Name: assessing stem cell dna integrity for cardiac cell therapy
Uploaded: 2019-01-25T14:00:00
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Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt durch nationale Herz-, Lungen- und Blut-Institut Stipendien RO1-HL-99507, HL-114120, HL-131017, HL138023 und UO1-HL-134764 (an J. Zhang) und durch die American Heart Association wissenschaftliche Development Grant 17SDG33670677 (zu R. Kannappan).

(1) Comet Assay
<ol><li>
Reagenz-Vorbereitung
	<ol>
<li>Für niedrige Schmelzpunkt Agarose 500 mg niedrig schmelzende Agarose in 100 mL DNA - Platz / RNA-freies Wasser. Erhitzen Sie die Flasche in der Mikrowelle, bis die Agarose auflöst. Stellen Sie die Flasche in einem 37 ° C Wasserbad bis benötigt. Hinweis: Weiter lesen, finden Sie unter Azqueta Et Al., die die Wirkungen von Agarose-Konzentration auf die DNA-Abbau-Zeit und mehrere Elektrophorese Faktoren23</su...

<ol>
	<li>Bolli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+stem+cells+in+patients+with+ischaemic+cardiomyopathy+(SCIPIO):+initial+results+of+a+randomised+phase+1+trial.">Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial.</a> The Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).</li><li>Makkar, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracoronary+cardiosphere-derived+cells+for+heart+regeneration+after+myocardial+infarction+(CADUCEUS):+a+prospective,+randomised+phase+1+trial.">Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial.</a> The Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).</li><li>Tomita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+neural+crest+cells+contribute+to+the+dormant+multipotent+stem+cell+in+the+mammalian+heart.">Cardiac neural crest cells contribute to the dormant multipotent stem cell in the mammalian heart.</a> Journal of Cell Biology. 170 (7), 1135-1146 (2005).</li><li>Oyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+side+population+cells+have+a+potential+to+migrate+and+differentiate+into+cardiomyocytes+in+vitro+and+in+vivo.">Cardiac side population cells have a potential to migrate and differentiate into cardiomyocytes in vitro and in vivo.</a> Journal of Cell Biology. 176 (3), 329-341 (2007).</li><li>Fischer, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+myocardial+regeneration+through+genetic+engineering+of+cardiac+progenitor+cells+expressing+Pim-1+kinase.">Enhancement of myocardial regeneration through genetic engineering of cardiac progenitor cells expressing Pim-1 kinase.</a> Circulation. 120 (21), 2077-2087 (2009).</li><li>Cottage, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+progenitor+cell+cycling+stimulated+by+pim-1+kinase.">Cardiac progenitor cell cycling stimulated by pim-1 kinase.</a> Circulation Research. 106 (5), 891-901 (2010).</li><li>Angert, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+the+injured+adult+heart+involves+new+myocytes+potentially+derived+from+resident+cardiac+stem+cells.">Repair of the injured adult heart involves new myocytes potentially derived from resident cardiac stem cells.</a> Circulation Research. 108 (10), 1226-1237 (2011).</li><li>Kannappan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+Modulates+the+Fate+of+Cardiac+Progenitor+Cells+Ex+vivo+and+in+the+Diabetic+Heart+In+vivo.">p53 Modulates the Fate of Cardiac Progenitor Cells Ex vivo and in the Diabetic Heart In vivo.</a> EBioMedicine. 16, 224-237 (2017).</li><li>Hatzistergos, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+stimulate+cardiac+stem+cell+proliferation+and+differentiation.">Bone marrow mesenchymal stem cells stimulate cardiac stem cell proliferation and differentiation.</a> Circulation Research. 107 (7), 913-922 (2010).</li><li>Okita, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells:+opportunities+and+challenges.">Induced pluripotent stem cells: opportunities and challenges.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1575), 2198-2207 (2011).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cardiomyocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+repair+in+a+porcine+model+of+acute+myocardial+infarction+with+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiovascular+cells.">Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells.</a> Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+high+engraftment+of+patient-specific+cardiomyocyte+sheet+using+induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+adult+cardiac+fibroblast.">Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast.</a> Circulation: Heart Failure. 8 (1), 156-166 (2015).</li><li>Hirakawa, K., Midorikawa, K., Oikawa, S., Kawanishi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carcinogenic+semicarbazide+induces+sequence-specific+DNA+damage+through+the+generation+of+reactive+oxygen+species+and+the+derived+organic+radicals.">Carcinogenic semicarbazide induces sequence-specific DNA damage through the generation of reactive oxygen species and the derived organic radicals.</a> Mutation Research. 536 (1-2), 91-101 (2003).</li><li>Martinez, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+and+alkylating+damage+in+DNA.">Oxidative and alkylating damage in DNA.</a> Mutation Research. 544 (2-3), 115-127 (2003).</li><li>Valko, M., Rhodes, C. J., Moncol, J., Izakovic, M., Mazur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+radicals,+metals+and+antioxidants+in+oxidative+stress-induced+cancer.">Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer.</a> Chemico-Biological Interactions. 160 (1), 1-40 (2006).</li><li>Wiseman, H., Halliwell, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Damage+to+DNA+by+reactive+oxygen+and+nitrogen+species:+role+in+inflammatory+disease+and+progression+to+cancer.">Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species: role in inflammatory disease and progression to cancer.</a> Biochemical Journal. 313 (Pt 1), 17-29 (1996).</li><li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelectrophoretic+study+of+radiation-induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells.">Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 123 (1), 291-298 (1984).</li><li>Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. 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A., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivation+domain+of+p53+regulates+DNA+repair+and+integrity+in+human+iPS+cells.">Transactivation domain of p53 regulates DNA repair and integrity in human iPS cells.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. , (2018).</li><li>Al-Baker, E. A., Oshin, M., Hutchison, C. J., Kill, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+UV-induced+damage+and+repair+in+young+and+senescent+human+dermal+fibroblasts+using+the+comet+assay.">Analysis of UV-induced damage and repair in young and senescent human dermal fibroblasts using the comet assay.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 126 (6-7), 664-672 (2005).</li><li>Azqueta, A., Gutzkow, K. B., Brunborg, G., Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+more+reliable+comet+assay:+optimising+agarose+concentration,+unwinding+time+and+electrophoresis+conditions.">Towards a more reliable comet assay: optimising agarose concentration, unwinding time and electrophoresis conditions.</a> Mutation Research. 724 (1-2), 41-45 (2011).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7 (10), R100 (2006).</li><li>Paradis, A. N., Gay, M. S., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binucleation+of+cardiomyocytes:+the+transition+from+a+proliferative+to+a+terminally+differentiated+state.">Binucleation of cardiomyocytes: the transition from a proliferative to a terminally differentiated state.</a> Drug Discovery Today. 19 (5), 602-609 (2014).</li></ol>

