Name: assessing stem cell dna integrity for cardiac cell therapy
Uploaded: 2019-01-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Stem Cell DNA Integrity for Cardiac Cell Therapy at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet i en del af National Heart, Lung, og Blood Institute tilskud RO1-HL-99507, HL-114120, HL-131017, HL138023 og UO1-HL-134764 (til J. Zhang) og af American Heart Association videnskabelige udvikling Grant 17SDG33670677 (til R. Lars).

1. komet Assay
<ol><li>
Af reagens
	<ol>
<li>For lav smeltepunkt agarosegelelektroforese, placere 500 mg af lav-smeltende Agarosen i 100 mL af DNA- / RNA-frit vand. Varm flasken i en mikrobølgeovn, indtil Agarosen er opløst. Placere flasken i et 37 ° C vandbad indtil det skal bruges. Bemærk: Yderligere læsning, du Azqueta et al., der studerede virkningerne af Agarosen koncentration på DNA-afvikling tid og flere elektroforese faktorer23.</li>
		<li>Forty...

<ol>
	<li>Bolli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+stem+cells+in+patients+with+ischaemic+cardiomyopathy+(SCIPIO):+initial+results+of+a+randomised+phase+1+trial.">Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial.</a> The Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).</li><li>Makkar, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracoronary+cardiosphere-derived+cells+for+heart+regeneration+after+myocardial+infarction+(CADUCEUS):+a+prospective,+randomised+phase+1+trial.">Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial.</a> The Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).</li><li>Tomita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+neural+crest+cells+contribute+to+the+dormant+multipotent+stem+cell+in+the+mammalian+heart.">Cardiac neural crest cells contribute to the dormant multipotent stem cell in the mammalian heart.</a> Journal of Cell Biology. 170 (7), 1135-1146 (2005).</li><li>Oyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+side+population+cells+have+a+potential+to+migrate+and+differentiate+into+cardiomyocytes+in+vitro+and+in+vivo.">Cardiac side population cells have a potential to migrate and differentiate into cardiomyocytes in vitro and in vivo.</a> Journal of Cell Biology. 176 (3), 329-341 (2007).</li><li>Fischer, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+myocardial+regeneration+through+genetic+engineering+of+cardiac+progenitor+cells+expressing+Pim-1+kinase.">Enhancement of myocardial regeneration through genetic engineering of cardiac progenitor cells expressing Pim-1 kinase.</a> Circulation. 120 (21), 2077-2087 (2009).</li><li>Cottage, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+progenitor+cell+cycling+stimulated+by+pim-1+kinase.">Cardiac progenitor cell cycling stimulated by pim-1 kinase.</a> Circulation Research. 106 (5), 891-901 (2010).</li><li>Angert, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+the+injured+adult+heart+involves+new+myocytes+potentially+derived+from+resident+cardiac+stem+cells.">Repair of the injured adult heart involves new myocytes potentially derived from resident cardiac stem cells.</a> Circulation Research. 108 (10), 1226-1237 (2011).</li><li>Kannappan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+Modulates+the+Fate+of+Cardiac+Progenitor+Cells+Ex+vivo+and+in+the+Diabetic+Heart+In+vivo.">p53 Modulates the Fate of Cardiac Progenitor Cells Ex vivo and in the Diabetic Heart In vivo.</a> EBioMedicine. 16, 224-237 (2017).</li><li>Hatzistergos, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+stimulate+cardiac+stem+cell+proliferation+and+differentiation.">Bone marrow mesenchymal stem cells stimulate cardiac stem cell proliferation and differentiation.</a> Circulation Research. 107 (7), 913-922 (2010).</li><li>Okita, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells:+opportunities+and+challenges.">Induced pluripotent stem cells: opportunities and challenges.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1575), 2198-2207 (2011).