Name: assessing stem cell dna integrity for cardiac cell therapy
Uploaded: 2019-01-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Stem Cell DNA Integrity for Cardiac Cell Therapy at JoVE.com

עבודה זו נתמכת באופן חלקי על ידי הלאומי ללב, ריאות, דם המכון מענקים RO1-HL-99507, HL-114120, HL-131017, HL138023 ו UO1-HL-134764 (כדי ג'יי ג'אנג) ועל -ידי האמריקאי הלב איגוד מדעי מענק פיתוח 17SDG33670677 (ל Kannappan ר).

1. שביט Assay
<ol><li>
ריאגנט הכנה
	<ol>
<li>עבור נקודת ההיתוך הנמוכה agarose, מקום 500 מ"ג agarose התכה נמוכה ב- 100 מ של ה-DNA- / RNA ללא מים. מחממים את הבקבוק בתנור מיקרוגל עד agarose מתמוסס. הניחו את הבקבוק בתוך אמבט מים 37 ° C עד שהוא נדרש. הערה: לקריאה נוספת ראה Azqueta et al., שלמד את ההשפעות של ריכוז agarose ?...

<ol>
	<li>Bolli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+stem+cells+in+patients+with+ischaemic+cardiomyopathy+(SCIPIO):+initial+results+of+a+randomised+phase+1+trial.">Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial.</a> The Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).</li><li>Makkar, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracoronary+cardiosphere-derived+cells+for+heart+regeneration+after+myocardial+infarction+(CADUCEUS):+a+prospective,+randomised+phase+1+trial.">Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial.</a> The Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).</li><li>Tomita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+neural+crest+cells+contribute+to+the+dormant+multipotent+stem+cell+in+the+mammalian+heart.">Cardiac neural crest cells contribute to the dormant multipotent stem cell in the mammalian heart.</a> Journal of Cell Biology. 170 (7), 1135-1146 (2005).</li><li>Oyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+side+population+cells+have+a+potential+to+migrate+and+differentiate+into+cardiomyocytes+in+vitro+and+in+vivo.">Cardiac side population cells have a potential to migrate and differentiate into cardiomyocytes in vitro and in vivo.</a> Journal of Cell Biology. 176 (3), 329-341 (2007).</li><li>Fischer, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+myocardial+regeneration+through+genetic+engineering+of+cardiac+progenitor+cells+expressing+Pim-1+kinase.">Enhancement of myocardial regeneration through genetic engineering of cardiac progenitor cells expressing Pim-1 kinase.</a> Circulation. 120 (21), 2077-2087 (2009).</li><li>Cottage, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+progenitor+cell+cycling+stimulated+by+pim-1+kinase.">Cardiac progenitor cell cycling stimulated by pim-1 kinase.</a> Circulation Research. 106 (5), 891-901 (2010).</li><li>Angert, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+the+injured+adult+heart+involves+new+myocytes+potentially+derived+from+resident+cardiac+stem+cells.">Repair of the injured adult heart involves new myocytes potentially derived from resident cardiac stem cells.</a> Circulation Research. 108 (10), 1226-1237 (2011).</li><li>Kannappan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+Modulates+the+Fate+of+Cardiac+Progenitor+Cells+Ex+vivo+and+in+the+Diabetic+Heart+In+vivo.">p53 Modulates the Fate of Cardiac Progenitor Cells Ex vivo and in the Diabetic Heart In vivo.</a> EBioMedicine. 16, 224-237 (2017).</li><li>Hatzistergos, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+stimulate+cardiac+stem+cell+proliferation+and+differentiation.">Bone marrow mesenchymal stem cells stimulate cardiac stem cell proliferation and differentiation.</a> Circulation Research. 107 (7), 913-922 (2010).</li><li>Okita, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells:+opportunities+and+challenges.">Induced pluripotent stem cells: opportunities and challenges.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1575), 2198-2207 (2011).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cardiomyocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+repair+in+a+porcine+model+of+acute+myocardial+infarction+with+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiovascular+cells.">Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells.