Name: assessing stem cell dna integrity for cardiac cell therapy
Uploaded: 2019-01-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Stem Cell DNA Integrity for Cardiac Cell Therapy at JoVE.com

هذا العمل وأيده في الجزء الوطني للقلب والرئة والدم المعهد المنح RO1-HL-99507, HL-114120، HL-131017، HL138023، و UO1-HL-134764 (على تشانغ جيه)، و "جمعية القلب الأمريكية العلمية التنمية منحة" 17SDG33670677 (إلى ر. كانابان).

1-المذنب بالانزيم
<ol><li>
إعداد كاشف
	<ol>
<li>لنقطة انصهار منخفضة [اغروس]، ضع 500 ملغ من ذوبان منخفضة [اغروس] في 100 مل من الحمض النووي-/المياه خالية من الجيش الملكي النيبالي. حرارة الزجاجة في فرن ميكروويف حتى يذوب [اغروس]. ضع الزجاجة في حمام مائي 37 درجة مئوية إلى حين الحاجة. ملاحظة:</strong...

<ol>
	<li>Bolli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+stem+cells+in+patients+with+ischaemic+cardiomyopathy+(SCIPIO):+initial+results+of+a+randomised+phase+1+trial.">Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial.</a> The Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).</li><li>Makkar, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracoronary+cardiosphere-derived+cells+for+heart+regeneration+after+myocardial+infarction+(CADUCEUS):+a+prospective,+randomised+phase+1+trial.">Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial.</a> The Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).</li><li>Tomita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+neural+crest+cells+contribute+to+the+dormant+multipotent+stem+cell+in+the+mammalian+heart.">Cardiac neural crest cells contribute to the dormant multipotent stem cell in the mammalian heart.</a> Journal of Cell Biology. 170 (7), 1135-1146 (2005).</li><li>Oyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+side+population+cells+have+a+potential+to+migrate+and+differentiate+into+cardiomyocytes+in+vitro+and+in+vivo.">Cardiac side population cells have a potential to migrate and differentiate into cardiomyocytes in vitro and in vivo.</a> Journal of Cell Biology. 176 (3), 329-341 (2007).</li><li>Fischer, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+myocardial+regeneration+through+genetic+engineering+of+cardiac+progenitor+cells+expressing+Pim-1+kinase.">Enhancement of myocardial regeneration through genetic engineering of cardiac progenitor cells expressing Pim-1 kinase.</a> Circulation. 120 (21), 2077-2087 (2009).</li><li>Cottage, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+progenitor+cell+cycling+stimulated+by+pim-1+kinase.">Cardiac progenitor cell cycling stimulated by pim-1 kinase.</a> Circulation Research. 106 (5), 891-901 (2010).</li><li>Angert, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+the+injured+adult+heart+involves+new+myocytes+potentially+derived+from+resident+cardiac+stem+cells.">Repair of the injured adult heart involves new myocytes potentially derived from resident cardiac stem cells.</a> Circulation Research. 108 (10), 1226-1237 (2011).</li><li>Kannappan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+Modulates+the+Fate+of+Cardiac+Progenitor+Cells+Ex+vivo+and+in+the+Diabetic+Heart+In+vivo.">p53 Modulates the Fate of Cardiac Progenitor Cells Ex vivo and in the Diabetic Heart In vivo.</a> EBioMedicine. 16, 224-237 (2017).</li><li>Hatzistergos, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+stimulate+cardiac+stem+cell+proliferation+and+differentiation.">Bone marrow mesenchymal stem cells stimulate cardiac stem cell proliferation and differentiation.</a> Circulation Research. 107 (7), 913-922 (2010).</li><li>Okita, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells:+opportunities+and+challenges.">Induced pluripotent stem cells: opportunities and challenges.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1575), 2198-2207 (2011).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cardiomyocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+repair+in+a+porcine+model+of+acute+myocardial+infarction+with+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiovascular+cells.">Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells.</a> Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+high+engraftment+of+patient-specific+cardiomyocyte+sheet+using+induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+adult+cardiac+fibroblast.">Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast.</a> Circulation: Heart Failure. 8 (1), 156-166 (2015).</li><li>Hirakawa, K., Midorikawa, K., Oikawa, S., Kawanishi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carcinogenic+semicarbazide+induces+sequence-specific+DNA+damage+through+the+generation+of+reactive+oxygen+species+and+the+derived+organic+radicals.">Carcinogenic semicarbazide induces sequence-specific DNA damage through the generation of reactive oxygen species and the derived organic radicals.</a> Mutation Research. 536 (1-2), 91-101 (2003).</li><li>Martinez, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+and+alkylating+damage+in+DNA.">Oxidative and alkylating damage in DNA.</a> Mutation Research. 544 (2-3), 115-127 (2003).</li><li>Valko, M., Rhodes, C. J., Moncol, J., Izakovic, M., Mazur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+radicals,+metals+and+antioxidants+in+oxidative+stress-induced+cancer.">Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer.</a> Chemico-Biological Interactions. 160 (1), 1-40 (2006).</li><li>Wiseman, H., Halliwell, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Damage+to+DNA+by+reactive+oxygen+and+nitrogen+species:+role+in+inflammatory+disease+and+progression+to+cancer.">Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species: role in inflammatory disease and progression to cancer.</a> Biochemical Journal. 313 (Pt 1), 17-29 (1996).</li><li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelectrophoretic+study+of+radiation-induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells.">Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 123 (1), 291-298 (1984).</li><li>Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells.">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.</a> Experimental Cell Research. 175 (1), 184-191 (1988).</li><li>Goichberg, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-associated+defects+in+EphA2+signaling+impair+the+migration+of+human+cardiac+progenitor+cells.">Age-associated defects in EphA2 signaling impair the migration of human cardiac progenitor cells.</a> Circulation. 128 (20), 2211-2223 (2013).</li><li>Kannappan, R., Mattapally, S., Wagle, P. A., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivation+domain+of+p53+regulates+DNA+repair+and+integrity+in+human+iPS+cells.">Transactivation domain of p53 regulates DNA repair and integrity in human iPS cells.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. , (2018).</li><li>Al-Baker, E. A., Oshin, M., Hutchison, C. J., Kill, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+UV-induced+damage+and+repair+in+young+and+senescent+human+dermal+fibroblasts+using+the+comet+assay.">Analysis of UV-induced damage and repair in young and senescent human dermal fibroblasts using the comet assay.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 126 (6-7), 664-672 (2005).</li><li>Azqueta, A., Gutzkow, K. B., Brunborg, G., Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+more+reliable+comet+assay:+optimising+agarose+concentration,+unwinding+time+and+electrophoresis+conditions.">Towards a more reliable comet assay: optimising agarose concentration, unwinding time and electrophoresis conditions.</a> Mutation Research. 724 (1-2), 41-45 (2011).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7 (10), R100 (2006).</li><li>Paradis, A. N., Gay, M. S., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binucleation+of+cardiomyocytes:+the+transition+from+a+proliferative+to+a+terminally+differentiated+state.">Binucleation of cardiomyocytes: the transition from a proliferative to a terminally differentiated state.</a> Drug Discovery Today. 19 (5), 602-609 (2014).</li></ol>

سلامة الحمض النووي يصور سلامة الخلية. الخلايا التي تحتوي على الحمض النووي تضررت كثيرا في الإجهاد وتفقد سلامتها في نهاية المطاف. سلامة الجذعية والخلايا المشتقة من الخلايا الجذعية التي تنتشر غرض الزرع الرئيسي للخلايا لأداء وظيفتها المطلوبة. زرع خلايا بتلف الحمض النووي سيؤدي في معدل انجراف...

