Name: assessing stem cell dna integrity for cardiac cell therapy
Uploaded: 2019-01-25T14:00:00
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这项工作得到了国家心脏组织的部分支持, 肺和血液研究所授予 ro1-hl-999507、hl-114120、hl-131017、hl138023 和 uo1-hl-134764 (致 j. zhang) 和美国心脏协会科学发展赠款 17sdg33670677 (至 r. kannappan)。

1. 彗星检测
<ol><li>
试剂制备
	<ol>
<li>对于低熔点琼脂糖, 将500毫克的低熔融琼脂糖放入100毫升的 dna-/rna 无水中。在微波炉中加热瓶子, 直到琼脂糖溶解。将瓶子放在37°c 的水浴中, 直到需要为止。 请注意:关于进一步的阅读, 见 azqueta 等人, 他研究了琼脂糖浓度对 dna 展开时间的影响和几个电泳因素23。</li>
		<li>在 tris-edta (te) 缓冲液中稀释 sybr 绿色 dna ?...

<ol>
	<li>Bolli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+stem+cells+in+patients+with+ischaemic+cardiomyopathy+(SCIPIO):+initial+results+of+a+randomised+phase+1+trial.">Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial.</a> The Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).</li><li>Makkar, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracoronary+cardiosphere-derived+cells+for+heart+regeneration+after+myocardial+infarction+(CADUCEUS):+a+prospective,+randomised+phase+1+trial.">Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial.</a> The Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).</li><li>Tomita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+neural+crest+cells+contribute+to+the+dormant+multipotent+stem+cell+in+the+mammalian+heart.">Cardiac neural crest cells contribute to the dormant multipotent stem cell in the mammalian heart.</a> Journal of Cell Biology. 170 (7), 1135-1146 (2005).</li><li>Oyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+side+population+cells+have+a+potential+to+migrate+and+differentiate+into+cardiomyocytes+in+vitro+and+in+vivo.">Cardiac side population cells have a potential to migrate and differentiate into cardiomyocytes in vitro and in vivo.</a> Journal of Cell Biology. 176 (3), 329-341 (2007).</li><li>Fischer, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+myocardial+regeneration+through+genetic+engineering+of+cardiac+progenitor+cells+expressing+Pim-1+kinase.">Enhancement of myocardial regeneration through genetic engineering of cardiac progenitor cells expressing Pim-1 kinase.</a> Circulation. 120 (21), 2077-2087 (2009).</li><li>Cottage, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+progenitor+cell+cycling+stimulated+by+pim-1+kinase.">Cardiac progenitor cell cycling stimulated by pim-1 kinase.</a> Circulation Research. 106 (5), 891-901 (2010).</li><li>Angert, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+the+injured+adult+heart+involves+new+myocytes+potentially+derived+from+resident+cardiac+stem+cells.">Repair of the injured adult heart involves new myocytes potentially derived from resident cardiac stem cells.</a> Circulation Research. 108 (10), 1226-1237 (2011).</li><li>Kannappan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+Modulates+the+Fate+of+Cardiac+Progenitor+Cells+Ex+vivo+and+in+the+Diabetic+Heart+In+vivo.">p53 Modulates the Fate of Cardiac Progenitor Cells Ex vivo and in the Diabetic Heart In vivo.</a> EBioMedicine. 16, 224-237 (2017).</li><li>Hatzistergos, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+stimulate+cardiac+stem+cell+proliferation+and+differentiation.">Bone marrow mesenchymal stem cells stimulate cardiac stem cell proliferation and differentiation.</a> Circulation Research. 107 (7), 913-922 (2010).</li><li>Okita, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells:+opportunities+and+challenges.">Induced pluripotent stem cells: opportunities and challenges.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1575), 2198-2207 (2011).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cardiomyocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+repair+in+a+porcine+model+of+acute+myocardial+infarction+with+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiovascular+cells.">Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells.</a> Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+high+engraftment+of+patient-specific+cardiomyocyte+sheet+using+induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+adult+cardiac+fibroblast.">Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast.</a> Circulation: Heart Failure. 8 (1), 156-166 (2015).</li><li>Hirakawa, K., Midorikawa, K., Oikawa, S., Kawanishi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carcinogenic+semicarbazide+induces+sequence-specific+DNA+damage+through+the+generation+of+reactive+oxygen+species+and+the+derived+organic+radicals.">Carcinogenic semicarbazide induces sequence-specific DNA damage through the generation of reactive oxygen species and the derived organic radicals.</a> Mutation Research. 536 (1-2), 91-101 (2003).</li><li>Martinez, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+and+alkylating+damage+in+DNA.">Oxidative and alkylating damage in DNA.</a> Mutation Research. 544 (2-3), 115-127 (2003).</li><li>Valko, M., Rhodes, C. J., Moncol, J., Izakovic, M., Mazur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+radicals,+metals+and+antioxidants+in+oxidative+stress-induced+cancer.">Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer.</a> Chemico-Biological Interactions. 160 (1), 1-40 (2006).</li><li>Wiseman, H., Halliwell, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Damage+to+DNA+by+reactive+oxygen+and+nitrogen+species:+role+in+inflammatory+disease+and+progression+to+cancer.">Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species: role in inflammatory disease and progression to cancer.</a> Biochemical Journal. 313 (Pt 1), 17-29 (1996).</li><li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelectrophoretic+study+of+radiation-induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells.">Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 123 (1), 291-298 (1984).</li><li>Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells.">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.</a> Experimental Cell Research. 175 (1), 184-191 (1988).</li><li>Goichberg, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-associated+defects+in+EphA2+signaling+impair+the+migration+of+human+cardiac+progenitor+cells.">Age-associated defects in EphA2 signaling impair the migration of human cardiac progenitor cells.</a> Circulation. 128 (20), 2211-2223 (2013).</li><li>Kannappan, R., Mattapally, S., Wagle, P. A., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivation+domain+of+p53+regulates+DNA+repair+and+integrity+in+human+iPS+cells.">Transactivation domain of p53 regulates DNA repair and integrity in human iPS cells.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. , (2018).</li><li>Al-Baker, E. A., Oshin, M., Hutchison, C. J., Kill, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+UV-induced+damage+and+repair+in+young+and+senescent+human+dermal+fibroblasts+using+the+comet+assay.">Analysis of UV-induced damage and repair in young and senescent human dermal fibroblasts using the comet assay.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 126 (6-7), 664-672 (2005).</li><li>Azqueta, A., Gutzkow, K. B., Brunborg, G., Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+more+reliable+comet+assay:+optimising+agarose+concentration,+unwinding+time+and+electrophoresis+conditions.">Towards a more reliable comet assay: optimising agarose concentration, unwinding time and electrophoresis conditions.</a> Mutation Research. 724 (1-2), 41-45 (2011).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7 (10), R100 (2006).</li><li>Paradis, A. N., Gay, M. S., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binucleation+of+cardiomyocytes:+the+transition+from+a+proliferative+to+a+terminally+differentiated+state.">Binucleation of cardiomyocytes: the transition from a proliferative to a terminally differentiated state.</a> Drug Discovery Today. 19 (5), 602-609 (2014).</li></ol>

