Name: an iodide-yellow fluorescent protein-gap junction-intercellular communication assay
Uploaded: 2019-02-01T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Iodide-Yellow Fluorescent Protein-Gap Junction-Intercellular Communication Assay at JoVE.com

Это исследование было поддержано базовой программы исследований науки через национальных исследований фонда из Кореи (NRF) финансируется министерством образования (2011-0023701, 2016R1D1A1A02937397 и 2018R1A6A1A03023718).

1. поколение lentiviruses, выражая рекламы ЯФПQL и SLC26A4
<ol><li>Растут HEK293T человеческих эмбриональных почечных клеток до 80% confluency на 100 мм культуры пластин. Дульбекко изменение орла среднего (DMEM) дополнены плода бычьим сывороточным 10%, 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина 100 мкг/мл является пи?...

<ol>
	<li>Goodenough, D. a., Goliger, J. a., Paul, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexins,+connexons,+and+Intercellular+Communication.">Connexins, connexons, and Intercellular Communication.</a> Annual Review of Biochemistry. 65, 475-502 (1996).</li><li>Upham, B. L., Weis, L. M., Trosko, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulated+Gap+Junctional+Intercellular+Communication+as+a+Biomarker+of+PAH+Epigenetic+Toxicity:+Structure-Function+Relationship.">Modulated Gap Junctional Intercellular Communication as a Biomarker of PAH Epigenetic Toxicity: Structure-Function Relationship.</a> Environmental Health Perspectives. 106, 975 (1998).</li><li>U, J. E. T., Chang, C., Upham, B., Wilson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+toxicology+as+toxicant-induced+changes+in+intracellular+signalling+leading+to+altered+gap+junctional+intercellular+communication.">Epigenetic toxicology as toxicant-induced changes in intracellular signalling leading to altered gap junctional intercellular communication.</a> Toxicology Letters. , 71-78 (1998).</li><li>Yamasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+disrupted+gap+junctional+intercellular+communications+in+detection+and+characterization+of+carcinogens.">Role of disrupted gap junctional intercellular communications in detection and characterization of carcinogens.</a> Mutation Research - Reviews in Genetic Toxicology. , (1996).</li><li>Yamasaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctional+intercellular+communication+and+cell+proliferation+during+rat+liver+carcinogenesis.">Gap junctional intercellular communication and cell proliferation during rat liver carcinogenesis.</a> Environmental Health Perspectives. 101, 191-197 (1993).</li><li>Vinken, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctional+intercellular+communication+as+a+target+for+liver+toxicity+and+carcinogenicity.">Gap junctional intercellular communication as a target for liver toxicity and carcinogenicity.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 44, 201-222 (2009).</li><li>Fonseca, C. G., Green, C. R., Nicholson, L. F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+in+astrocytic+connexin+43+gap+junction+levels+may+exacerbate+generalized+seizures+in+mesial+temporal+lobe+epilepsy.">Upregulation in astrocytic connexin 43 gap junction levels may exacerbate generalized seizures in mesial temporal lobe epilepsy.</a> Brain Research. 929 (1), 105-116 (2002).</li><li>Garbelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+connexin+43+in+the+human+epileptic+and+drug-resistant+cerebral+cortex.">Expression of connexin 43 in the human epileptic and drug-resistant cerebral cortex.</a> Neurology. 76 (10), 895-902 (2011).</li><li>Schulz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+43+is+an+emerging+therapeutic+target+in+ischemia/reperfusion+injury,+cardioprotection+and+neuroprotection.">Connexin 43 is an emerging therapeutic target in ischemia/reperfusion injury, cardioprotection and neuroprotection.</a> Pharmacology and Therapeutics. 153, 90-106 (2015).</li><li>Sarrouilhe, D., Dejean, C., Mesnil, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+gap+junction+channels+in+the+pathophysiology+of+migraine+with+aura.">Involvement of gap junction channels in the pathophysiology of migraine with aura.</a> Frontiers in Physiology. , (2014).</li><li>Patel, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junction+inhibition+prevents+drug-induced+liver+toxicity+and+fulminant+hepatic+failure.">Gap junction inhibition prevents drug-induced liver toxicity and fulminant hepatic failure.</a> Nature Biotechnology. 30 (2), 179-183 (2012).</li><li>Kandyba, E. E., Hodgins, M. B., Martin, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+living+skin+equivalent+amenable+to+live-cell+imaging:+analysis+of+the+roles+of+connexins+in+the+epidermis.">A murine living skin equivalent amenable to live-cell imaging: analysis of the roles of connexins in the epidermis.</a> Journal of Investigative Dermatology. 128 (4), 1039-1049 (2008).