وتبين الأدلة التجريبية والسريرية أن زرع الخلايا يمكن معتدلة لتحسين أداء البطين الأيسر الهوس من فشله في قلوب1،2،،من34،5 ،،من67،،من89. التطورات الأخيرة قد فتحت زيادة جاذبية الفرص لإنعاش القلب والأوعية الدموية؛ وتشمل هذه التعبير القسري من عوامل إعادة برمجة خلايا جسدية للحث على بلوريبوتينسي وتفرق هذه الخلايا الجذعية المستحثة pluripotent (التوجيهية) في الأنساب القلب مختلفة، ومن المهم كارديوميوسيتي (سم)10، 11 , 12 , 13-المواد الوراثية في كل خلية، بما في ذلك إيبسكس الذي تم إنشاؤه اصطناعياً والمستمدة من اللجنة التوجيهية سم (iPS-سم)، هو الحمض النووي. ويملي التعليمات الوراثية المخزنة في الحمض النووي النمو والتنمية، ووظيفة الخلايا والأنسجة، وأجهزة، والكائنات الحية. الحمض النووي ليست خاملة؛ خلية الأيض، مثل الأكسجين التفاعلية والكربونيل، والأنواع النيتروجين، و alkylating وكلاء يمكن أن الحمض النووي يسبب الضرر في المختبر والمجراه في14،15،،من1617. الأهم من ذلك، يحدث تلف الحمض النووي بداهة في كل خلية، بتواتر كبير. إذا لم يتم تصحيح هذه الأضرار، فإنه سيؤدي إلى طفرة الحمض النووي، والشيخوخة الخلوية، وفقدان سلامة الحمض النووي، والخلية، وربما، من الأمراض، بما في ذلك السرطان تهدد الحياة. لذلك، الإبقاء على سلامة الحمض النووي ضروري لأي خلية، وبخاصة إيبسكس، التي تتمتع بإمكانات هائلة في العيادة.
لتقييم كمية والسلامة لعزل الحمض النووي، تتوفر معدات باهظة الثمن في السوق. ومع ذلك، هناك أية أساليب بسيطة وفعالة من حيث التكلفة لتقييم سلامة الحمض النووي في الخلايا دون عزل الخلايا. وعلاوة على ذلك، تدهور الحمض النووي الناجم عن المستخدم أثناء عزل الحمض النووي أحد العوائق الرئيسية في استخدام هذه الأساليب. هلام خلية واحدة التفريد (المعروفة بمقايسة المذنب)18،19 و γH2A.X إيمونولابيلينج8 التقنيات هي النهج الأساسية في مختبرات البحوث لتقييم الأضرار في الحمض النووي. هذان الأسلوبان لا تتطلب معدات باهظة الثمن أو عزل الحمض النووي لتحليل الحمض النووي سلامة8،،من2021. منذ ذلك الحين، تم إجراء هذه التقنيات مع خلايا كاملة؛ الحمض النووي/رنا/البروتين تدهور المستحثة بالمستخدم أثناء إعداد عينة لن يؤثر على هذه البروتوكولات. هنا، لتقييم أضرار الحمض النووي والحمض النووي الضرر ردا في الساق والخلايا المشتقة من الخلايا الجذعية، ونحن نقدم البروتوكولات خطوة بخطوة لتنفيذ كلا المذنب المقايسة و γH2A.X إيمونولابيلينج. وعلاوة على ذلك، الجمع بين هذين النهجين، نقترح إجراء تقييم السذاجة التي يمكن استخدامها لتقييم مدى ملاءمتها للخلية لزرع الأعضاء.
مقايسة المذنب، أو خلية واحدة جل التفريد، تدابير فواصل الحمض النووي في الخلايا. يتم تفكيك الخلايا المضمنة في [اغروس] انصهار منخفضة بشكل نوكليويدس التي تحتوي على الحمض النووي سوبيركويليد. عند التفريد، ترحيل قطع صغيرة من الحمض النووي مجزأة وقطع خيوط الحمض النووي عن طريق المسام [اغروس]، حين دنا سليمة، بسبب حجمها الهائل بالاقتران مع البروتين المصفوفة، سيكون هجرة مقيدة. يحاكي نمط الحمض النووي الملون تحت مجهر fluorescence مذنب. رأس المذنب يحتوي على الحمض النووي سليمة وهو يتألف من أجزاء الذيل وكسر خيوط الحمض النووي. ويمكن قياس جزء صغير أضرار الحمض النووي بشدة الأسفار من تلف الحمض النووي (ذيل المذنب) بالنسبة إلى كثافة الحمض النووي (رأس المذنب) سليمة. يمكن حساب هذه اللحظة ذيل معلمة كما هو مبين في الشكل 1.
أضرار الحمض النووي يؤدي إلى الفسفرة هستون H2A. X (γH2A.X) في Ser139 التي مؤنزم ATM و ATR الحمض النووي-PK. الفسفرة وتجنيد H2A. X في فواصل حبلا الحمض النووي يسمى استجابة تلف الحمض النووي (DDR) ويحدث سريعاً بعد أن تلف الحمض النووي. وفي أعقاب هذه العملية، والقبض على نقطة تفتيش بوساطة دورة الخلية والحمض النووي هي بدأت عمليات إصلاح. بعد الانتهاء الناجح لإصلاح الحمض النووي، ديفوسفوريلاتيد γH2A.X وإبطال من فوسفاتاسيس. لفترات طويلة ومتعددة فواصل حبلا الحمض النووي يؤدي إلى تراكم البؤر γH2A.X في الحمض النووي. وهذا يشير إلى عدم التمكن من إصلاح أضرار الحمض النووي وسلامة الحمض النووي للخلية. يمكن تحديد هذه البؤر γH2A.X في الحمض النووي، ويمكن حساب عدد البؤر التسريح وإعادة الإدماج باستخدام البروتوكول في الباب 2.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slide</td>
			<td>Millicell</td>
			<td>PEZGS0816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td>Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure 
			Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson Immuno 
			Research Laboratories</td>
			<td>711-545-152 
			(RRID: AB_2313584)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson Immuno 
			Research Laboratories</td>
			<td>711-165-152 
			(RRID:AB_2307443)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco B-27 Supplement, Serum Free,</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel growth factor reduced</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhalloidinA488</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2577 (RRID: AB_2118010)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR&#160;Green I nucleic acid gel stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Low melting Point Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Antifade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing stem cell dna integrity for cardiac cell therapy