dna 完整性描绘了细胞的完整性。dna 受损的细胞经常处于压力状态, 最终失去完整性。为移植目的而繁殖的干细胞和干细胞的完整性是细胞履行其所需功能的主要原因。移植 dna 受损的细胞会导致8,20细胞的移植率和性能较差。因此, 在细胞移植前检查 dna 完整性是一种必要的质量控制方案。在这里, 我们描述了两种具有成本效益的方法, 即彗星检测和γh2a. x...

实验和临床证据表明, 细胞移植能适度改善衰竭心脏1、2、3、4、5的左心室收缩性能 ,6,7,8,9。最近的进展为心血管再生提供了进一步的吸引人的机会;这些包括在体细胞中强制表达重编程因子, 以诱导多能性, 并将这些诱导的多能干细胞 (ipsc)分化为不同的心脏谱系, 重要的是心肌细胞 (cm)10,11,12,13. 每个细胞的遗传物质, 包括人工生成的 ipscs 和 ipsc 衍生 cm (ips-cm), 都是 dna。存储在 dna 中的基因指令决定了细胞、组织、器官和生物的生长、发育和功能。dna 不是惰性的;细胞代谢物, 如活性氧、碳基和氮以及烷基化剂, 可在体外和体内造成dna 损伤 14、15、16、17。重要的是, dna 损伤直观地发生在每个细胞中, 频率很高。如果这些损害得不到纠正, 将导致 dna 突变、细胞衰老、dna 和细胞完整性的丧失, 以及可能的疾病, 包括危及生命的癌症。因此, 保留 dna 完整性对于任何在临床中具有巨大潜力的细胞, 尤其是 ipsc 来说都是必不可少的。
为了评估分离基因组 dna 的数量和完整性, 市场上有昂贵的设备。然而, 没有简单和具有成本效益的方法来评估 dna 完整性的细胞, 而不分离细胞。此外, 用户在 dna 分离过程中诱导的 dna 降解是使用这些方法的主要缺点之一。单细胞凝胶电泳 (称为彗星检测)18,19和γh2a. x 免疫标记8技术是评估 dna 损伤的研究实验室的基本方法。这两种方法不需要昂贵的设备或分离的基因组 dna 来分析 dna 完整性8,20,21。自那时以来, 这些技术已经执行了整个细胞;用户诱导的 dna只能在样品制备过程中降解 dnaa/rna 蛋白不会影响这些协议。在这里, 为了评估干细胞和干细胞中的 dna 损伤和 dna 损伤反应, 我们提供了一步一步的协议来执行彗星分析和γh2a. x 免疫标记。此外, 结合这两种方法, 我们提出了一个天真的评估, 可用于评估细胞是否适合移植。
彗星检测, 或单细胞凝胶电泳, 测量细胞中的 dna 断裂。对低熔融琼脂糖中的细胞进行裂解, 形成含有超盘绕 dna 的核。电泳后, 小块破碎的 dna 和破碎的 dna 链通过琼脂糖毛孔迁移, 而完整的 dna, 由于它们的巨大大小和它们与基质蛋白的结合, 将有一个受限制的迁移。荧光显微镜下染色 dna 的图案模仿彗星。彗星头包含完整的 dna, 尾巴由片段和破碎的 dna 链组成。dna 损伤的分数可以通过受损 dna (彗星尾部) 相对于完整的 dna (彗星头) 强度的荧光强度来测量。参数尾矩可以计算, 如图 1所示。
dna 损伤诱导组蛋白 h2a 的磷酸化。x (γh2a. x) 在 ser139 通过 atm、atr 和 dna-pk 激酶。h2a 的磷酸化和招募。x 在 dna 链断裂被称为 dna 损伤反应 (ddr), 并在 dna 损伤后迅速发生。在这一过程之后, 开始了检查点介导的细胞周期抑制和 dna 修复过程。成功完成 dna 修复后, γh2a. x 被磷酸化并通过磷酸酶灭活。长的多个 dna 链断裂导致在 dna 中积累γh2a. x 病灶。这表明细胞无法修复 dna 损伤和 dna 完整性的丧失。dna 中的这些γh2a. x 病灶可以通过第2部分中的协议进行识别, 并可以使用第2节中的协议计算 ddr 病灶的数量。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slide</td>
			<td>Millicell</td>
			<td>PEZGS0816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td>Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure 
			Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson Immuno 
			Research Laboratories</td>
			<td>711-545-152 
			(RRID: AB_2313584)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson Immuno 
			Research Laboratories</td>
			<td>711-165-152 
			(RRID:AB_2307443)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco B-27 Supplement, Serum Free,</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel growth factor reduced</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhalloidinA488</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2577 (RRID: AB_2118010)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR&#160;Green I nucleic acid gel stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Low melting Point Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Antifade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing stem cell dna integrity for cardiac cell therapy

干细胞和干细胞衍生细胞作为各种退行性疾病的再生治疗具有巨大的潜力。dna 是包括干细胞在内的所有细胞中基因数据的仓库, 其完整性是其再生能力的基础。干细胞在实验室中迅速繁殖, 以获得移植所需的数量。加速细胞生长会导致积累的代谢物 (如活性氧、碳基和烷基化剂) 失去 dna 完整性。移植这些细胞会导致移植不良和器官再生恶化。此外, 移植 dna 受损的细胞会导致突变、dna 不稳定、细胞衰老, 并可能导致癌症等危及生命的疾病。因此, 迫切需要一种质量控制方法来评估细胞是否适合移植。在这里, 我们提供了评估干细胞在细胞移植之前 dna 完整性的分步协议。

对人体诱导多能干细胞进行了培养, 并对 dna 损伤和尾矩进行了分析, 并对其 dna 损伤和尾矩进行了分析。ips 细胞被嵌入低熔点琼脂糖中, 放置在玻璃滑梯上。然后, 用裂解缓冲液对这些细胞进行处理, 然后用碱性溶液进行治疗, 以获得超盘绕的 dna。用 dna 染料对成核进行了电泳, 并对彗星进行了可视化 (图 11-d)。然后, 利用彗星分析插件 (<str...

