Name: an iodide-yellow fluorescent protein-gap junction-intercellular communication assay
Uploaded: 2019-02-01T14:00:00
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Esta investigación fue apoyada por el programa de investigación de ciencia básica a través de la nacional investigación Fundación de Corea (NRF) financiado por el Ministerio de Educación (2011-0023701, 2016R1D1A1A02937397 y 2018R1A6A1A03023718).

1. generación de lentiviruses expresando YFPQL y SLC26A4
<ol><li>Crecer las células de riñón embrionario humano HEK293T 80% confluency en las placas de cultivo de 100 mm. Modificado Eagle Medium (DMEM de Dulbecco) suplementado con suero bovino fetal 10%, 100 U/mL de penicilina y estreptomicina μg/mL 100 es el medio de cultivo utilizado en el protocolo de mantener HEK293T y otras células que se mencionan a continuación.</li>
	<li>Capa bien 6 placas por cada bien durante 10 minutos, añadir 2 mL de 0.00...

<ol>
	<li>Goodenough, D. a., Goliger, J. a., Paul, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexins,+connexons,+and+Intercellular+Communication.">Connexins, connexons, and Intercellular Communication.</a> Annual Review of Biochemistry. 65, 475-502 (1996).</li><li>Upham, B. L., Weis, L. M., Trosko, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulated+Gap+Junctional+Intercellular+Communication+as+a+Biomarker+of+PAH+Epigenetic+Toxicity:+Structure-Function+Relationship.">Modulated Gap Junctional Intercellular Communication as a Biomarker of PAH Epigenetic Toxicity: Structure-Function Relationship.</a> Environmental Health Perspectives. 106, 975 (1998).</li><li>U, J. E. T., Chang, C., Upham, B., Wilson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+toxicology+as+toxicant-induced+changes+in+intracellular+signalling+leading+to+altered+gap+junctional+intercellular+communication.">Epigenetic toxicology as toxicant-induced changes in intracellular signalling leading to altered gap junctional intercellular communication.</a> Toxicology Letters. , 71-78 (1998).</li><li>Yamasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+disrupted+gap+junctional+intercellular+communications+in+detection+and+characterization+of+carcinogens.">Role of disrupted gap junctional intercellular communications in detection and characterization of carcinogens.</a> Mutation Research - Reviews in Genetic Toxicology. , (1996).</li><li>Yamasaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctional+intercellular+communication+and+cell+proliferation+during+rat+liver+carcinogenesis.">Gap junctional intercellular communication and cell proliferation during rat liver carcinogenesis.</a> Environmental Health Perspectives. 101, 191-197 (1993).</li><li>Vinken, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctional+intercellular+communication+as+a+target+for+liver+toxicity+and+carcinogenicity.">Gap junctional intercellular communication as a target for liver toxicity and carcinogenicity.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 44, 201-222 (2009).</li><li>Fonseca, C. G., Green, C. R., Nicholson, L. F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+in+astrocytic+connexin+43+gap+junction+levels+may+exacerbate+generalized+seizures+in+mesial+temporal+lobe+epilepsy.">Upregulation in astrocytic connexin 43 gap junction levels may exacerbate generalized seizures in mesial temporal lobe epilepsy.</a> Brain Research. 929 (1), 105-116 (2002).</li><li>Garbelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+connexin+43+in+the+human+epileptic+and+drug-resistant+cerebral+cortex.">Expression of connexin 43 in the human epileptic and drug-resistant cerebral cortex.</a> Neurology. 76 (10), 895-902 (2011).</li><li>Schulz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+43+is+an+emerging+therapeutic+target+in+ischemia/reperfusion+injury,+cardioprotection+and+neuroprotection.">Connexin 43 is an emerging therapeutic target in ischemia/reperfusion injury, cardioprotection and neuroprotection.</a> Pharmacology and Therapeutics. 153, 90-106 (2015).</li><li>Sarrouilhe, D., Dejean, C., Mesnil, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+gap+junction+channels+in+the+pathophysiology+of+migraine+with+aura.">Involvement of gap junction channels in the pathophysiology of migraine with aura.</a> Frontiers in Physiology. , (2014).</li><li>Patel, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junction+inhibition+prevents+drug-induced+liver+toxicity+and+fulminant+hepatic+failure.">Gap junction inhibition prevents drug-induced liver toxicity and fulminant hepatic failure.</a> Nature Biotechnology. 30 (2), 179-183 (2012).</li><li>Kandyba, E. E., Hodgins, M. B., Martin, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+living+skin+equivalent+amenable+to+live-cell+imaging:+analysis+of+the+roles+of+connexins+in+the+epidermis.">A murine living skin equivalent amenable to live-cell imaging: analysis of the roles of connexins in the epidermis.</a> Journal of Investigative Dermatology. 128 (4), 1039-1049 (2008).