الجذعية والخلايا المشتقة من الخلايا الجذعية لديها إمكانات هائلة كعلاج التجديدي لمختلف الأمراض التنكسية. الحمض النووي هو مستودع البيانات الوراثية في كافة الخلايا، بما في ذلك الخلايا الجذعية، وسلامتها أمر أساسي لقدرتها على التجدد. الخلايا الجذعية البالغة الخضوع للنشر السريع في مختبرات لتحقيق الأرقام اللازمة للزرع. نمو الخلايا السريع يؤدي إلى فقدان سلامة الحمض النووي والايضات المتراكمة، مثل الأكسجين التفاعلية والكربونيل alkylating وكلاء. زرع هذه الخلايا سيسفر engraftment الفقيرة وتجديد الجهاز المتدهورة. وعلاوة على ذلك، زرع الخلايا التالفة الحمض النووي يؤدي إلى طفرات، عدم الاستقرار الحمض النووي، والشيخوخة الخلوية، وربما تهدد الحياة من الأمراض مثل السرطان. ولذلك، هناك حاجة ملحة لأسلوب مراقبة الجودة لتقييم مدى ملاءمتها للخلية لزرع الأعضاء. هنا، نحن نقدم البروتوكولات خطوة بخطوة لتقييم سلامة الحمض النووي للخلايا الجذعية قبل زرع الخلايا.

تم استزراع الخلايا الجذعية البشرية المستحثة pluripotent، وتلف الحمض النووي ولحظة الذيل، التي كانت تستخدم كمقياس لسلامة الحمض النووي، حللت بمقايسة المذنب. كانت جزءا لا يتجزأ من نقطة انصهار منخفضة [اغروس] خلايا iPS ووضعها على شريحة زجاجية. وعولج الخلايا، ثم، مع تحلل المخزن المؤق...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Stem Cell DNA Integrity for Cardiac Cell Therapy at JoVE.com

Assessing Stem Cell DNA Integrity for Cardiac Cell Therapy

تقييم سلامة الحمض النووي الخلايا الجذعية للعلاج بخلايا القلب

هنا، نحن نقدم وصفاً مفصلاً للإعداد التجريبية لإجراء تحليل لتقييم سلامة الحمض النووي في الخلايا الجذعية قبل زرع الخلايا.