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Assessing Stem Cell DNA Integrity for Cardiac Cell Therapy

心脏细胞治疗中干细胞 dna 完整性的评估

在这里, 我们提供了一个实验设置的详细描述, 用于分析细胞移植前干细胞 dna 完整性的评估。

Stem and stem-cell-derived cells have immense potential as a regenerative therapy for various degenerative diseases. DNA is the storehouse of genetic data ...

对于心肌病等新生儿疾病，使用诱导多能干细胞衍生细胞的再生疗法具有巨大的潜力。然而，体外加速细胞生长导致累积代谢物（如活性氧物种）的DNA损伤。移植这些DNA受损的细胞会导致器官的移植和再生不良。移植前，应评估细胞的质量。在这里，我们提供两个分步协议来评估干细胞中的DNA损伤。展示这些程序的将是研究员杰西卡·米勒、研究员尼基尔·马德卡尔和实验室技术员瓦桑蒂·拉贾塞卡兰。首先，将500毫克低熔化的阿加罗斯放在100毫升的DNA-RNA自由水中。在微波炉中加热瓶子，直到气糖溶解。然后，将瓶子放在一个37摄氏度的水浴，直到需要。要准备预涂覆的彗星幻灯片，请将几滴0.5%的加糖放在玻璃滑梯上。立即使用盖玻片将红糖铺开，形成一层薄薄的红糖涂层。在低光条件下工作，避免紫外线引起的细胞损伤，在管中混合10微升细胞悬浮液和90微升的阿加罗斯溶液。将管子放在37摄氏度的水浴中，以防止加糖凝固。混合溶液，不引入气泡，将移液器每个点 70 微升混合到预涂层彗星幻灯片上。使用移液器尖端，将细胞气糖混合物扩散形成薄层。将幻灯片在摄氏四度下放置 15 分钟。在容器中，将幻灯片完全淹没在冷解液缓冲液中。将容器在四摄氏度的黑暗中放置一小时。用冷碱性溶液更换解液。确保幻灯片完全淹没。将容器在黑暗中 4 摄氏度下再放置 30 分钟后，将幻灯片放在水平电泳罐中。向油箱加注冷碱性电泳缓冲液，直到滑梯完全淹没。以每厘米一伏的速度施加电压 15 至 30 分钟。在容器中，将滑梯完全淹没在冰冷的去水中。两分钟后，去除去水并加入新鲜的去维化水，然后再次重复此步骤。接下来，用冷70%乙醇代替去化水。五分钟后，轻轻取下幻灯片，不倾斜，让其干燥。干燥后，将100微升稀释DNA染料添加到每个点，并在室温下等待15分钟。在荧光显微镜中使用 FITC 过滤器，拍摄每个样本总共 50 到 100 颗彗星的图像。培养 iPS 衍生的心肌细胞，如文本协议所述。要在腔室幻灯片中查看 iPS 衍生的心肌细胞，请先从孔中丢弃培养基，然后用 PBS 清洗细胞三次。每井加入1毫升0.25%的三辛，并在37摄氏度下孵育5分钟。在显微镜下检查板细胞分离。然后添加一毫升的 CMM 以停止三辛。将电池悬浮液放在15毫升管中，在4摄氏度和200倍g下离心5分钟。丢弃介质，加入一毫升的 CMM，然后重新暂停细胞。计算细胞并调整细胞计数，在1.6毫升CMM中获取200万个细胞。现在种子200微升细胞悬浮液每井的八井室滑动。轻轻点击幻灯片，将细胞铺在井周围。在37摄氏度下孵育细胞。对于 iPS 衍生的心肌细胞多索鲁比辛治疗，丢弃 iPS 衍生心肌细胞孔中的培养基，用 PBS 清洗细胞。在37摄氏度下用一微摩尔多索鲁比辛治疗细胞4小时。吸气介质，用PBS清洗细胞。要进行免疫标记，用PBS清洗细胞三次，并在每井中加入200微升新鲜准备的4%半甲醛。在室温下在黑暗中固定细胞20分钟。用PBS清洗细胞后，每井加入200微升阻滞缓冲液，在室温下在加湿室中堵塞30分钟。去除阻断缓冲液，加入200微升原抗体溶液。在室温下在黑暗的加湿室中孵育45分钟后，用PBS洗三次水井。去除PBS并加入200微升的二次抗体混合物。在室温下在黑暗的加湿室中孵育45分钟。然后用 PBS 洗井三次。在用防淡水安装幻灯片之前，用去氧化水清洗。放置一个盖玻璃，将滑梯存放在四摄氏度的黑暗中。使用共和显微镜，每个样本拍摄三到五张随机场图像，然后进行图像分析。要计算DNA损伤反应，请下载并安装 CellProfiler。从文件中选择文件、导入、管道，并选择名为 puncti Gamma-H2AX 的管道文件。