</li><li>Upham, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+roles+of+2+,+6+,+and+8+carbon+ceramides+on+the+modulation+of+gap+junctional+communication+and+apoptosis+during+carcinogenesis.">Differential roles of 2 , 6 , and 8 carbon ceramides on the modulation of gap junctional communication and apoptosis during carcinogenesis.</a> Cancer Letters. 191, 27-34 (2003).</li><li>Upham, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-activity-dependent+regulation+of+cell+communication+by+perfluorinated+fatty+acids+using+in+vivo+and+in+vitro+model+systems.">Structure-activity-dependent regulation of cell communication by perfluorinated fatty acids using in vivo and in vitro model systems.</a> Environmental Health Perspectives. 117 (4), 545-551 (2009).</li><li>Weis, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bay+or+Baylike+Regions+of+Polycyclic+Aromatic+Hydrocarbons+Were+Potent+Inhibitors+of+Gap+Intercellular+Communication.">Bay or Baylike Regions of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons Were Potent Inhibitors of Gap Intercellular Communication.</a> Environmental Health Perspectives. 106 (1), 17-22 (1998).</li><li>el-Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scrape-Loading+and+Dye+Transfer:+A+Rapid+and+Simple+Technique+to+Study+Gap+Junctional+Intercellular+Communication.">Scrape-Loading and Dye Transfer: A Rapid and Simple Technique to Study Gap Junctional Intercellular Communication.</a> Experimental Cell Research. 168 (2), 422-430 (1987).</li><li>Wade, M. H., Trosko, J. E., Schindler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching+Assay+of+Gap+Junction-+Mediated+Communication+Between+Human+Cells.">Photobleaching Assay of Gap Junction- Mediated Communication Between Human Cells.</a> Advancement of Science. 232 (4749), 525-528 (2010).</li><li>Abbaci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+characterization+of+gap+junctional+intercellular+communication+by+gap-FRAP+technique.">In vitro characterization of gap junctional intercellular communication by gap-FRAP technique.</a> Proceedings of SPIE. , 585909 (2005).</li><li>Neyton, J., Trautmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-channel+currents+of+an+intercellular+junction.">Single-channel currents of an intercellular junction.</a> Nature. 317 (6035), 331-335 (1985).</li><li>Wilders, R., Jongsma, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+the+dual+voltage+clamp+method+in+assaying+conductance+and+kinetics+of+gap+junction+channels.">Limitations of the dual voltage clamp method in assaying conductance and kinetics of gap junction channels.</a> Biophysical Journal. 63 (4), 942-953 (1992).</li><li>Lee, J. Y., Choi, E. J., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+high-throughput+screening-compatible+gap+junctional+intercellular+communication+assay.">A new high-throughput screening-compatible gap junctional intercellular communication assay.</a> BMC Biotechnology. 15 (1), 1-9 (2015).</li><li>Galietta, L. J. V., Haggie, P. M., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein-based+halide+indicators+with+improved+chloride+and+iodide+affinities.">Green fluorescent protein-based halide indicators with improved chloride and iodide affinities.</a> FEBS Letters. 499 (3), 220-224 (2001).</li><li>Lee, J. Y., Yoon, S. M., Choi, E. J., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terbinafine+inhibits+gap+junctional+intercellular+communication.">Terbinafine inhibits gap junctional intercellular communication.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 307, 102-107 (2016).</li><li>Hughes, J., Rees, S., Kalindjian, S., Philpott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+early+drug+discovery.">Principles of early drug discovery.</a> British Journal of Pharmacology. 162 (6), 1239-1249 (2011).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays.">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Upham, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Integrative+Signaling+Through+Gap+Junctions+in+Toxicology.">Role of Integrative Signaling Through Gap Junctions in Toxicology.</a> Current Protocols in Toxicology. , (2011).</li><li>Schalper, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+gap+junction+channels+and+hemichannels+by+growth+factors.">Modulation of gap junction channels and hemichannels by growth factors.</a> Molecular BioSystems. 8 (3), 685-698 (2012).</li><li>Kulkarni, G. V., Mcculloch, C. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+deprivation+induces+apoptotic+cell+death+in+a+subset+of+Balb+/+c+3T3+fibroblasts.">Serum deprivation induces apoptotic cell death in a subset of Balb / c 3T3 fibroblasts.</a> Journal of Cell Science. 1179, 1169-1179 (1994).</li><li>Harris, A. L., Locke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+of+Connexin+Channels.">Permeability of Connexin Channels.</a> Connexins. , 165-206 (2009).</li><li>Choi, E. J., Yeo, J. H., Yoon, S. M., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gambogic+Acid+and+Its+Analogs+Inhibit+Gap.">Gambogic Acid and Its Analogs Inhibit Gap.</a> Junctional Intercellular Communication. 9, 1-10 (2018).</li></ol>