DNA-Integrität schildert Zelle Integrität. Zellen mit beschädigter DNA sind häufig in Stress und schließlich ihre Integrität zu verlieren. Die Integrität der Stiel und Stamm-abgeleitete Zellen, die zum Zweck der Transplantation wird propagiert werden ist für die Zellen ihre gewünschte Funktion ausführen. Transplantation von Zellen mit beschädigter DNA führt zu einer schlechten Engraftment Rate und Leistung der Zelle8,20. Daher ist die Untersuchung der...

Experimentelle und klinische Beweise zeigt, dass Zelltransplantation gemäßigt linken Ventrikel kontraktilen Ermangelung Herzen1,2,3,4,5 verbessern können ,6,7,8,9. Die jüngsten Fortschritte haben eröffnet weitere attraktive Möglichkeiten für kardiovaskuläre Regeneration; Dazu gehören die erzwungene Expression Neuprogrammierung Faktoren in somatischen Zellen induzieren Pluripotenz und differenzieren diese induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC) in verschiedenen kardialen Linien, vor allem Cardiomyocyte (CM)10, 11 , 12 , 13. das Erbgut in jeder Zelle, einschließlich der künstlich erzeugten iPSCs und iPSC-abgeleitete CM (iPS-CM), ist die DNA. Die genetischen Anweisungen, die in der DNA gespeicherten diktiert die Wachstum, Entwicklung und Funktion von Zellen, Geweben, Organen und Organismen. DNA ist nicht träge; Handy-Metaboliten, wie reaktive Sauerstoff, Carbonyl und Stickstoff-Spezies, und Alkylantien Agenten kann Ursache Schäden an DNA in vitro und in-vivo-14,15,16,17. DNA-Schäden tritt vor allem intuitiv in jeder Zelle mit einer erheblichen Frequenz. Wenn diese Schäden nicht behoben sind, wird es zu DNA-Mutation, zelluläre Seneszenz, den Verlust der DNA und Zelle Integrität und gegebenenfalls Krankheiten, einschließlich lebensbedrohlichen Krebserkrankungen führen. Daher ist es wichtig, jede Zelle, besonders iPSCs, das enormes Potenzial in der Klinik hat, DNA-Integrität beizubehalten.
Für die Bewertung der Menge und der Integrität der isolierte genomische DNA, ist die teure Ausrüstung auf dem Markt verfügbar. Allerdings gibt es keine einfachen und kostengünstigen Methoden, um die Integrität der DNA in den Zellen zu beurteilen, ohne die Zellen zu isolieren. Benutzer-induzierten DNA-Abbau während der DNA-Isolierung ist übrigens einer der größten Nachteile im Umgang mit diesen Methoden. Die einzellige Gel-Elektrophorese (bekannt als Comet Assay)18,19 und γH2A.X Immunolabeling8 Techniken sind grundlegende Ansätze in Forschungslabors zur Bewertung von DNA-Schäden. Diese beiden Methoden benötigen keine teure Ausrüstung oder isolierte genomische DNA, DNA-Integrität8,20,21zu analysieren. Seitdem wurden diese Techniken mit ganzer Zellen durchgeführt; Benutzer-induzierten DNA/RNA/Proteinabbau während der Probenvorbereitung wird keine Auswirkungen auf diese Protokolle. Hier, um die DNA-Schäden und DNA-Schäden Antwort in Stamm und Stamm-abgeleitete Zellen zu beurteilen, bieten wir Ihnen Schritt für Schritt-Protokolle, um die Comet-Assay und γH2A.X der Immunolabeling durchführen. Darüber hinaus schlagen verbindet diese beiden Ansätze, wir eine naiv-Bewertung, die verwendet werden kann, um die Zelle Eignung für Transplantationen zu bewerten.
Die Comet-Assay oder einzellige gel-Elektrophorese, misst die DNA-Brüchen in den Zellen. Zellen in niedrigschmelzenden Agarose eingebettet sind, Form ausgedehnt mit supercoiled DNA lysiert. Bei der Elektrophorese durchwandern kleine Stücke von fragmentierten DNA und gebrochenen DNA-Strängen die Agarose Poren, intakte DNA, aufgrund ihrer enormen Größe und ihre Konjugation mit dem Matrix-Protein, eine eingeschränkte Migration auswirken. Das Muster der gefärbten DNA unter dem Fluoreszenzmikroskop imitiert ein Komet. Der Kopf des Kometen enthält intakte DNA und die Rute besteht aus Fragmenten und gebrochen DNA-Stränge. Der Anteil der DNA-Schäden kann durch die Fluoreszenzintensität der beschädigten DNA (Kometenschweif) bezogen auf die intakte DNA (Kopf des Kometen) Intensität gemessen werden. Der Parameter Heck Moment kann berechnet werden, wie in Abbildung 1dargestellt.
DNA-Schädigung induziert die Phosphorylierung der Histone H2A. X (γH2A.X) am Ser139 von ATM, ATR und DNA-PK Kinasen. Die Phosphorylierung und Rekrutierung von H2A. X zu DNA-Strangbrüchen nennt man DNA-Schäden Antwort (DDR) und schnell geschieht, nachdem DNA beschädigt ist. Im Anschluss an diesen Prozess, Checkpoint-vermittelten Zellzyklus Festnahme und DNA-Reparaturprozesse initiiert. Nach dem erfolgreichen Abschluss der DNA-Reparatur ist γH2A.X Rezeptorsignals und durch Phosphatasen inaktiviert. Verlängert und mehrere DNA-Strangbrüchen führen zu die Ansammlung von γH2A.X Brennpunkte in der DNA. Dies zeigt die Zelle Unfähigkeit, die DNA-Schäden und dem Verlust der Integrität der DNA zu reparieren. Durch diese γH2A.X Brennpunkte in DNA identifiziert werden können und die Anzahl der DDR Brennpunkte kann unter Verwendung des Protokolls in Abschnitt 2 gezählt werden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slide</td>
			<td>Millicell</td>
			<td>PEZGS0816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td>Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure 
			Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson Immuno 
			Research Laboratories</td>
			<td>711-545-152 
			(RRID: AB_2313584)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson Immuno 
			Research Laboratories</td>
			<td>711-165-152 
			(RRID:AB_2307443)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco B-27 Supplement, Serum Free,</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel growth factor reduced</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhalloidinA488</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2577 (RRID: AB_2118010)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR&#160;Green I nucleic acid gel stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Low melting Point Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Antifade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing stem cell dna integrity for cardiac cell therapy