</a> Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+high+engraftment+of+patient-specific+cardiomyocyte+sheet+using+induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+adult+cardiac+fibroblast.">Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast.</a> Circulation: Heart Failure. 8 (1), 156-166 (2015).</li><li>Hirakawa, K., Midorikawa, K., Oikawa, S., Kawanishi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carcinogenic+semicarbazide+induces+sequence-specific+DNA+damage+through+the+generation+of+reactive+oxygen+species+and+the+derived+organic+radicals.">Carcinogenic semicarbazide induces sequence-specific DNA damage through the generation of reactive oxygen species and the derived organic radicals.</a> Mutation Research. 536 (1-2), 91-101 (2003).</li><li>Martinez, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+and+alkylating+damage+in+DNA.">Oxidative and alkylating damage in DNA.</a> Mutation Research. 544 (2-3), 115-127 (2003).</li><li>Valko, M., Rhodes, C. J., Moncol, J., Izakovic, M., Mazur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+radicals,+metals+and+antioxidants+in+oxidative+stress-induced+cancer.">Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer.</a> Chemico-Biological Interactions. 160 (1), 1-40 (2006).</li><li>Wiseman, H., Halliwell, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Damage+to+DNA+by+reactive+oxygen+and+nitrogen+species:+role+in+inflammatory+disease+and+progression+to+cancer.">Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species: role in inflammatory disease and progression to cancer.</a> Biochemical Journal. 313 (Pt 1), 17-29 (1996).</li><li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelectrophoretic+study+of+radiation-induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells.">Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 123 (1), 291-298 (1984).</li><li>Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells.">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.</a> Experimental Cell Research. 175 (1), 184-191 (1988).</li><li>Goichberg, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-associated+defects+in+EphA2+signaling+impair+the+migration+of+human+cardiac+progenitor+cells.">Age-associated defects in EphA2 signaling impair the migration of human cardiac progenitor cells.</a> Circulation. 128 (20), 2211-2223 (2013).</li><li>Kannappan, R., Mattapally, S., Wagle, P. A., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivation+domain+of+p53+regulates+DNA+repair+and+integrity+in+human+iPS+cells.">Transactivation domain of p53 regulates DNA repair and integrity in human iPS cells.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. , (2018).</li><li>Al-Baker, E. A., Oshin, M., Hutchison, C. J., Kill, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+UV-induced+damage+and+repair+in+young+and+senescent+human+dermal+fibroblasts+using+the+comet+assay.">Analysis of UV-induced damage and repair in young and senescent human dermal fibroblasts using the comet assay.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 126 (6-7), 664-672 (2005).</li><li>Azqueta, A., Gutzkow, K. B., Brunborg, G., Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+more+reliable+comet+assay:+optimising+agarose+concentration,+unwinding+time+and+electrophoresis+conditions.">Towards a more reliable comet assay: optimising agarose concentration, unwinding time and electrophoresis conditions.</a> Mutation Research. 724 (1-2), 41-45 (2011).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7 (10), R100 (2006).</li><li>Paradis, A. N., Gay, M. S., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binucleation+of+cardiomyocytes:+the+transition+from+a+proliferative+to+a+terminally+differentiated+state.">Binucleation of cardiomyocytes: the transition from a proliferative to a terminally differentiated state.</a> Drug Discovery Today. 19 (5), 602-609 (2014).</li></ol>