El ensayo de YFP-GJIC puede utilizarse para HTS porque es robusto, rápido y barato. Un ensayo HTS es considerado robusto si el Z'-factor está por encima de 0,525. Ver Zhang et al. para una descripción del análisis estadístico utilizado para evaluar la idoneidad de HTS ensayos25. Cuando se utilizaron las células de LN215, el Z'-factor fue > 0,5 sin ninguna optimización de ensayo. Si se utilizan otros tipos de células en el ensayo y su Z'-factor es < 0.5, la robustez ...

Uniones comunicantes (GJs) actúan como Canales intercelulares que permiten la difusión de moléculas pequeñas de < 1 kDa como nutrientes, metabolitos y moléculas de señalización entre células adyacentes. Los elementos de Unión incluyen un hemichannel o connexon en cada célula, y cada connexon constituye seis conexinas (Cxs)1. GJs y Cxs se han utilizado en los ensayos de Toxicología de carcinógenos como los hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAH), que son inhibidores GJ2,3,4. GJIC interrumpida se ha asociado con nongenotoxic carcinogénesis5,6. Como una diana terapéutica potencial, participación de GJ se ha divulgado en particular subtipos de convulsiones7,8, protección cardiaca y cerebro isquemia/reperfusión lesiones9, migraña con aura10, lesión hepática inducida por drogas6,11y12de cicatrización. Ensayos de high-throughput screening (HTS) son necesarios para identificar productos químicos modulación de GJ o anticuerpos para el descubrimiento de medicamentos, para los ensayos de Toxicología e identificar nuevos celulares reguladores de actividad GJ. Ensayos HTS pueden utilizarse también para investigar las relaciones estructura-actividad de GJ moduladores2,13,14,15.
Algunos ensayos GJIC incluyen transferencia de tinte o técnicas de sujeción de doble parche. Lucifer amarillo CH (LY) y éster acetoxymethyl de calceína (calceína-AM) se han utilizado en los ensayos de transferencia del tinte. Las células no son permeables a LY, que es introducido por microinyección, carga del rascado o electroporación. Una vez dentro de la célula, LY se extiende en vecino las células vía GJs y actividad GJ es analizado por la magnitud de la migración LY del16. Ensayos de calceína-AM implican generalmente recuperación de gap-Fluorescencia Tras Fotoblanqueo17,18. Calceína-AM es un colorante florescente de la célula que se convierte intracelularmente en calceína impermeable por una esterasa intrínseca. El ensayo requiere de un microscopio confocal para observar a la transferencia de calceína-AM en un celular de los que lo rodean después de photobleaching láser. Si GJs funcionales están presentes, calceína-AM en células adyacentes entra en las células photobleached y la fluorescencia se recupera. Actividad GJ es analizado por el grado de recuperación de fluorescencia de las células photobleached. Ensayos de transferencia del tinte están laborioso y desperdiciador de tiempo o tienen baja sensibilidad. Doble parche es un método electrofisiológico que mide conductancia junctional. Es relativamente sensible, con una dependencia directa de la conductancia en el número de GJs abierto19; sin embargo, es técnicamente exigente, lento y costoso20. El ensayo de YFP-GJIC fue desarrollado para su uso en el HTS.
La figura 1 ilustra los componentes y pasos del ensayo GJIC-YFP, que utiliza células de aceptador expresan una variante YFP yoduro sensibles teniendo H148Q y I152L (YFPQL) y células del donante manifestando un transportador de yoduro (SLC26A4)21 . Las dos mutaciones por YFPQL permiten el amortiguamiento de la fluorescencia por yoduro22. Se añaden yoduros aceptador Co cultivado y células de un donante; no entrar en las células del aceptador, pero son tomadas por los transportadores de SLC26A4 presente en las células del donante. Yoduro en las células del donante se difunden a través de GJs funcionamiento en células aceptor adyacente donde apaga la fluorescencia de YFPQL . Si GJs cerrados o bloqueados por inhibidores, yoduro no puede entrar en las células de aceptador para apagar de la fluorescencia. La tasa de amortiguamiento YFPQL refleja actividad GJ. El procedimiento del ensayo-YFP GJIC no es complicado ni mucho tiempo. Es compatible con HTS y puede utilizarse para probar los efectos de un gran número de compuestos en la actividad GJ en un período relativamente corto. Requiere sólo aceptador y células de donante y dos soluciones salinas equilibradas. El protocolo descrito a continuación se basa en células de LN215 cuya principales Cx es de Cx4321. El receptor LN215-YFPQL y LN215-I− células del donante se generaron por transducción con lentivirus expresando YFPQL o SLC26A421,23.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:629px;" width="630">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">96-well plate</td>