Stiel und Stamm-abgeleitete Zellen haben immenses Potential als regenerative Therapie für verschiedene degenerative Krankheiten. DNA ist das Lagerhaus genetischer Daten in allen Zellen, einschließlich Stammzellen, und seine Integrität ist grundlegend für seine Regenerationsfähigkeit. Stammzellen werden schnelle Ausbreitung in Labors, die notwendigen Zahlen für die Transplantation zu erreichen. Beschleunigte Zellwachstum führt zum Verlust der DNA-Integrität durch angesammelte Stoffwechselprodukte wie reaktive Sauerstoff, Carbonyl und Alkylantien Agenten. Transplantation dieser Zellen führt zu schlechten Engraftment und Regeneration der sich verschlechternden Orgel. Darüber hinaus Umpflanzen DNA beschädigt Zellen führt zu Mutationen, DNA-Instabilität, zelluläre Seneszenz und möglicherweise lebensbedrohliche Krankheiten wie Krebs. Daher ist eine unmittelbare Notwendigkeit für eine Qualitätskontrollmethode, um die Zelle Eignung für Transplantationen zu bewerten. Hier bieten wir detaillierte Protokolle für die Beurteilung der DNA-Integrität der Stammzellen vor Stammzelltransplantation.

Menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen gezüchtet wurden, und DNA-Schäden und der Schweif Moment, die als Maß für die DNA-Integrität verwendet wurden, wurden von Comet Assay untersucht. iPS-Zellen wurden in niedrigen Schmelzpunkt Agarose eingebettet und auf einen Objektträger gelegt. Die Zellen wurden, dann mit Lyse Puffer, gefolgt von einer alkalischen Lösung, supercoiled DNA erhalten behandelt. Ausgedehnt wurden electrophoresed und Kometen wurden durch DNA-Farbstoff (<...

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Assessing Stem Cell DNA Integrity for Cardiac Cell Therapy

Beurteilung Stem Cell DNA-Integrität für kardiale Zelltherapie

Hier bieten wir eine ausführliche Beschreibung des Versuchsaufbaus für eine Analyse der Bewertung der DNA-Integrität in Stammzellen vor Stammzelltransplantation.

Stem and stem-cell-derived cells have immense potential as a regenerative therapy for various degenerative diseases. DNA is the storehouse of genetic data ...