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cardiomyocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+repair+in+a+porcine+model+of+acute+myocardial+infarction+with+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiovascular+cells.">Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells.</a> Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+high+engraftment+of+patient-specific+cardiomyocyte+sheet+using+induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+adult+cardiac+fibroblast.">Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast.</a> Circulation: Heart Failure. 8 (1), 156-166 (2015).</li><li>Hirakawa, K., Midorikawa, K., Oikawa, S., Kawanishi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carcinogenic+semicarbazide+induces+sequence-specific+DNA+damage+through+the+generation+of+reactive+oxygen+species+and+the+derived+organic+radicals.">Carcinogenic semicarbazide induces sequence-specific DNA damage through the generation of reactive oxygen species and the derived organic radicals.</a> Mutation Research. 536 (1-2), 91-101 (2003).</li><li>Martinez, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+and+alkylating+damage+in+DNA.">Oxidative and alkylating damage in DNA.</a> Mutation Research. 544 (2-3), 115-127 (2003).</li><li>Valko, M., Rhodes, C. J., Moncol, J., Izakovic, M., Mazur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+radicals,+metals+and+antioxidants+in+oxidative+stress-induced+cancer.">Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer.</a> Chemico-Biological Interactions. 160 (1), 1-40 (2006).</li><li>Wiseman, H., Halliwell, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Damage+to+DNA+by+reactive+oxygen+and+nitrogen+species:+role+in+inflammatory+disease+and+progression+to+cancer.">Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species: role in inflammatory disease and progression to cancer.</a> Biochemical Journal. 313 (Pt 1), 17-29 (1996).</li><li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelectrophoretic+study+of+radiation-induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells.">Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 123 (1), 291-298 (1984).</li><li>Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells.">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.</a> Experimental Cell Research. 175 (1), 184-191 (1988).</li><li>Goichberg, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-associated+defects+in+EphA2+signaling+impair+the+migration+of+human+cardiac+progenitor+cells.">Age-associated defects in EphA2 signaling impair the migration of human cardiac progenitor cells.</a> Circulation. 128 (20), 2211-2223 (2013).</li><li>Kannappan, R., Mattapally, S., Wagle, P. A., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivation+domain+of+p53+regulates+DNA+repair+and+integrity+in+human+iPS+cells.">Transactivation domain of p53 regulates DNA repair and integrity in human iPS cells.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. , (2018).</li><li>Al-Baker, E. A., Oshin, M., Hutchison, C. J., Kill, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+UV-induced+damage+and+repair+in+young+and+senescent+human+dermal+fibroblasts+using+the+comet+assay.">Analysis of UV-induced damage and repair in young and senescent human dermal fibroblasts using the comet assay.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 126 (6-7), 664-672 (2005).</li><li>Azqueta, A., Gutzkow, K. B., Brunborg, G., Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+more+reliable+comet+assay:+optimising+agarose+concentration,+unwinding+time+and+electrophoresis+conditions.">Towards a more reliable comet assay: optimising agarose concentration, unwinding time and electrophoresis conditions.</a> Mutation Research. 724 (1-2), 41-45 (2011).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7 (10), R100 (2006).</li><li>Paradis, A. N., Gay, M. S., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binucleation+of+cardiomyocytes:+the+transition+from+a+proliferative+to+a+terminally+differentiated+state.">Binucleation of cardiomyocytes: the transition from a proliferative to a terminally differentiated state.</a> Drug Discovery Today. 19 (5), 602-609 (2014).</li></ol>