			<td style="width:72px;">SPL</td>
			<td style="width:123px;">30096</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td style="width:72px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">C5670</td>
			<td>I-solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:72px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">G7021</td>
			<td>C-solution, I-solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:72px;">sigma</td>
			<td style="width:123px;">276855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">HEPES</td>
			<td style="width:72px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">RES6003H-B7</td>
			<td>C-solution, I-solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:72px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">11668-027</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:268px;">Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2 6H2O)</td>
			<td style="width:72px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">M2393</td>
			<td>C-solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:268px;">Microplate reader&#160;</td>
			<td style="width:72px;">BMG LabTech&#160;</td>
			<td style="width:123px;">POLARstar Omega 415-1618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMD2.G&#160;</td>
			<td style="width:72px;">Addgene</td>
			<td>#12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Polybrene</td>
			<td style="width:72px;">sigma</td>
			<td style="width:123px;">H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Poly-L-lysine solution</td>
			<td style="width:72px;">sigma</td>
			<td style="width:123px;">P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Potassium chloride (KCl)</td>
			<td style="width:72px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P5405</td>
			<td>C-solution, I-solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">psPAX2&#160;</td>
			<td style="width:72px;">Addgene</td>
			<td style="width:123px;">&#160;#12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td style="width:72px;">sigma</td>
			<td style="width:123px;">P8833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:72px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">S5886</td>
			<td>C-solution, I-solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Sodium hyroxide (NaOH)</td>
			<td style="width:72px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">S2770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Sodium Iodide (NaI)</td>
			<td style="width:72px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">383112</td>
			<td>I-solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an iodide-yellow fluorescent protein-gap junction-intercellular communication assay

Uniones comunicantes (GJs) son canales de la membrana de la célula que permiten difusión de moléculas más pequeñas que 1 kDa entre células adyacentes. Ya que tienen funciones fisiológicas y patológicas, hay necesidad de high-throughput screening (HTS) ensayos para identificar moduladores GJ en ensayos de toxicología y descubrimiento de drogas. Un ensayo de novela yoduro amarillo fluorescente proteína-gap comunicación Unión intercelular (I-YFP-GJIC) satisface esta necesidad. Es un ensayo basado en células como aceptor y donante de las células que están diseñadas para expresar estable una variante de la proteína amarilla fluorescente (YFP), cuya fluorescencia sensible se apaga por yoduro o SLC26A4, un transportador de yoduro, respectivamente. Cuando el yodo se añade a un cultivo mixto de los dos tipos celulares, entran en las células donantes vía el transportador SLC26A4 y difusa a las células adyacentes aceptador via GJs donde apaga la fluorescencia de YFP. Fluorescencia de YFP se mide bien por bien en un modo cinético. La tasa de amortiguamiento YFP refleja actividad GJ. El ensayo es fiable y rápida para HTS Se describe el protocolo para el ensayo de YFP-GJIC utilizando las células LN215, las células de glioma humano.