</li><li>Upham, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+roles+of+2+,+6+,+and+8+carbon+ceramides+on+the+modulation+of+gap+junctional+communication+and+apoptosis+during+carcinogenesis.">Differential roles of 2 , 6 , and 8 carbon ceramides on the modulation of gap junctional communication and apoptosis during carcinogenesis.</a> Cancer Letters. 191, 27-34 (2003).</li><li>Upham, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-activity-dependent+regulation+of+cell+communication+by+perfluorinated+fatty+acids+using+in+vivo+and+in+vitro+model+systems.">Structure-activity-dependent regulation of cell communication by perfluorinated fatty acids using in vivo and in vitro model systems.</a> Environmental Health Perspectives. 117 (4), 545-551 (2009).</li><li>Weis, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bay+or+Baylike+Regions+of+Polycyclic+Aromatic+Hydrocarbons+Were+Potent+Inhibitors+of+Gap+Intercellular+Communication.">Bay or Baylike Regions of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons Were Potent Inhibitors of Gap Intercellular Communication.</a> Environmental Health Perspectives. 106 (1), 17-22 (1998).</li><li>el-Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scrape-Loading+and+Dye+Transfer:+A+Rapid+and+Simple+Technique+to+Study+Gap+Junctional+Intercellular+Communication.">Scrape-Loading and Dye Transfer: A Rapid and Simple Technique to Study Gap Junctional Intercellular Communication.</a> Experimental Cell Research. 168 (2), 422-430 (1987).</li><li>Wade, M. H., Trosko, J. E., Schindler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching+Assay+of+Gap+Junction-+Mediated+Communication+Between+Human+Cells.">Photobleaching Assay of Gap Junction- Mediated Communication Between Human Cells.</a> Advancement of Science. 232 (4749), 525-528 (2010).</li><li>Abbaci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+characterization+of+gap+junctional+intercellular+communication+by+gap-FRAP+technique.">In vitro characterization of gap junctional intercellular communication by gap-FRAP technique.</a> Proceedings of SPIE. , 585909 (2005).</li><li>Neyton, J., Trautmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-channel+currents+of+an+intercellular+junction.">Single-channel currents of an intercellular junction.</a> Nature. 317 (6035), 331-335 (1985).</li><li>Wilders, R., Jongsma, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+the+dual+voltage+clamp+method+in+assaying+conductance+and+kinetics+of+gap+junction+channels.">Limitations of the dual voltage clamp method in assaying conductance and kinetics of gap junction channels.</a> Biophysical Journal. 63 (4), 942-953 (1992).</li><li>Lee, J. Y., Choi, E. J., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+high-throughput+screening-compatible+gap+junctional+intercellular+communication+assay.">A new high-throughput screening-compatible gap junctional intercellular communication assay.</a> BMC Biotechnology. 15 (1), 1-9 (2015).</li><li>Galietta, L. J. V., Haggie, P. M., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein-based+halide+indicators+with+improved+chloride+and+iodide+affinities.">Green fluorescent protein-based halide indicators with improved chloride and iodide affinities.</a> FEBS Letters. 499 (3), 220-224 (2001).</li><li>Lee, J. Y., Yoon, S. M., Choi, E. J., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terbinafine+inhibits+gap+junctional+intercellular+communication.">Terbinafine inhibits gap junctional intercellular communication.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 307, 102-107 (2016).</li><li>Hughes, J., Rees, S., Kalindjian, S., Philpott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+early+drug+discovery.">Principles of early drug discovery.</a> British Journal of Pharmacology. 162 (6), 1239-1249 (2011).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays.">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Upham, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Integrative+Signaling+Through+Gap+Junctions+in+Toxicology.">Role of Integrative Signaling Through Gap Junctions in Toxicology.</a> Current Protocols in Toxicology. , (2011).</li><li>Schalper, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+gap+junction+channels+and+hemichannels+by+growth+factors.">Modulation of gap junction channels and hemichannels by growth factors.</a> Molecular BioSystems. 8 (3), 685-698 (2012).</li><li>Kulkarni, G. V., Mcculloch, C. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+deprivation+induces+apoptotic+cell+death+in+a+subset+of+Balb+/+c+3T3+fibroblasts.">Serum deprivation induces apoptotic cell death in a subset of Balb / c 3T3 fibroblasts.</a> Journal of Cell Science. 1179, 1169-1179 (1994).</li><li>Harris, A. L., Locke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+of+Connexin+Channels.">Permeability of Connexin Channels.</a> Connexins. , 165-206 (2009).</li><li>Choi, E. J., Yeo, J. H., Yoon, S. M., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gambogic+Acid+and+Its+Analogs+Inhibit+Gap.">Gambogic Acid and Its Analogs Inhibit Gap.</a> Junctional Intercellular Communication. 9, 1-10 (2018).</li></ol>