Stem and stem-cell-derived cells have immense potential as a regenerative therapy for various degenerative diseases. DNA is the storehouse of genetic data ...

بالنسبة لأمراض حديثي الولادة مثل اعتلال عضلة القلب، فإن العلاج التجديدي باستخدام الخلايا المشتقة من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات المستحثة له إمكانات هائلة. ومع ذلك، في المختبر تسارع نمو الخلايا يؤدي إلى تلف الحمض النووي من قبل الأيض المتراكمة مثل أنواع الأكسجين التفاعلي. زرع هذه الخلايا التالفة الحمض النووي من شأنه أن يؤدي إلى ضعف الغرة وتجديد العضو.قبل الزرع، ينبغي تقييم نوعية الخلايا. هنا نقدم بروتوكولين خطوة بخطوة لتقييم تلف الحمض النووي في الخلايا الجذعية. ومن خلال عرض الإجراءات، ستكون جيسيكا ميلر، الباحثة، ونيخيل ماردهيكار، الباحث، وفاشانثي راجاسيكران، وهو فني مختبر.للبدء، ضع 500 ملليغرام من الأذانروز منخفض الذوبان في 100 ملليلتر من المياه الخالية من الحمض النووي الريبي النووي الريبي. سخني الزجاجة في فرن ميكروويف حتى يذوب الأاغروز. ثم ضع الزجاجة في حمام مائي 37 درجة مئوية حتى الحاجة.لإعداد شرائح المذنب المغلفة مسبقًا ، ضع بضع قطرات من 0.5٪ agarose على شريحة زجاجية. انتشرت على الفور agarose لتشكيل طبقة رقيقة من طلاء agarose باستخدام غطاء. العمل في ظروف الإضاءة المنخفضة لتجنب تلف الخلايا الناجم عن الأشعة فوق البنفسجية، وخلط 10 ميكرولترات من تعليق الخلية و 90 ميكرولترات من محلول agarose في أنبوب.ضع الأنبوب في حمام مائي 37 درجة مئوية لمنع الأاغروز من التجمد. اخلط الحل دون إدخال فقاعات الهواء، والماصات 70 ميكرولترات لكل بقعة على شريحة المذنب المطلية مسبقًا. باستخدام طرف ماصة، انتشار خليط agarose الخلية لتشكيل طبقة رقيقة.ضع الشريحة عند أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. في وعاء ، غمر تماما الشريحة في عازلة التحلل البارد. ضع الحاوية في الظلام عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة.استبدال العازلة تحلل مع محلول قلوي الباردة. تأكد من أن الشرائح مغمورة بالكامل. بعد ترك الحاوية في الظلام عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة أخرى ، ضع الشريحة في خزان كهربائي أفقي.املأ الخزان بمخزن كهرباء قلوي بارد حتى تغمر الشرائح تمامًا. تطبيق الجهد في فولت واحد لكل سنتيمتر لمدة 15 إلى 30 دقيقة. في وعاء، غمر تماما الشريحة في المياه الباردة ديونيد.بعد دقيقتين، إزالة المياه ديونيد وإضافة المياه الأيونية العذبة، ثم كرر هذه الخطوة مرة ثانية. بعد ذلك، استبدل الماء الأيوني بالماء البارد بنسبة 70٪ الإيثانول. بعد خمس دقائق، قم بإزالة الشريحة بلطف دون إمالةها واتركها جافة.مرة واحدة المجففة، إضافة 100 ميكرولترات من صبغة الحمض النووي المخفف إلى كل بقعة، وانتظر 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. باستخدام مرشح FITC في مجهر epifluorescence، التقاط صور من 50 إلى 100 المذنبات في المجموع لكل عينة. الخلايا القلبية المشتقة من iPS الموروثة كما هو موضح في بروتوكول النص.لرؤية خلايا القلب المشتقة من iPS في شرائح الغرفة ، تخلص أولاً من وسيط الثقافة من الآبار ، وغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS. إضافة ملليلتر واحد من 0.25٪ التربسين في البئر، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. تحقق من اللوحة تحت المجهر فصاخل الخلية.ثم إضافة ملليلتر واحد من CMM لوقف تريبسين. وضع تعليق الخلية في أنبوب 15 ملليلتر والطرد المركزي لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية و 200 مرة ز. تجاهل المتوسطة، وإضافة ملليلتر واحد من CMM، وإعادة ضغط الخلايا.عد الخلايا وضبط عدد الخلايا للحصول على مليوني خلية في 1.6 ملليلتر من CMM. بذور الآن 200 ميكرولترات من تعليق الخلية في بئر من شريحة غرفة ثمانية بئر. اضغط على الشريحة بلطف لنشر الخلايا حول البئر.احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية. لعلاج دوكسيروبايسين المستمدة من iPS، تخلص من الوسيلة الثقافية من آبار القلب والوثنيين المشتقة من iPS، وغسل الخلايا بـ PBS. علاج الخلايا مع دوكسوروبيسين ميكرومولار واحد لمدة أربع ساعات في 37 درجة مئوية.