Bei neonatalen Erkrankungen wie der Kardiomyopathie hat die regenerative Therapie mit induzierten pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten Zellen ein enormes Potenzial. Jedoch, In-vitro-beschleunigtes Zellwachstum führt zu DNA-Schäden durch angesammelte Metaboliten wie reaktive Sauerstoffspezies. Eine Transplantation dieser DNA-geschädigten Zellen würde zu einer schlechten Transplantation und Regeneration des Organs führen.Vor der Transplantation sollte die Qualität der Zellen bewertet werden. Hier stellen wir zwei Schritt-für-Schritt-Protokolle zur Bewertung der DNA-Schäden in Stammzellen zur Verfügung. Die Verfahren werden Jessica Miller, eine Forscherin, Nikhil Mardhekar, ein Forscher, und Vasanthi Rajasekaran, ein Labortechniker, demonstrieren.Um zu beginnen, legen Sie 500 Milligramm niedrigschmelzende Agarose in 100 Milliliter DNA-RNA-freies Wasser. Die Flasche in einer Mikrowelle erhitzen, bis sich die Agarose auflöst. Dann legen Sie die Flasche in ein 37-Grad-Celsius-Wasserbad, bis sie benötigt wird.Um vorbeschichtete Kometenschlitten vorzubereiten, legen Sie ein paar Tropfen 0,5%Agarose auf eine Glasrutsche. Die Agarose sofort zu einer dünnen Schicht Agarose-Beschichtung mit einem Deckslip ausbreiten. Arbeiten Sie unter schlechten Lichtverhältnissen, um ultraviolette Licht-induzierte Zellschäden zu vermeiden, mischen Sie 10 Mikroliter Zellsuspension und 90 Mikroliter Agarose-Lösung in einem Rohr.Legen Sie das Rohr in ein 37-Grad-Celsius-Wasserbad, um eine Erstarrung der Agarose zu verhindern. Mischen Sie die Lösung, ohne Luftblasen einzuführen, und Pipette 70 Mikroliter pro Punkt auf den vorbeschichteten Kometenschlitten. Mit einer Pipettenspitze die Zellagarosemischung zu einer dünnen Schicht verteilen.Platzieren Sie die Rutsche 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius. In einem Container die Folie vollständig in einen kaltlysepuffer nauchen. Stellen Sie den Behälter eine Stunde lang bei vier Grad Celsius in senfdark.Ersetzen Sie den Lysepuffer durch eine kalte alkalische Lösung. Stellen Sie sicher, dass die Folien vollständig untergetaucht sind. Nachdem Sie den Behälter bei vier Grad Celsius für weitere 30 Minuten im Dunkeln gelassen haben, legen Sie die Rutsche in einen horizontalen Elektrophoresetank.Füllen Sie den Tank mit kaltem alkalischen Elektrophoresepuffer, bis die Dias vollständig untergetaucht sind. 15 bis 30 Minuten Spannung bei einem Volt pro Zentimeter antragen. In einem Behälter, vollständig untertauchen die Rutsche in kaltes deionisiertes Wasser.Nach zwei Minuten das entionisierte Wasser entfernen und frisches entionisiertes Wasser hinzufügen, und wiederholen Sie diesen Schritt dann ein zweites Mal. Als nächstes ersetzen Sie das entionisierte Wasser durch kaltes 70%Ethanol. Nach fünf Minuten den Schlitten vorsichtig entfernen, ohne ihn zu kippen und die Luft trocknen zu lassen.Nach dem Trocknen 100 Mikroliter verdünnter DNA-Farbstoff an jedem Punkt hinzufügen und 15 Minuten bei Raumtemperatur warten. Mit einem FITC-Filter in einem Epifluoreszenzmikroskop können Sie insgesamt 50 bis 100 Kometen pro Probe fotografieren. Kultur iPS-abgeleitete