Assay рекламы ЯФП-GJIC может использоваться для HTS, потому что это надежный, быстрый и недорогой. HTS assay считается надежной Если Z'-фактор превышает 0,525. Смотреть Zhang et al. для описания статистического анализа, используемый для оценки пригодности HTS анализов25. Когда LN215 к?...

Разрыв соединения (GJs) выступать в качестве межклеточного каналы, чтобы разрешить распространение малых молекул < 1 кДа таких питательных веществ, метаболитов и сигнальных молекул между соседними ячейками. Соединительной элементы включают hemichannel или Коннексоны в каждой ячейке, и каждый Коннексоны представляет собой шесть connexins (Cxs)1. GJs и Cxs были использованы в токсикологии анализов канцерогенных веществ таких как полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), которые являются GJ ингибиторы2,3,4. Нарушена GJIC был связан с nongenotoxic канцерогенез5,6. Как потенциальной терапевтической цели ГДЖ участие было сообщено в частности подтипы изъятий7,8, защита от сердца и мозга ишемии/реперфузии травмы9, мигрень с аурой10, лекарственно индуцированные травма печени6,11и ранозаживляющее12. Высокопроизводительного скрининга (HTS) анализы необходимы для выявления GJ-модулирующих химических веществ или антител для обнаружения наркотиков, для анализов токсикологии и выявления роман сотовой регуляторы активности GJ. HTS анализов может также использоваться для расследования связей структура активность GJ модуляторы2,13,,1415.
Некоторые GJIC анализы включают переноса красителя или двойной патч зажим методов. Люцифер желтый чемпион (LY) и Флуорексон acetoxymethyl эфира (Флуорексон ам) были использованы в красителях передача анализов. Клетки не проницаемой для LY, который вводится путем микроинъекции, лом загрузки или электропорации. Раз внутри клетки, LY распространяется на соседние клетки через GJs и GJ деятельность assayed масштабы миграции LY16. Флуорексон-ам анализов обычно включают в себя разрыв флуоресценции восстановления после Фотообесцвечивание17,18. Флуорексон-ам является клеток permeant красителем, который внутриклеточно преобразован в непроницаемой Флуорексон внутренней эстеразы. Assay требует Конфокальный микроскоп для наблюдения за передачей Флуорексон ам в клетку от окружающих его после лазерной Фотообесцвечивание. Если функциональные GJs присутствуют, Флуорексон ам в соседних ячейках входит photobleached клеток и флуоресценции восстанавливается. GJ активность assayed по степени восстановления флуоресценции клеток photobleached. Анализы на красителях передача кропотливая и требует много времени или низкой чувствительности. Зажим двойной патч является электрофизиологических метод, который измеряет соединительной проводимости. Это относительно чувствительных, с прямая зависимость проводимости на количество открытых GJs19; Однако она является технически сложным, трудоемким и дорогим20. Assay рекламы ЯФП-GJIC был разработан для использования в Хайтс
Рисунок 1 иллюстрирует компоненты и действия рекламы-ЯФП GJIC assay, который использует акцептора клетки, выражая вариант рекламы ЯФП йодид чувствительных, H148Q и I152L (QLрекламы ЯФП) и клеток донора, выражая йодида транспортера (SLC26A4)21 . Две мутации, перевозимых рекламы ЯФПQL позволяют тушения флуоресценции йодида22. Йодиды добавляются к совместно культивируемых акцептора и клеток донора; не вводите акцептора клетки, они принимаются до настоящего SLC26A4 транспортеры на клеток донора. Йодиды в клеток донора диффундируют через функционирование GJs в прилегающих акцептора клетки, где они утоляют рекламы ЯФПQL флуоресценции. Если GJs закрыты или заблокированы ингибиторы, йодида нельзя ввести акцептора клетки, чтобы утолить флуоресценции. GJ деятельность отражает скорость тушения рекламы ЯФПQL . Процедура анализа GJIC рекламы-ЯФП сложным ни много времени. Он совместим с HTS и может использоваться для проверки воздействия большого числа соединений на ГДЖ активность в течение относительно короткого периода. Он требует только акцептора и клеток донора и два сбалансированных солевых растворов. Протокол, в описанный ниже основывается на LN215 клетки, чьи основные Cx-Cx4321. LN215-рекламы ЯФПQL рецепторов и LN215-я− доноров клеток были порожденных трансдукция с lentiviruses, выражая рекламы ЯФПQL или SLC26A421,23.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:629px;" width="630">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">96-well plate</td>
			<td style="width:72px;">SPL</td>
			<td style="width:123px;">30096</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td style="width:72px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">C5670</td>
			<td>I-solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:72px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">G7021</td>
			<td>C-solution, I-solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:72px;">sigma</td>
			<td style="width:123px;">276855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">HEPES</td>
			<td style="width:72px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">RES6003H-B7</td>
			<td>C-solution, I-solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:72px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">11668-027</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:268px;">Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2 6H2O)</td>
			<td style="width:72px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">M2393</td>
			<td>C-solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:268px;">Microplate reader&#160;</td>
			<td style="width:72px;">BMG LabTech&#160;</td>
			<td style="width:123px;">POLARstar Omega 415-1618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMD2.G&#160;</td>
			<td style="width:72px;">Addgene</td>
			<td>#12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Polybrene</td>
			<td style="width:72px;">sigma</td>
			<td style="width:123px;">H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Poly-L-lysine solution</td>
			<td style="width:72px;">sigma</td>
			<td style="width:123px;">P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Potassium chloride (KCl)</td>
			<td style="width:72px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P5405</td>
			<td>C-solution, I-solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">psPAX2&#160;</td>
			<td style="width:72px;">Addgene</td>
			<td style="width:123px;">&#160;#12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td style="width:72px;">sigma</td>
			<td style="width:123px;">P8833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:72px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">S5886</td>
			<td>C-solution, I-solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Sodium hyroxide (NaOH)</td>
			<td style="width:72px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">S2770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Sodium Iodide (NaI)</td>
			<td style="width:72px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">383112</td>
			<td>I-solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an iodide-yellow fluorescent protein-gap junction-intercellular communication assay