DNA integritet skildrer celle integritet. Celler med beskadiget DNA er ofte i stress og i sidste ende miste deres integritet. Integriteten af stammen og stammen-celle-afledte celler, som overføres til transplantation er vigtigste for cellerne til at udføre deres ønskede funktion. Transplantation af celler med beskadiget DNA ville resultere i en dårlig engraftment hastighed og ydeevne af celle8,20. Derfor er undersøger DNA integritet før celle transplantatio...

Eksperimentel og klinisk dokumentation viser, at celle transplantation kan moderat forbedre venstre ventrikel kontraktile svigtende hjerter1,2,3,4,5 ,6,7,8,9. De seneste fremskridt har åbnet yderligere tiltrækkende muligheder for hjerte-kar-regenerering; Disse omfatter den tvungne udtryk for omprogrammering faktorer i somatiske celler til at fremkalde pluripotency og differentiere disse inducerede pluripotente stamceller (iPSC) i forskellige kardiale lineages, især cardiomyocyte (CM)10, 11 , 12 , 13. den arvelige materiale i hver celle, herunder kunstigt genereret iPSCs og iPSC-afledte CM (iPS-CM), er DNA. De genetiske instruktioner lagret i DNA dikterer vækst, udvikling og funktion af celler, væv, organer og organismer. DNA er ikke inaktiv; celle metabolitter, såsom reaktive oxygen, carbonyl og nitrogen arter, og alkylerende stoffer kan forårsage DNA skade in vitro- og in vivo14,15,16,17. Vigtigere, opstår DNA-skader intuitivt i hver celle, med en betydelig frekvens. Hvis disse skader ikke er løst, vil det føre til DNA-mutation, cellulære gulne, tabet af DNA og celle integritet, og eventuelt, sygdomme, herunder livstruende kræft. Derfor er bevarer DNA integritet afgørende for enhver celle, især iPSCs, der har et enormt potentiale i klinikken.
For at vurdere den mængde og integritet på isolerede genomisk DNA, er dyrt udstyr tilgængelige på markedet. Men der er ingen enkle og omkostningseffektive metoder til at vurdere DNA integritet i celler, uden at isolere cellerne. Derudover er bruger-induceret DNA nedbrydning under DNA isolation en af de større ulemper ved at bruge disse metoder. De encellede gel elektroforese (kendt som comet assay)18,19 og γH2A.X immunolabeling8 teknikker er grundlæggende metoder i forskning labs for vurdering af DNA-skader. Disse to metoder kræver ikke dyrt udstyr eller isolerede genomisk DNA til at analysere DNA integritet8,20,21. Da er disse teknikker blevet udført med hele celler; bruger-induceret DNA/RNA/protein nedbrydning under prøveforberedelsen vil ikke påvirke disse protokoller. Her, for at vurdere de DNA-skader og DNA skader svar i stammen og stammen-celle-afledte celler, leverer vi en trinvis protokoller til at udføre både komet assay og γH2A.X immunolabeling. Derudover foreslår kombinerer disse to tilgange, vi en naiv vurdering, der kan bruges til at vurdere den celle er egnet til transplantation.
Komet assay, eller enkelt celle gel elektroforese, måler DNA pauser i celler. Celler indlejret i lav-smeltende Agarosen er mængden til form Xanthophyta indeholdende supercoiled DNA. Ved elektroforese vandrer små stykker af fragmenterede DNA og DNA-strenge, brudt gennem porerne Agarosen intakt DNA, på grund af deres enorme størrelse og deres konjugering med matrix protein, vil have en begrænset migration. Mønster af farvede DNA under et fluorescens mikroskop efterligner en komet. Komet hovedet indeholder intakt DNA og halen er sammensat af brudstykker og brudt DNA-strenge. Brøkdel af DNA-skader kan måles ved fluorescens-intensiteten af den beskadigede DNA (comet hale) i forhold til intakt DNA (comet hoved) intensiteten. Parameter halen øjeblik kan beregnes som vist i figur 1.
DNA-skader inducerer fosforylering af Histon H2A. X (γH2A.X) på Ser139 ved ATM, ATR og DNA-PK kinaser. Fosforylering og rekruttering af H2A. X på DNA strand pauser kaldes DNA skader svar (DDR) og sker hurtigt efter DNA er beskadiget. Efter denne proces, checkpoint-medieret celle cyklus anholdelse og DNA reparationsprocesser er indledt. Efter den vellykkede afslutning af DNA reparation, er γH2A.X defosforyleret og inaktiveret ved fosfataser. Forlænget og flere DNA strand pauser føre til ophobning af γH2A.X foci i DNA. Dette angiver cellens evne til at reparere DNA skader og tab af DNA integritet. Disse γH2A.X foci i DNA kan identificeres af og antallet af DDR foci kan tælles ved hjælp af protokollen i afsnit 2.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slide</td>
			<td>Millicell</td>
			<td>PEZGS0816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td>Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure 
			Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson Immuno 
			Research Laboratories</td>
			<td>711-545-152 
			(RRID: AB_2313584)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson Immuno 
			Research Laboratories</td>
			<td>711-165-152 
			(RRID:AB_2307443)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco B-27 Supplement, Serum Free,</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel growth factor reduced</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhalloidinA488</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2577 (RRID: AB_2118010)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR&#160;Green I nucleic acid gel stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Low melting Point Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Antifade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing stem cell dna integrity for cardiac cell therapy