Kardiomyozyten, wie im Textprotokoll beschrieben.Um die iPS-abgeleiteten Kardiomyozyten in Kammerrutschen zu sehen, entsorgen Sie zuerst das Kulturmedium aus den Brunnen und waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS. Fügen Sie einen Milliliter 0,25%Trypsin pro Brunnen hinzu und brüten bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten. Überprüfen Sie die Platte unter dem Mikroskop auf Zellablösung.Fügen Sie dann einen Milliliter CMM hinzu, um das Trypsin zu stoppen. Legen Sie die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Rohr und eine Zentrifuge für fünf Minuten bei vier Grad Celsius und 200 mal g. Verwerfen Sie das Medium, fügen Sie einen Milliliter KMG hinzu, und setzen Sie die Zellen erneut aus.Zählen Sie die Zellen und passen Sie die Zellenzahl an, um zwei Millionen Zellen in 1,6 Milliliter CMM zu erhalten. Jetzt samen 200 Mikroliter Zellsuspension pro Brunnen der Acht-Well-Kammerrutsche. Tippen Sie sanft auf die Folie, um die Zellen um den Brunnen zu verteilen.Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius. Für die iPS-abgeleitete Behandlung von Cardiomyozyten Doxorubicin entsorgen Sie das Kulturmedium aus den iPS-abgeleiteten Kardiomyozytenbrunnen und waschen Sie die Zellen mit PBS. Behandeln Sie die Zellen mit einmikromolarem Doxorubicin für vier Stunden bei 37 Grad Celsius.Das Medium ansaugen und die Zellen mit PBS waschen. Um eine Immunkennzeichnung durchzuführen, waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS und fügen Sie jedem Brunnen 200 Mikroliter frisch zubereitetes 4%Paraformaldehyd hinzu. Fixieren Sie die Zellen für 20 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur.Nach dem Waschen der Zellen mit PBS 200 Mikroliter Sperrpuffer pro Brunnen hinzufügen und 30 Minuten in einer befeuchteten Kammer bei Raumtemperatur blockieren. Entfernen Sie den Blockierpuffer und fügen Sie 200 Mikroliter Primärantikörperlösung hinzu. Nach 45 Minuten Inkubation in einer dunklen befeuchteten Kammer bei Raumtemperatur die Brunnen dreimal mit PBS waschen.Entfernen Sie die PBS und fügen Sie 200 Mikroliter sekundären Antikörper-Mix. 45 Minuten in einer dunklen befeuchteten Kammer bei Raumtemperatur inkubieren. Dann waschen Sie die Brunnen dreimal mit PBS.Waschen Sie mit entionisiertem Wasser, bevor Sie die Dias mit Antifade montieren. Legen Sie ein Deckglas, und lagern Sie die Dias im Dunkeln bei vier Grad Celsius. Nehmen Sie mit einem konfokalen Mikroskop drei bis fünf Bilder von Zufallsfeldern pro Probe und fahren Sie mit der Bildanalyse fort.Um die DNA-Schadensreaktionsschwerpunkte zu zählen, laden Sie CellProfiler herunter und installieren Sie es. Wählen Sie Datei, Import, Pipeline aus der Datei aus, und wählen Sie die Pipelinedatei mit dem Namen puncti gamma-H2AX aus. Ziehen Sie den Ordner mit den erfassten Bildern von gamma-H2AX-Fozien zur Analyse in das Dateilistenfenster im Abschnitt Bilder der Eingabemodule.Folgen Sie dann den Anweisungen, wie im Textprotokoll gezeigt. Um die Parameter für die Bilder festzulegen, ziehen Sie das gewünschte Bild zur Analyse in die Dateiliste. Wählen Sie unter Eingabemodulen Bilder aus.Wählen Sie auch in Eingabemodulen Metadaten