29 placas 96 pocillos fueron utilizadas para detectar productos 2.320 químicos para identificar moduladores GJIC novela por ensayo GJIC-YFP usando el LN215-YFPQL y LN215-I− células. Los resultados obtenidos con una placa representativa se muestran en la figura 2. El porcentaje de fluorescencia de YFP en cada pozo se muestra como un gráfico de líneas en la figura 2A y el porcentaje de a...

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An Iodide-Yellow Fluorescent Protein-Gap Junction-Intercellular Communication Assay

Un ensayo de comunicación Unión intercelular yoduro amarillo fluorescente proteína-Gap

Aquí, presentamos un protocolo para un ensayo de comunicación intercelular cruce nuevo espacio diseñado para el cribado de alto rendimiento de productos químicos modulación de ensambladura de gap para el descubrimiento de medicamentos y evaluación toxicológica.

Gap junctions (GJs) are cell membrane channels that allow diffusion of molecules smaller than 1 kDa between adjacent cells. As they have physiological and ...

Se han sugerido cruces de brechas como objetivos de drogas. El ensayo Iodide-YFP-GJIC es compatible con el cribado de alto rendimiento para descubrir moduladores de unión de brechas. Se ha utilizado para probar los efectos de un gran número de compuestos en las actividades de unión de brecha en un período relativamente corto.El ensayo Iodide-YFP-GJIC es simple, robusto, repetible y económico. Este ensayo solo requiere células de aceptación y donante y dos soluciones salinas equilibradas. No se necesitan reactivos adicionales como Lucifer amarillo y Calcein AM.También mide las actividades de unión de brecha total de las células en un solo pozo, lo que resulta en una baja variabilidad entre pozos. Para comenzar este procedimiento, las células LN215 crecen al 80% de confluencia en DMEM suplementado como se describe en el protocolo de texto. Un día antes de la transducción lavar las células dos veces con 10 mililitros de PBS.Añadir dos mililitros de 0.25%trypsin EDTA a las células e incubar a 37 grados Celsius durante tres minutos. Usando una pipeta serológica de 10 mililitros resuspendió las células en cinco mililitros de medio de cultivo y ajustar la densidad celular a 50.000 células por mililitro. Agregue 400 microlitros de medios que contengan 20.000 células a cada pozo de una placa de cultivo de 24 pozos.Incubar a 37 grados centígrados durante 24 horas. Al día siguiente transducir dos pozos reemplazando el medio de cultivo por 400 microlitros de una mezcla uno a uno de un lentivirus y medio de cultivo fresco complementado con polibrena a una concentración final de cuatro microgramos por mililitro. Para los controles sin virus reemplazar el medio de cultivo con medio de cultivo fresco complementado con polibrena a una concentración final de cuatro microgramos por mililitro.Incubar a 37 grados centígrados durante 15 horas. A continuación, aspirar el medio que contiene lentivirus, y medio de cultivo fresco. Incubar las células a 37 grados centígrados durante 72 horas adicionales.Después de esto, lavar las células en cada pozo dos veces con 0.5 mililitros de PBS. Añadir 300 microlitros de 0.25%trypsin EDTA a las células, e incubar a 37 grados Celsius durante tres minutos. Resuspender las células en dos mililitros de medio de cultivo, y luego placarlas en placas de cultivo de seis pozos con dos microgramos por mililitro de puromicina.Cultivo de las células hasta que todas las células de los pozos de control están muertas, lo que suele tardar aproximadamente una semana. En primer lugar, cultivo por separado LN215-YFP y LN215-células de yoduro en placas de 100 milímetros en medio de cultivo para llegar a las poblaciones requeridas para el ensayo. Un día antes del ensayo, lave cada plato con 10 mililitros de PBS.Tratar cada plato con dos mililitros de 0.25% de solución de trypsin EDTA, e incubar a 37 grados Celsius durante cinco minutos. Resuspender las células en cuatro mililitros de medio de cultivo y transferirlas a tubos cónicos de 15 mililitros. Centrifugar a 1.000 g durante tres minutos para peletizar las células.Deseche el sobrenadante y resusppend cada pellet celular en cinco mililitros de medio de cultivo. Pipetear hacia arriba y hacia abajo unas 20 veces para romper cualquier grupo de células. Usa un hemocitoómetro para contar las células.Y luego diluir las células en medio de cultivo para hacer la suspensión celular en las densidades que se muestran aquí. A continuación, mezcle siete mililitros de cada