التعرق المتوسطة، وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني. لأداء مناعي، وغسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني وإضافة 200 ميكرولترات من الطازجة المعدة 4٪ شبهformaldehyde إلى كل بئر. إصلاح الخلايا لمدة 20 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة.بعد غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني، إضافة 200 ميكرولترات من العازلة سد في البئر، وكتلة لمدة 30 دقيقة في غرفة مرطب في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة المخزن المؤقت للحظر وإضافة 200 ميكرولترات من محلول الأجسام المضادة الأساسي. بعد احتضان لمدة 45 دقيقة في غرفة مرطبة داكنة في درجة حرارة الغرفة ، اغسل الآبار ثلاث مرات باستخدام PBS.إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 200 ميكرولترات من مزيج الأجسام المضادة الثانوية. احتضان لمدة 45 دقيقة في غرفة مرطبة داكنة في درجة حرارة الغرفة. ثم غسل الآبار ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.غسل مع المياه ديونيد قبل تركيب الشرائح مع antifade. ضع غطاء زجاجي، واخزن الشرائح في الظلام عند أربع درجات مئوية. باستخدام المجهر confocal، واتخاذ ثلاث إلى خمس صور من الحقول العشوائية لكل عينة والمضي قدما في تحليل الصور.لحساب استجابة الضرر DNA بؤرة، تحميل وتثبيت CellProfiler. حدد ملف واستيراد وخط أنابيب من الملف واختر ملف خط أنابيب يسمى puncti غاما H2AX. سحب وإسقاط المجلد الذي يحتوي على الصور المكتسبة من غاما-H2AX foci إلى إطار قائمة الملفات في قسم الصور وحدات الإدخال لتحليلها.ثم اتبع الإرشادات كما هو موضح في بروتوكول النص. لتعيين معلمات الصور، اسحب الصورة المطلوبة للتحليل إلى قائمة الملفات. ضمن وحدات الإدخال، حدد الصور.أيضاً في وحدات الإدخال، حدد بيانات التعريف، ثم حدد الأسماء والأنواع. بالنسبة للمجموعات، حدد لا. العمل في وحدات التحليل، حدد اللون إلى الرمادي.ثم حدد السلس، حدد تحديد الكائنات الأساسية، ومرة أخرى حدد السلس. حدد التالي تحسين أو إيقاف الميزات، ثم حدد تحديد الكائنات الأساسية. لا يزال يعمل في وحدات التحليل، حدد ربط الكائنات، ثم تصنيف الكائنات، وأخيراً حدد التصدير إلى جدول البيانات.انقر على تحليل الصور في اللوحة السفلية اليمنى لإجراء تحليل الصورة. وعند الانتهاء من التحليل بنجاح، يتم إنشاء عدة صور. لاحظ ملف CSV الذي تم إنشاؤه وحفظه في الموقع المناسب على الكمبيوتر.يحتوي هذا الملف على البيانات الكمية لمزيد من التحليل. في جدول البيانات يسمى صورة تجربتي ، والعمود باء سيكون عدد النوى التي تصل إلى خمسة puncti ، والعمود دال سيكون عدد النوى التي لديها أكثر من خمسة puncti. إضافة الأعمدة B و D للحصول على العدد الإجمالي للنيات.كرر هذه الخطوات لكافة الصور، وتغيير اسم ملف التجربة قبل كل تحليل. تظهر هنا صور ميكروجراف تمثيلية للمذنبات من خلايا iPS المعالجة بالدوكسو وغير المعالجة. تم العثور على كمية القاعدية من تلف الحمض النووي في خلايا iPS ، التي تم التعبير عنها كجزء صغير من تلف الحمض النووي ولحظة الذيل.ومع ذلك، زاد علاج دوكسو من تلف الحمض النووي في خلايا iPS كما هو متوقع، مما يشير إلى أنه يمكن استخدام مقايسة المذنب لتقييم سلامة الحمض النووي في الخلايا الجذعية متعددة القدرات. تظهر هنا ميكروجراف تمثيلية من مناعة غاما-H2AX، عند التكبير الأقل وفي التكبير الأعلى. في التحكم iPS المشتقة من cardiomyocytes، أكثر من 90٪ من الخلايا كان أقل من خمسة DDR foci لكل نواة.وكان ما مجموعه أقل من 10٪ من الخلايا أكثر من ستة DDR foci لكل نواة. بالنسبة لـ iPS المستمدة من القلب وتربية لمدة ستة أشهر، كان أقل من 90٪ من الخلايا تصل إلى خمسة DDR foci لكل نويات، وما مجموعه أكثر من 13٪ من الخلايا كان أكثر من ستة DDR بؤر لكل نوى. في حين أن في doxo-iPS المستمدة من القلب، وأقل من 80٪ من الخلايا كان ما يصل إلى خمسة DDR foci لكل نواة.وكان ما مجموعه حوالي 24٪ من الخلايا أكثر من ستة بؤر DDR لكل نوى. وتشير هذه البيانات إلى أن فترة طويلة من iPS المشتقة من القلب وزراعة الخلايا والعلاج doxo تسبب ضررا كبيرا الحمض النووي، مما يجعلها غير صالحة لزرع الخلايا. من المهم جدا تجنب المتغيرات أثناء خلط تعليق الخلية، لأن هذا قد يؤثر على الكهرباء.بعد هذا الإجراء، يمكنك إجراء المقايسات المذنب وإجراءات مناعة مع الخلايا من أنواع مختلفة. وستتيح هذه التقنيات تقييم الخلايا من مختلف الأنواع لتلف الحمض النووي قبل استخدامها في دراسات زرع الخلايا.