aus, und wählen Sie dann Namen und Typen aus. Wählen Sie für Gruppen nein aus. Wenn Sie in Analysemodulen arbeiten, wählen Sie Farbe in Grau aus.Wählen Sie dann glatt aus, wählen Sie primäre Objekte identifizieren aus, und wählen Sie erneut glatt aus. Wählen Sie als Nächstes Features verbessern oder unterdrücken aus, und wählen Sie dann primäre Objekte identifizieren aus. Wenn Sie immer noch in Analysemodulen arbeiten, wählen Sie Beziehungsobjekte aus, klassifizieren Sie dann Objekte, und wählen Sie schließlich den Export in die Kalkulationstabelle aus.Klicken Sie im unteren linken Bereich auf Bilder analysieren, um die Bildanalyse durchzuführen. Nach erfolgreichem Abschluss der Analyse werden mehrere Bilder generiert. Beachten Sie die CSV-Datei, die generiert und an der entsprechenden Stelle auf dem Computer gespeichert wird.Diese Datei enthält die quantitativen Daten für die weitere Analyse. In der Tabelle, die mein Experimentbild genannt wird, wird Spalte B die Anzahl der Kerne haben, die bis zu fünf Punkti haben, und Spalte D hat die Anzahl der Kerne, die mehr als fünf Punkti haben. Fügen Sie die Spalten B und D hinzu, um die Gesamtzahl der Kerne abzuerhalten.Wiederholen Sie diese Schritte für alle Bilder, und ändern Sie den Dateinamen meines Experiments vor jeder Analyse. Repräsentative Mikrographien von Kometen aus doxobehandelten und nicht behandelten iPS-Zellen werden hier gezeigt. In iPS-Zellen wurde eine Basalmenge an DNA-Schäden gefunden, ausgedrückt als Bruchteil der DNA-Schäden und des Schwanzmoments.Die Doxo-Behandlung erhöhte jedoch wie erwartet die DNA-Schäden in iPS-Zellen, was darauf hindeutet, dass der Kometentest zur Beurteilung der DNA-Integrität in pluripotenten Stammzellen verwendet werden kann. Repräsentative Mikrographien der Gamma-H2AX-Immunolabeling werden hier bei geringerer Vergrößerung und höherer Vergrößerung gezeigt. Bei der Kontrolle von iPS-abgeleiteten Kardiomyozyten hatten mehr als 90% der Zellen weniger als fünf DDR-Brennpunkte pro Kern.Und insgesamt hatten weniger als 10% der Zellen mehr als sechs DDR-Brennpunkte pro Kern. Bei iPS-abgeleiteten Kardiomyozyten, die sechs Monate lang kultiviert wurden, hatten weniger als 90% der Zellen bis zu fünf DDR-Brennpunkte pro Kerne, und insgesamt hatten mehr als 13% der Zellen mehr als sechs DDR-Brennpunkte pro Kern. Während in den doxo-behandelten iPS-abgeleiteten Kardiomyozyten weniger als 80% der Zellen bis zu fünf DDR-Brennpunkte pro Kern hatten.Und insgesamt hatten etwa 24% der Zellen mehr als sechs DDR-Brennpunkte pro Kern. Diese Daten deuten darauf hin, dass eine verlängerte iPS-abgeleitete Kardiomyozytenzellkultur und Doxo-Behandlung signifikante DNA-Schäden verursachten, wodurch sie für eine Zelltransplantation ungeeignet waren. Es ist sehr wichtig, Variablen beim Mischen der Zellsuspension zu vermeiden, da dies die Elektrophorese beeinflussen könnte.Nach diesem Verfahren können Sie die Kometenassays und die Immunlabeling-Verfahren mit Zellen verschiedener Typen durchführen. Diese Techniken ermöglichen es, Zellen verschiedener Art auf DNA-Schäden zu untersuchen, bevor sie in Zelltransplantationsstudien verwendet werden.