suspensión celular en un depósito. Utilice una pipeta multicanal para añadir 100 microlitros de esta mezcla a cada pozo de una placa de cultivo de 96 pozos.Incubar a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono durante 24 horas. En primer lugar, utilice un microscopio de fluorescencia con aumento de 20X y un filtro GFP para comprobar las placas de 96 pozos para asegurarse de que no hay grumos de células, y que los cultivos están completamente confluentes y bien distribuidos. Al menos 30 minutos antes del ensayo, encienda un lector de microplacas y establézcalo en 37 grados centígrados.Lave el tubo de un inyector automatizado con tres mililitros de 70%etanol, tres mililitros de agua destilada y tres mililitros de solución I. A continuación, caliente las soluciones C e I a 37 grados Celsius en un baño de agua. Aspirar el medio de crecimiento o invertir la placa para vaciarla.Toque cualquier medio residual. A continuación, añada la solución C a un depósito utilizando una pipeta multicanal para añadir 200 microlitros de solución C a cada pozo de la placa. Aspirar la solución o invertir la placa para vaciarla, por lo que se debe aprovechar cualquier solución residual.Agregue 50 microlitros de solución C a cada pozo. A continuación, agregue un microlitro de un stock químico de 2,5 mililitros o DMSO como vehículo, y agregue otros 50 microlitros de solución C a cada pozo. Incubar las células a 37 grados centígrados en el aire durante aproximadamente 10 minutos.Durante la incubación, comience a establecer los parámetros en el programa de lector de microplacas haciendo clic en el botón Administrar protocolos. Haga clic en el botón Nuevo. Seleccione la Intensidad de fluorescencia en la sección Método de medición y El modo de pozo en la sección Modo de lectura.A continuación, haga clic en el botón Aceptar. Aparecerá una nueva pestaña. En el menú Parámetros básicos, establezca la longitud de onda Excitación en 485 nanómetros y la Emisión en 520 nanómetros.Seleccione la óptica inferior para leer la fluorescencia desde la parte inferior. A continuación, establezca el tiempo de inicio de la medición en cero segundos, el número de intervalos para ser 25, el número de destellos por pozo y el intervalo para ser 20, y el tiempo de intervalo para ser 0,4 segundos. En el menú Diseño, dibuje una región de la placa que se va a leer.En el menú Concentraciones/Volumen/Shacking, configure el lector de microplacas para inyectar 100 microlitros de I-solution a cada pocólite con una velocidad de inyección de 135 microlitros por segundo. En el menú Tiempo de inyección, establezca la hora de inicio de la inyección en un segundo. A continuación, haga clic en el botón Iniciar medición.Una vez completada la incubación, transfiera las placas de 96 pocillos al lector de microplacas e inicie la medición haciendo clic de nuevo en el botón Iniciar medición. En este estudio, el ensayo de comunicación intercelular/unión de proteína fluorescente de yodo-amarillo-brecha se utiliza con células LN215-YFP y LN215-yodo para examinar 2.320 productos químicos para identificar nuevos moduladores de comunicación intracelular de unión de brecha. Se observa que Homosalate inhibe el 50% de la comunicación intracelular de unión de la brecha.Mientras que la terbinafina completamente lo inhibe. Esto confirma la terbinafina como un inhibidor de la unión de la brecha. Este ensayo mide el GJIC entre las células vecinas del donante y del aceptador, por lo que las células donantes y receptoras deben disociarse completamente antes del enchapado.Y la confluencia del cultivo mixto debe ser del 100% para maximizar la formación de las uniones de separación entre las células. Los datos del curso de tiempo, las relaciones de respuesta a la dosis y la evaluación de la reversibilidad de los moduladores de unión de brecha se pueden obtener con el ensayo Iodide-YFP-GJIC. Además, se pueden establecer ensayos específicos de connexina GJIC de yoduro-YFP induciendo la expresión de una connexina de interés en las células desprovistas de uniones de brecha funcional.Esto permite determinar el valor IC50 de un producto químico de un tipo específico de connexina. El ensayo Iodide-YFP-GJIC se puede utilizar para la detección de alto rendimiento, ya que es robusto, repetible y económico. Este ensayo ayuda a encontrar sustancias químicas moduladoras de la unión de brechas para el descubrimiento de fármacos y la evaluación toxicológica.

Research

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