שלמות הדנ א מציגה שלמות התא. תאים עם דנ"א פגום הם לעתים קרובות בלחץ, בסופו של דבר מאבד את היושר שלהם. השלמות של גזע, תאי גזע-תא-נגזר להיות מופצים לצורך השתלת הוא עיקרי עבור התאים לביצוע תפקידם הרצוי. משתילים תאים עם דנ"א פגום יגרום קצב engraftment המסכן ובביצועים של8,תא20...

הוכחה ניסויית וקלינית מדגים כי השתלת תא בינוני עשוי לשפר את ביצועי כויץ של החדר השמאלי של כשל לבבות1,2,3,4,5 ,6,7,8,9. ההתקדמות האחרונה נפתחו עוד יותר מושך הזדמנויות עבור התחדשות לב וכלי דם; אלה כוללים את הביטוי כפויה של גורמים התיכנות בתאים סומטיים כדי לגרום pluripotency, להבדיל אלה בתאי גזע pluripotent מושרה (iPSC) לתוך הלב שושלות שונות, חשוב cardiomyocyte (ס מ)10, 11 , 12 , 13. החומר התורשתי בכל תא, כולל iPSCs שנוצר באופן מלאכותי, נגזר iPSC ס"מ (iPS-ס"מ), הוא ה-DNA. ההוראות הגנטי האצור ב- DNA מכתיב את הצמיחה, ופיתוח פונקציה של תאים, רקמות, איברים אורגניזמים. הדנ א אינה אינרטי; תא מטבוליטים, כגון חמצן תגובתי, קרבוניל חנקן מינים, ונזק קטלניים יכול לגרום DNA במבחנה, ויוו14,15,16,17. חשוב לציין, נזק לדנ א מתרחשת באופן אינטואיטיבי בכל תא, עם תדירות משמעותית. אם נזקים אלה לא מתוקנות, זה יוביל מוטציית דנ א, הזדקנות ביולוגית הסלולר, האובדן של ה-DNA של תאים שלמות, ואולי, מחלות, כולל סרטן סכנת חיים. לכן, שמירה על שלמות הדנ א הוא חיוני תא כלשהו, במיוחד iPSCs, בעל פוטנציאל עצום במרפאה.
להערכת את הכמות ואת היושרה של דנ א גנומי מבודד, ציוד יקר זמין על השוק. עם זאת, קיימות שיטות לא פשוטים וחסכוניים כדי להעריך את תקינות ה-DNA בתאים ללא בידוד התאים. יתר על כן, המשתמש-induced השפלה DNA במהלך בידוד ה-DNA הוא אחד החסרונות הגדולים בעוד בשיטות אלה. תא בודד ג'ל אלקטרופורזה (המכונה שביט assay)18,19 , γH2A.X immunolabeling8 הטכניקות הן גישות יסוד במעבדות מחקר להערכת נזק לדנ א. שתי שיטות אלו אינם דורשים ציוד יקר או מבודד הדנ א כדי לנתח DNA שלמות8,20,21. . מאז, טכניקות אלה בוצעו עם תאים שלמים; משתמש-induced השפלה DNA/RNA/חלבון במהלך הכנת המדגם לא ישפיעו על פרוטוקולים אלה. . כאן, כדי להעריך נזק לדנ א של DNA נזק תגובת גזע ותאי גזע-תא-נגזר, אנו מספקים פרוטוקולים שלב אחר שלב כדי לבצע שני את כוכב השביט assay, γH2A.X immunolabeling. יתר על כן, שילוב שתי הגישות האלה, אנו מציעים הערכה תמים יכול לשמש כדי להעריך את התאמתם של התא השתלת.
כוכב השביט assay, או תא בודד ג'ל אלקטרופורזה, מודד את מעברי DNA בתאים. תאים בתוך התכה נמוכה agarose הם lysed כדי nucleoids טופס המכיל supercoiled DNA. על אלקטרופורזה, חתיכות קטנות של DNA מפוצלים ו גדילי DNA שבור נודדים דרך הנקבוביות agarose, ואילו ה-DNA ללא פגע, בשל גודלם העצום שלהם ההטיה עם החלבון מטריקס, תהיה העברה מוגבלת. תבנית ה-DNA מוכתם תחת מיקרוסקופ פלורסצנטיות מחקה כוכב שביט. בראש שביט מכיל דנ א ללא פגע, הזנב הוא מורכב שברים ושבר גדילי ה-DNA. השבר של נזק לדנ א נמדד על ידי קרינה פלואורסצנטית האינטנסיביות של הדנ א פגום (זנב השביט) יחסית העוצמה (ראש שביט) ה-DNA ללא פגע. לרגע הפרמטר הזנב ניתן לחשב כמוצג באיור1.
נזק לדנ א גורם זירחון של היסטון H2A. X (γH2A.X) בשעה Ser139 על-ידי kinases כספומט, ATR ו- DNA-PK. זרחון והגיוס של H2A. X-מעברי גדיל DNA נקרא DNA נזק התגובה (DDR) והוא קורה במהירות לאחר הדנ א פגום. בעקבות תהליך זה, בתיווך מחסום מחזור התא מעצר DNA מבוצעים תהליכים לתיקון. לאחר סיום מוצלח של תיקון ה-DNA, γH2A.X dephosphorylated, מומת על ידי phosphatases. ממושך, מספר מעברי גדיל DNA לגרום להצטברות של γH2A.X מוקדים ב- DNA. הדבר מעיד על חוסר היכולת של התא כדי לתקן את הנזק DNA ואובדן של שלמות הדנ א. מוקדים אלה γH2A.X בדנ א יכול להיות מזוהה על ידי, מספר מוקדים DDR ניתן לספור באמצעות הפרוטוקול בסעיף 2.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slide</td>
			<td>Millicell</td>
			<td>PEZGS0816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td>Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure 
			Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson Immuno 
			Research Laboratories</td>
			<td>711-545-152 
			(RRID: AB_2313584)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson Immuno 
			Research Laboratories</td>
			<td>711-165-152 
			(RRID:AB_2307443)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco B-27 Supplement, Serum Free,</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel growth factor reduced</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhalloidinA488</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2577 (RRID: AB_2118010)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR&#160;Green I nucleic acid gel stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Low melting Point Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Antifade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing stem cell dna integrity for cardiac cell therapy