Stammen og stammen-celle-afledte celler har enorme potentiale som en regenerativ behandling af forskellige degenerative sygdomme. DNA er lagerbygning af genetiske data i alle celler, herunder stamceller, og dens integritet er grundlæggende for sin regenerative evne. Stamceller undergår hurtige formering i labs for at opnå de nødvendige tal til transplantation. Accelereret cellevækst fører til tab af DNA integritet af akkumulerede metabolitter, såsom reaktive oxygen, carbonyl og alkylerende stoffer. Omplantning disse celler ville resultere i dårlig engraftment og regenerering af den forværrede orgel. Derudover omplantning DNA-beskadigede celler fører til mutationer, DNA ustabilitet, cellulære ældning, og eventuelt livstruende sygdomme som kræft. Derfor, der er et øjeblikkeligt behov for en kvalitetskontrol metode til at vurdere den celle er egnet til transplantation. Her, leverer vi en trinvis protokoller for vurdering af DNA integriteten af stamceller inden celle transplantation.

Menneskelige inducerede pluripotente stamceller var kulturperler, og DNA-skader og halen øjeblik, der blev brugt som et mål for DNA integritet, blev analyseret af comet assay. iPS-celler blev integreret i lav smeltepunkt Agarosen og placeret på et glas dias. Cellerne blev, derefter, behandlet med lysisbuffer, efterfulgt af en alkalisk opløsning, at opnå supercoiled DNA. Xanthophyta var electrophoresed og kometer blev visualiseret ved DNA farvestof (figur 1A</stro...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Stem Cell DNA Integrity for Cardiac Cell Therapy at JoVE.com

Assessing Stem Cell DNA Integrity for Cardiac Cell Therapy

Vurdering af stamceller DNA integritet for kardiale celleterapi

Her give vi en detaljeret beskrivelse af en eksperimentel opsætning for en analyse af vurderingen af DNA integritet i stamceller inden celle transplantation.

Stem and stem-cell-derived cells have immense potential as a regenerative therapy for various degenerative diseases. DNA is the storehouse of genetic data ...