Research

JoVE Journal

Genetics

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

هندسة العوامل الاصطناعي للتلاعب على وجه التحديد الربط البديل في الخلايا البشرية

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

رسم الخرائط التفاعلات رنا-رنا على الصعيد العالمي باستخدام السورالين البيروكسيديز

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

باستخدام تقنية PCR-نيون الشعرية جل الكهربائي إلى التركيب الوراثي كريسبر / Cas9 بوساطة خروج المغلوب المسوخ في تنسيق عالية الإنتاجية

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

بروتوكول عالمي جرنة على نطاق واسع "الإنتاج مكتبة" من أي "مصدر الحمض النووي"

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

كشف شبه كمي النشاط المعتمدة على الحمض النووي الريبي بوليميراز الحمض النووي الريبي للبروتين البشري Telomerase المنتسخة العكسية

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

التنميط الحمض النووي توقيت النسخ المتماثل باستخدام الزرد كنظام نموذجي في فيفو

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

تعطيل الجينات ذات كفاءة عالية من الخلايا السلف مورين والبشرية المكونة للدم قبل كريسبر/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

اتباع نهج خلية واحدة اندماجي لتوصيف الجزيئية والتغاير إيمونوفينوتيبيك الجذعية البشرية والسكان السلف

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

عزل وتوصيف والمستندة إلى MicroRNA التحوير الوراثي للخلايا الجذعية البشرية جريب طب الأسنان

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...