Разрыв соединения (GJs) являются каналы клеточной мембраны, которые позволяют диффузии молекул меньше 1 кДа между соседними ячейками. Как они физиологических и патологических ролей, существует необходимость высокопроизводительного скрининга (HTS) анализов для выявления GJ модуляторы в наркотиками открытий и токсикологии анализов. Роман йодид желтый флуоресцентный белок разрыв соединения межклеточные связи (I-рекламы ЯФП-GJIC) пробирного удовлетворяет эту потребность. Это на основе ячеек пробирного, включая доноров и акцепторов клетки, которые разработаны для стабильно Экспресс вариант желтый флуоресцентный белок (рекламы ЯФП), чьи флуоресценции чутко закаленном йодида, или SLC26A4, иодид транспортер, соответственно. Когда йодида добавляется к смешанной культуре клеток двух типов, они ввести клеток донора через SLC26A4 транспортер и диффузного в прилегающих акцептора клетки через GJs где они утолить рекламы ЯФП флуоресценции. Рекламы ЯФП флуоресценции измеряется от скважины в кинетическую режиме. GJ деятельность отражает скорость тушения рекламы ЯФП. Assay надежный и быстрый, чтобы использоваться для Хайтс Протокол assay рекламы ЯФП-GJIC с использованием LN215 клеток, клеток глиомы человека, описал.

Двадцать девять 96-луночных культуры пластины были использованы для экрана 2,320 химических веществ для определения романа Модуляторы GJIC рекламы-ЯФП GJIC анализа с использованием LN215-рекламы ЯФПQL и LN215-я− клетки. На рисунке 2показаны результаты,...

Watch this Scientific Journal Video about An Iodide-Yellow Fluorescent Protein-Gap Junction-Intercellular Communication Assay at JoVE.com

An Iodide-Yellow Fluorescent Protein-Gap Junction-Intercellular Communication Assay

Иодид желтый флуоресцентный белок разрыв соединения межклеточные связи Assay

Здесь мы представляем протокол для Роман разрыв соединения межклеточные связи assay предназначен для высокопроизводительного скрининга разрыв соединения модулирующих химических веществ для обнаружения наркотиков и токсикологические оценки.