Research

JoVE Journal

Genetics

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

Engineering künstliche Faktoren zur Speziellen Manipulation alternativen Spleißen in menschlichen Zellen

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Forschung

Genetik

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Zuordnung von RNA-RNA-Wechselwirkungen unter Verwendung von biotinyliertem Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Mit Hilfe eines Fluoreszenz-PCR-Kapillar-Gel-Elektrophorese-Technik CRISPR zum Genotyp / Cas9 vermittelte Knock-out Mutanten in einem Hochdurchsatz-Format

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

Ein universelles Protokoll für groß angelegte gRNA Bibliothek Produktion aus jeder DNA-Quelle

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Semi-quantitativen Nachweis von RNA-abhängige RNA-Polymerase-Aktivität des menschlichen Telomerase Reverse Transkriptase Protein

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

DNA-Replikation Timing mit Zebrafisch als ein In Vivo Modell-System-Profiling

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Hocheffiziente gen Störung der murinen und menschlichen hämatopoetischen Vorläuferzellen von CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

Eine kombinatorische einzellige Ansatz zur molekularen Charakterisierung und Immunophenotypic Heterogenität der menschlichen Stammzellen und Vorläuferzellen Populationen

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Isolierung, Charakterisierung und RNA-basierte gentechnische Veränderung von menschlichen Dental follikelstimulierendes Stammzellen

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...