将包含 Gamma-H2AX foci 采集图像的文件夹拖放到输入模块图像部分的文件列表窗口中进行分析。然后按照文本协议中所示的说明进行操作。要设置图像的参数，请将所需的图像拖动到文件列表中进行分析。在输入模块下，选择图像。在输入模块中，选择元数据，然后选择名称和类型。对于组，选择"否"。在分析模块中工作，选择颜色到灰色。然后选择平滑，选择标识主对象，然后再次选择平滑。接下来选择增强或抑制要素，然后选择标识主对象。仍在分析模块中工作，选择相关对象，然后对对象进行分类，最后选择导出到电子表格。单击分析左下角面板的图像以执行图像分析。在成功完成分析时，将生成多个图像。请注意生成并保存在计算机上的适当位置的 CSV 文件。此文件包含定量数据，供进一步分析。在称为"我的实验图像"的电子表格中，列 B 将具有最多具有 5 个 puncti 的核数，而列 D 的核数将具有超过 5 个 puncti 的核数。添加列 B 和 D 以获得核总数。对所有图像重复这些步骤，在每次分析之前更改我的实验文件名。此处显示了来自多索处理和非处理 iPS 细胞的彗星的代表性显微图。在 iPS 细胞中发现了一定量的 DNA 损伤，表示为 DNA 损伤和尾部时刻的一小部分。然而，doxo治疗增加了 iPS 细胞的 DNA 损伤，表明彗星测定可用于评估多能干细胞中的 DNA 完整性。此处显示了伽玛-H2AX 免疫标记的代表性显微图，放大率较低，放大率较高。在对照iPS衍生的心肌细胞中，超过90%的细胞每核的DDR foci小于5个。总共不到10%的细胞每核有6个以上的DDR foci。对于培养六个月的iPS衍生心肌细胞，只有不到90%的细胞每核有5个DDR foci，总共超过13%的细胞每核有6个以上的DDR foci。而在多索治疗的iPS衍生心肌细胞中，只有不到80%的细胞每核有5个DDR foci。并且总共约24%的细胞每核有6个以上的DDR foci。数据表明，长期的 iPS 衍生心肌细胞培养和多索治疗诱发显著的 DNA 损伤，使其不适合细胞移植。混合细胞悬浮液时避免变量非常重要，因为这可能会影响电泳。按照这个程序，你可以对各种类型的细胞进行彗星测定和免疫标记程序。这些技术将允许在细胞移植研究之前评估各种细胞的DNA损伤。

Research

JoVE Journal

Genetics

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

工程人为因素来特异性地操纵人细胞中的选择性剪接

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

科研

遗传学

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

使用生物素化补骨脂素全球定位RNA-RNA相互作用

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

用荧光PCR毛细管电泳技术在基因型CRISPR / Cas9介导的敲除突变体的高通量形式

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

一种从任意 DNA 源进行大规模 gRNA 库生产的通用协议

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

人端粒酶逆转录蛋白 rna 依赖性 rna 聚合酶活性的半定量检测

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

使用斑马鱼作为体内模型系统分析 DNA 复制定时

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 对小鼠和人造血祖细胞的高效基因破坏

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

一种组合单细胞法表征人茎和祖种群的分子和免疫表型异质性

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

人牙小泡干细胞的分离、鉴定及微 rna 遗传修饰

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...