Gap junctions (GJs) are cell membrane channels that allow diffusion of molecules smaller than 1 kDa between adjacent cells. As they have physiological and ...

Gap соединения были предложены в качестве целей наркотиков. Анализ Iodide-YFP-GJIC совместим с высокой пропускной способностью скрининга, чтобы обнаружить разрыв соединения модуляторов. Он используется для проверки воздействия большого числа соединений на деятельность соединения зазоров в относительно короткий период времени.Анализ Iodide-YFP-GJIC прост, надежн, повторяем и недорог. Для этого анализа требуются только донорские и донорские клетки и два сбалансированных солевых раствора. Никаких дополнительных реагентов, таких как Люцифер желтый и Calcein AM не требуется.Кроме того, он измеряет общий разрыв соединения деятельности клеток в одной хорошо, что приводит к низкой между хорошо изменчивости. Для начала этой процедуры вырастет LN215 ячеек до 80% стечения в дополненной DMEM, как указано в текстовом протоколе. За день до трансдукции мыть клетки дважды с 10 миллилитров PBS.Добавить два миллилитров 0,25%трипсина EDTA в клетки и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение трех минут. С помощью 10-миллилитрового серологического пипетки повторно помесят клетки в пять миллилитров среды культуры и отрегулируйте плотность клеток до 50 000 клеток на миллилитр. Добавьте 400 микролитров мультимедиа, которые содержат 20 000 ячеек к каждому колодец 24-колодец культуры пластины.Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 24 часов. На следующий день вывести две скважины, заменив культурную среду 400 микролитров смеси лентивируса и свежей культуры, дополненной полибреном при конечной концентрации в четыре микрограмма на миллилитр. Ибо отсутствие контроля над вирусом заменяет культурную среду свежей культурной средой, дополненной полибреном при конечной концентрации в четыре микрограмма на миллилитр.Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 15 часов. Затем аспирировать среды, содержащие лентивирусы, и свежие среды культуры. Инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию в течение еще 72 часов.После этого, мыть клетки в каждом хорошо в два раза с 0,5 миллилитров PBS. Добавить 300 микролитров 0,25%трипсина EDTA в клетки, и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение трех минут. Повторное течение клеток в двух миллилитров культуры среды, а затем пластины их в шесть хорошо культуры пластин с двумя микрограммами на миллилитр пуромицина.Культура клетки, пока все клетки в контрольных скважин мертвы, что обычно занимает около недели. Во-первых, отдельно культуры LN215-YFP и LN215-йодидных клеток в 100-миллиметровых пластин в среде культуры для достижения населения, необходимого для анализа. За день до анализа, мыть каждую тарелку с 10 миллилитров PBS.Лечить каждую тарелку с двумя миллилитров 0,25%трипсина EDTA раствор, и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение пяти минут. Повторное использование клеток в четырех миллилитров среды культуры и передать их в 15-миллилитровых конических труб. Центрифуга при 1000 г в течение трех минут, чтобы гранулировать клетки.Откажитесь от супернатанта и повторно посовещение каждой клеточной гранулы в пять миллилитров среды культуры. Pipette вверх и вниз около 20 раз, чтобы разбить любые ячейки сгустки. Используйте гемоцитометр для подсчета клеток.А затем разбавить клетки в среде культуры, чтобы сделать подвес клеток на плотности показано здесь. Затем смешайте семь миллилитров каждой клеточной подвески вместе в резервуаре. Используйте многоканальный пипетку, чтобы добавить 100 микролитров этой смеси к каждому колодец 96-ну культуры пластины.Инкубировать при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом в течение 24 часов. Во-первых, используйте флуоресцентный микроскоп с увеличением 20X и фильтр GFP, чтобы проверить 96-хорошо пластин, чтобы убедиться, что Есть нет скопления клеток, и что культуры полностью confluent и хорошо распределены. По крайней мере за 30 минут до анализа включите микроплюрат и установите его до 37 градусов по Цельсию.Вымойте трубки автоматизированного инжектора с тремя миллилитров 70% этанола, три миллилитров дистиллированной воды, и три миллилитров I-решения. Далее, тепло C и I-решений до 37 градусов по Цельсию в водяной бане. Либо аспирировать рост среды или инвертировать пластины, чтобы очистить его.Нажмите на любую остаточную среду. Затем добавьте C-решение в резервуар с помощью многоканальной пипетки, чтобы добавить 200 микролитров C-решения к каждой пластине. Либо аспирировать раствор или инвертировать пластину, чтобы очистить его, что делает выстучать любой остаточный раствор.