For neonatale sygdomme som kardiomyopati har regenerativ behandling ved hjælp af inducerede pluripotente stamceller afledte celler et enormt potentiale. Men, in vitro accelereret cellevækst fører til DNA-skader af akkumulerede metabolitter såsom reaktive ilt arter. Omplantning af disse DNA-beskadigede celler ville resultere i dårlig engraftment og regenerering af organet.Før transplantationen skal cellernes kvalitet vurderes. Her tilbyder vi to trinvise protokoller til vurdering af DNA-skader i stamceller. Demonstrere procedurerne vil være Jessica Miller, en forsker, Nikhil Mardhekar, en forsker, og Vasanthi Rajasekaran, en lab tekniker.Til at begynde, sted 500 milligram lav-smeltende agarose i 100 milliliter DNA-RNA frit vand. Varm flasken op i en mikrobølgeovn, indtil agarosen er opløst. Derefter placere flasken i en 37-graders-Celsius vandbad, indtil det er nødvendigt.For at forberede forbelagt komet dias, placere et par dråber på 0,5% agarose på et glas dias. Straks sprede agarose til at danne et tyndt lag af agarose belægning ved hjælp af en coverlip. Arbejde under svagt lys betingelser for at undgå ultraviolet lys-induceret celleskade, bland 10 mikroliter af celle suspension og 90 mikroliter af agarose opløsning i et rør.Placer røret i en 37-graders-Celsius vandbad for at forhindre agarose fra størkning. Bland opløsningen uden at indføre luftbobler, og pipette 70 mikroliter pr. plet på det forbelagte kometskreds. Ved hjælp af en pipettespids skal du sprede cellealroseblandingen for at danne et tyndt lag.Placer diaset ved fire grader Celsius i 15 minutter. I en beholder nedsænkes diaset helt i kold lysisbuffer. Placer beholderen i mørke ved fire grader Celsius i en time.Udskift lysisbufferen med kold alkalisk opløsning. Sørg for, at objektglassene er helt nedsænket. Efter at have forladt beholderen i mørke ved fire grader Celsius i yderligere 30 minutter, skal du placere diaset i en vandret elektroforesetank.Fyld tanken med kold alkalisk elektroforese buffer, indtil diasene er helt nedsænket. Påfør spænding på en volt per centimeter i 15 til 30 minutter. I en beholder nedsænkes diaset helt i koldt deioniseret vand.Efter to minutter skal du fjerne det deioniserede vand og tilsæt frisk deioniseret vand, og gentag derefter dette trin igen. Dernæst erstatte deioniseret vand med koldt 70% ethanol. Efter fem minutter fjernes du forsigtigt sliden uden at vippe det og lade det lufttørre.Når tørret, tilsæt 100 mikroliter af fortyndet DNA farvestof til hvert sted, og vent 15 minutter ved stuetemperatur. Brug et FITC-filter i et epifluorescensmikroskop, tag billeder af 50 til 100 kometer i alt pr. prøve. Kultur iPS-afledte kardiomyocytter som beskrevet i tekstprotokollen.For at se de iPS-afledte kardiomyocytter i kammerdias skal du først kassere kulturmediet fra brøndene og vaske cellerne tre gange med PBS. Tilføj en milliliter 0,25% Trypsin per brønd, og inkubere ved 37 grader Celsius i fem minutter. Kontroller pladen under et mikroskop for celleopdeling.Tilføj derefter en milliliter CMM for at stoppe Trypsin. Celleaffjedringen anbringes i et 15-milliliterrør og centrifuge i fem minutter ved fire grader Celsius og 200 gange g. Kassér mediet, tilsæt en milliliter CMM, og resuspend cellerne.Tæl cellerne, og juster celletallet for at opnå to millioner celler i 1,6 milliliter CMM. Nu frø 200 mikroliter af celle suspension per brønd af de otte-brønde kammer dias. Tryk forsigtigt på rutsjebanen for at sprede cellerne rundt om brønden.Inkuber cellerne ved 37 grader Celsius. For den iPS-afledte kardiomyocyte doxorubicin behandling, kasseres kulturmediet fra de iPS-afledte kardiomyocytebode, og cellerne vaskes med PBS. Behandl cellerne med en-mikromolar doxorubicin i fire timer ved 37 grader Celsius.Aspirere mediet, og vask cellerne med PBS. For at udføre immunmærkning, vaske cellerne tre gange med PBS og tilsæt 200 mikroliter frisklavet 4% paraformaldehyd til hver brønd. Fastgør cellerne i 20 minutter i mørke ved stuetemperatur.Efter vask af cellerne med PBS tilsættes 200 mikroliter blokerende buffer pr. brønd og blokeres i 30 minutter i et befugtet kammer ved stuetemperatur. Fjern blokeringsbufferen, og tilsæt 200 mikroliter af primær antistofopløsning. Efter inkubering i 45 minutter i et mørkt befugtet kammer ved stuetemperatur vaskes brøndene tre gange med PBS.Fjern PBS og tilsæt 200 mikroliter af sekundære antistof mix. Inkuberes i 45 minutter i et mørkt befugtet kammer ved stuetemperatur. Vask derefter brøndene tre gange med PBS.Vask med deioniseret vand, før du monterer rutsjebanerne med antifade. Placer et dækglas, og opbevar rutsjebanerne i mørke ved fire grader Celsius. Ved hjælp af et konfokalt mikroskop skal du tage tre til fem billeder af tilfældige felter pr. prøve og gå videre til billedanalyse.Hvis du vil