais complété par du polybrene à une concentration finale de quatre microgrammes par millilitre.Incuber à 37 degrés Celsius pendant 15 heures. Ensuite, aspirez le milieu contenant des lentivirus, et milieu de culture frais. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant 72 heures supplémentaires.Après cela, laver les cellules dans chaque puits deux fois avec 0,5 millilitres de PBS. Ajouter 300 microlitres de 0,25% trypsine EDTA aux cellules, et incuber à 37 degrés Celsius pendant trois minutes. Resuspendez les cellules en deux millilitres de milieu de culture, puis plaquez-les dans des plaques de culture de six puits avec deux microgrammes par millilitre de puromycine.Culture des cellules jusqu’à ce que toutes les cellules dans les puits de contrôle sont morts, ce qui prend généralement environ une semaine. Tout d’abord, la culture séparée LN215-YFP et LN215-iodure cellules dans des plaques de 100 millimètres dans le milieu de la culture pour atteindre les populations requises pour l’analyse. Un jour avant le test, laver chaque assiette avec 10 millilitres de PBS.Traitez chaque assiette avec deux millilitres de 0,25% trypsine EDTA solution, et incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Resuspendez les cellules en quatre millilitres de milieu de culture et transférez-les dans un tube conique de 15 millilitres. Centrifugeuse à 1000 g pendant trois minutes pour pelleter les cellules.Jetez le supernatant et resuspendez chaque granule cellulaire en cinq millilitres de milieu de culture. Pipette de haut en bas environ 20 fois pour briser les touffes de cellules. Utilisez un hémocytomètre pour compter les cellules.Et puis diluer les cellules dans le milieu de la culture pour faire la suspension cellulaire aux densités indiquées ici. Ensuite, mélangez sept millilitres de chaque suspension cellulaire ensemble dans un réservoir. Utilisez une pipette multicanal pour ajouter 100 microlitres de ce mélange à chaque puits d’une plaque de culture de 96 puits.Incuber à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 24 heures. Tout d’abord, utilisez un microscope à fluorescence avec grossissement 20X et un filtre GFP pour vérifier les plaques de 96 puits pour s’assurer qu’il n’y a pas de touffes de cellules, et que les cultures sont entièrement confluentes et bien réparties. Au moins 30 minutes avant l’essai allumer un lecteur de microplaque et le mettre à 37 degrés Celsius.Laver le tube d’un injecteur automatisé avec trois millilitres de 70 % d’éthanol, trois millilitres d’eau distillée et trois millilitres de solution I. Ensuite, réchauffez les solutions C et I à 37 degrés Celsius dans un bain d’eau. Soit aspirer le milieu de croissance ou inverser la plaque pour la vider.Appuyez sur n’importe quel milieu résiduel. Ajoutez ensuite la solution C à un réservoir à l’aide d’une pipette multicanal pour ajouter 200 microlitres de solution C à chaque puits de la plaque. Soit aspirer la solution ou inverser la plaque pour la vider, ce qui rend à exploiter n’importe quelle solution résiduelle.Ajouter 50 microlitres de solution C à chaque puits. Ajoutez ensuite un microlitre d’un stock chimique de 2,5 milli molaires ou DMSO comme véhicule, et ajoutez 50 microlitres de solution C à chaque puits. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans l’air pendant environ 10 minutes.Pendant l’incubation, commencez à définir les paramètres du programme de lecteur de microplaques en cliquant sur le bouton Gérer les protocoles. Cliquez sur le nouveau bouton. Sélectionnez l’intensité de fluorescence dans la section Méthode de mesure et mode Puits dans la section Mode lecture.Ensuite, cliquez sur le bouton OK. Un nouvel onglet apparaîtra. Dans le menu Paramètres de base réglez la longueur d’onde Excitation à 485 nanomètres, et l’émission à 520 nanomètres.Sélectionnez l’optique Bottom pour lire la fluorescence par le bas. Réglez ensuite l’heure de début de mesure à zéro seconde, le nombre d’intervalles à 25, le nombre de flashs par puits et l’intervalle à 20, et le temps d’intervalle à 0,4 secondes. Dans le menu Layout dessiner une région de l’assiette à lire.Dans le menu Concentrations/Volumes/Shacking, réglez le lecteur de microplaques pour injecter 100 microlitres de solution I à chaque puits avec une vitesse d’injection de 135 microlitres par seconde. Dans le menu Temps d’injection définir l’heure de début d’injection pour être une seconde. Cliquez ensuite sur le bouton de mesure Démarrer.Lorsque l’incubation est terminée, transférez les plaques de 96 puits au lecteur de microplaque et recommencez la mesure en cliquant à nouveau sur le bouton de mesure Démarrer. Dans cette étude, l’essai fluorescent iodine-jaune de protéine-écart de jonction-intercellulaire de communication est employé avec des modules intracellulaires de communication de jonction de LN215-YFP et de LN215 pour examiner 2.320 produits chimiques pour identifier de nouveaux modulateurs intracellulaires de communication de jonction d’écart. Homosalate est vu pour inhiber 50% de la communication intracellulaire de jonction d’écart.Alors que la terbinafine l’inhibe complètement. Ceci confirme la terbinafine comme inhibiteur de jonction d’écart. Cet essai mesure le GJIC entre les cellules voisines du donneur et de l’accepteur, de sorte que les cellules du donneur et de l’accepteur doivent être complètement dissociées avant le placage.Et la confluence de la culture mixte devrait être à 100% pour maximiser la formation de jonctions d’écart entre les cellules. Les données sur le cours du temps, les relations de réponse à la dose et l’évaluation de la réversibilité des modulateurs de jonction des écarts peuvent être obtenues à l’aide de l’analyse Iodide-YFP-GJIC. En outre, des analyses spécifiques de connexin GJIC d’Iodide-YFP peuvent être établies en induisant l’expression d’une connexine d’intérêt dans les cellules dépourvues des jonctions fonctionnelles d’écart.Cela permet de déterminer la valeur IC50 d’un produit chimique d’un type spécifique de connexine. L’analyse Iodide-YFP-GJIC peut être utilisée pour le criblage à haut débit, car elle est robuste, reproductible et peu coûteuse. Cet essai aide à trouver la jonction d’écart modulant des produits chimiques pour la découverte de drogue et l’évaluation toxicologique.

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