Добавьте 50 микролитров C-решения к каждой колодец. Затем добавьте один микролитр либо 2,5-миллимолярный химический запас или DMSO в качестве транспортного средства, и добавьте еще 50 микролитров C-решения к каждой колодец. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия в воздухе в течение примерно 10 минут.Во время инкубации начните устанавливать параметры в программе чтения микроплатформ, нажав кнопку Протоколы управления. Нажмите на новую кнопку. Выберите интенсивность флуоресценции в разделе Метод измерения и режим Well Mode в разделе Режим чтения.Далее нажмите кнопку OK. Появится новая вкладка. В меню «Основные параметры» длина волны Возбуждения составляет 485 нанометров, а эмиссия — до 520 нанометров.Выберите нижнюю оптику для чтения флуоресценции снизу. Затем установите время начала измерения на ноль секунд, количество интервалов будет 25, количество вспышек на колодец и интервал будет 20, а интервал времени будет 0,4 секунды. В меню Layout нарисуйте область пластины для чтения.В меню Концентрации/Объемы/Shacking установлен считыватель микропластиров для впрыскивания 100 микролитров I-решения к каждому хорошо со скоростью впрыска 135 микролитров в секунду. В меню Время инъекций установите время начала инъекции на одну секунду. Затем нажмите кнопку «Начало измерения».Когда инкубация завершена, перенесите пластины 96-колодец на считыватель микропластиц и начните измерение, нажав кнопку измерения Пуск снова. В этом исследовании, йод-желтый флуоресцентный белок-пробел соединения межклеточной связи анализ используется с LN215-YFP и LN215-йодных клеток для экрана 2, 320 химических веществ для выявления новых разрывов внутриклеточных модуляторов связи. Homosalate, как видно, подавляет 50% разрыва внутриклеточной связи.В то время как тербинафин полностью подавляет его. Это подтверждает тербинафин в качестве ингибитора разрыва соединения. Этот анализ измеряет GJIC между соседними донорами и клетками-приемокторами, поэтому донорские и приемочные клетки должны быть полностью разобщены перед покрытием.И слияние смешанной культуры должно быть 100%, чтобы максимизировать образование разрывов между клетками. Данные о курсах времени, отношения реакции дозы и оценка обратимости модуляторов соединения разрыва могут быть получены с помощью анализа Iodide-YFP-GJIC. Кроме того, Iodide-YFP конкретных connexin GJIC анализы могут быть созданы путем индуцирования выражения коннексина интереса в ячейки, лишенные функциональных соединений разрыв.Это позволяет определить значение IC50 химического вещества определенного типа коннексина. Анализ Iodide-YFP-GJIC может быть использован для скрининга с высокой пропускной способностью, поскольку он является надежным, повторяемым и недорогим. Этот анализ помогает найти разрыв соединения модуляции химических веществ для обнаружения наркотиков и токсикологической оценки.

Research

JoVE Journal

Biology

Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay

Титрование по правам Коронавирусы Использование Иммунопероксидазное Пробирной

Determination of infectious viral titers is a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for ...

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Домашний сайт направленного мутагенеза Всего Плазмиды

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

В пробирке FluoroBlok опухолевой инвазии Пробирной

The hallmark of metastatic cells is their ability to invade through the basement membrane and migrate to other parts of the body. Cells must be able to ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

Флуоресцентные Анализ Скрининг на выявление каналов модуляторы GIRK

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

Одноклеточный Микроинъекция для анализа сотовой связи

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

An Assay for Lateral Line Regeneration in Adult Zebrafish

Анализ на боковой линии регенерации в взрослых данио рерио

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line ...

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

Оценка данио рерио функции почек с помощью флуоресцентного Зазор Пробирной

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Комет в качестве косвенного измерения системных окислительного стресса

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...

An Ex Vivo Choroid Sprouting Assay of Ocular Microvascular Angiogenesis

Ex Vivo Choroid Прорастание анализ глазного микрососудистого ангиогенеза

Pathological choroidal angiogenesis, a salient feature of age-related macular degeneration, leads to vision impairment and blindness. Endothelial cell ...