tælle DNA-skadesrespons foci, skal du downloade og installere CellProfiler. Vælg fil, import, pipeline fra filen, og vælg pipelinefilen med navnet punktafgiftsfri gamma-H2AX. Træk og slip den mappe, der indeholder de erhvervede billeder af gamma-H2AX foci, til fillistevinduet i afsnittet billeder af inputmoduler til analyse.Følg derefter vejledningen som vist i tekstprotokollen. Hvis du vil angive parametrene for billederne, skal du trække det ønskede billede til analyse til fillisten. Vælg billeder under inputmoduler.Vælg også metadata i inputmoduler, og vælg derefter navne og typer. Vælg nej for grupper. Når du arbejder i analysemoduler, skal du vælge farve til grå.Vælg derefter jævn, markér identificer primære objekter, og vælg igen jævn. Vælg derefter forbedre eller undertryk funktioner, og vælg derefter identificer primære objekter. Hvis du stadig arbejder i analysemoduler, skal du markere relatere objekter, derefter klassificere objekter og til sidst vælge eksport til regneark.Klik på Analysér billeder nederst til venstre for at udføre billedanalyse. Ved den vellykkede afslutning af analysen genereres flere billeder. Bemærk den CSV-fil, der genereres og gemmes på den relevante placering på computeren.Denne fil indeholder de kvantitative data til yderligere analyse. I regnearket kaldet mit eksperiment billede, kolonne B vil have antallet af kerner, der har op til fem punktformid, og kolonne D vil have antallet af kerner, der har mere end fem punktformidlige. Tilføj kolonner B og D for at få det samlede antal kerner.Gentag disse trin for alle billeder, ændre mit eksperiment filnavn før hver analyse. Repræsentative mikrografer af kætre fra doxo-behandlede og ikke-behandlede iPS-celler vises her. En basal mængde DNA-skader blev fundet i iPS-celler, udtrykt som en brøkdel af DNA-skader og hale øjeblik.Doxo-behandlingen øgede dog DNA-skaden i iPS-celler som forventet, hvilket indikerer, at kometanalysen kan bruges til at vurdere DNA-integriteten i pluripotente stamceller. Repræsentative mikrografer af gamma-H2AX immunmærkning er vist her, ved lavere forstørrelse og ved højere forstørrelse. I kontrol iPS-afledte kardiomyocytter havde mere end 90% af cellerne mindre end fem DDR foci pr. kerner.Og i alt mindre end 10% af cellerne havde mere end seks DDR foci per kerner. For iPS-afledte kardiomyocytter dyrket i seks måneder havde mindre end 90 % af cellerne op til fem DDR foci pr. kerner, og i alt mere end 13 % af cellerne havde mere end seks DDR foci pr. kerner. Mens der i doxo-behandlede iPS-afledte kardiomyocytter havde mindre end 80% af cellerne op til fem DDR foci pr. kerner.Og i alt omkring 24% af cellerne havde mere end seks DDR foci pr kerner. Disse data indikerer, at langvarig iPS-afledt kardiomyocytcellekultur og doxo behandling induceret betydelig DNA-skade, hvilket gør dem uegnede til celletransplantation. Det er meget vigtigt at undgå variabler, mens du blander cellesuspensionen, da dette kan påvirke elektroforese.Efter denne procedure, du kan udføre kometen assays og immunmærkning procedurer med celler af forskellige typer. Disse teknikker vil gøre det muligt at vurdere celler af forskellig art for DNA-skader, før de anvendes i celletransplantationsundersøgelser.

Research

JoVE Journal

Genetics

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

Tekniske kunstige faktorer til specifikt manipulation af alternativ splejsning i humane celler

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Kortlægning af RNA-RNA-interaktioner globalt ved anvendelse af biotinyleret psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Under anvendelse af et fluorescerende PCR-kapillær gelelektroforese Teknik til genotype CRISPR / Cas9-medieret Knockout Mutanter i et format med høj kapacitet

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

En universel protokol for storstilet gRNA bibliotek produktion fra enhver kilde, DNA

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Semi-kvantitative opdagelse af RNA-afhængige RNA Polymerase aktivitet af menneskelige Telomerase Reverse transkriptase Protein

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profilering DNA replikation Timing ved hjælp af zebrafisk som en In Vivo modelsystem.

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Højeffektive gen afbrydelse af Murine og menneskelige hæmatopoietisk stamceller ved CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

En kombinatorisk encellede tilgang til at karakterisere de molekylære og Immunophenotypic heterogenitet af menneskelige stamceller og stamfader populationer

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Isolation, karakterisering og mikroRNA-baseret genetisk modificering af menneskelige Dental follikel stamceller

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...