גזע ותאי גזע-תא-derived יש פוטנציאל עצום כטיפול משובי למחלות ניווניות שונות. DNA למחסן של נתונים גנטיים בתאים כל, לרבות תאי גזע, והיא ושלמותה הוא היסוד הרגנרציה שלו. תאי גזע עוברים התפשטות מהירה במעבדות כדי להשיג את המספרים הדרושים עבור השתלת. גדילת התאים מואצת מוביל אובדן שלמות הדנ א על ידי מטבוליטים שהצטברו, כגון חמצן תגובתי, קרבוניל קטלניים. משתילים תאים אלה היו מסתיימים engraftment המסכן והתחדשות של האיבר המידרדר. יתר על כן, משתילים הפניות תאים פגומים-DNA מוטציות, יציבות של ה-DNA, הזדקנות ביולוגית הסלולר, כנראה, סכנת מחלות כמו סרטן. לכן, יש צורך מיידי שיטה בקרת איכות להעריך את התאמתם של התא השתלת. כאן, אנו מספקים פרוטוקולים צעד אחר צעד ההערכה של שלמות הדנ א של תאי גזע לפני השתלת תא.

תאי גזע pluripotent המושרה האנושי היו תרבותי, לנזק לדנ א ו ברגע הזנב, אשר שימשו כאמצעי של שלמות הדנ א, נותחו על ידי שביט וזמינותו. תאי iPS היו בתוך נקודת ההיתוך הנמוכה agarose והניח על משטח זכוכית. התאים, לאחר מכן, טופלו באמצעות מאגר פירוק, ואחריו פתרון אלקליין, להשיג supercoiled DNA. Nucleoids היו...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Stem Cell DNA Integrity for Cardiac Cell Therapy at JoVE.com

Assessing Stem Cell DNA Integrity for Cardiac Cell Therapy

הערכת תקינות ה-DNA בתאי גזע לטיפול תאי הלב

כאן, אנו מספקים תיאור מפורט של התקנה ניסיונית עבור ניתוח של ההערכה של שלמות ה-DNA בתאי גזע לפני השתלת תא.

Stem and stem-cell-derived cells have immense potential as a regenerative therapy for various degenerative diseases. DNA is the storehouse of genetic data ...

עבור מחלות יילודים כגון קרדיומיופתיה, טיפול רגנרטיבי באמצעות תאים המושרים תאי גזע pluripotent נגזר יש פוטנציאל עצום. עם זאת, צמיחת תאים מואצת במבחנה מובילה לנזק DNA על ידי מטבוליטים מצטברים כגון מיני חמצן תגובתי. השתלת תאים אלה פגועי DNA יגרום תחריט לקוי והתחדשות של האיבר.לפני ההשתלה, יש להעריך את איכות התאים. כאן אנו מספקים שני פרוטוקולים שלב אחר שלב כדי להעריך את נזקי הדנ"א בתאי גזע. הפגנת ההליכים תהיה ג'סיקה מילר, חוקרת, ניקיל מרדהקאר, חוקרת, ווסנטי רג'יסקאראן, טכנאי מעבדה.כדי להתחיל, למקם 500 מיליגרם של אגוארו נמס נמוך ב 100 מיליליטר של מים נטולי DNA-RNA. מחממים את הבקבוק במיקרוגל עד שהתעוררות מתמוססת. לאחר מכן, מניחים את הבקבוק באמבט מים 37 מעלות צלזיוס עד הצורך.להכנת מגלשות שביט מצופות מראש, מניחים כמה טיפות של 0.5% על מגלשת זכוכית. מיד להפיץ את ההתעוררות כדי ליצור שכבה דקה של ציפוי אגרוז באמצעות כיסוי. עובדים בתנאי תאורה נמוכה כדי למנוע נזק לתאים אולטרה סגולים הנגרמים על ידי אור, מערבבים 10 מיקרוליטרים של מתלי תאים ו-90 מיקרוליטרים של תווי אגרוז בצינור.מניחים את הצינור באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס כדי למנוע מהאגוז להתגבש. מערבבים את הפתרון מבלי להכניס בועות אוויר, ו pipette 70 microliters לכל נקודה על מגלשת שביט מצופה מראש. בעזרת קצה פיפטה, מורחים את תערובת התאים ויוצרים שכבה דקה.מניחים את השקופית בארבע מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. בגורם מכיל, שקוע לחלוטין את השקופית במאגר ת ליסיס קר. מניחים את המיכל בחושך בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה.החלף את מאגר התיזה בתתבר אלקליין קר. ודא שהשקופיות שקועות לחלוטין. לאחר השארת המיכל בחושך בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות נוספות, מניחים את השקופית במיכל אלקטרופורזה אופקי.מלאו את המיכל במאגר אלקטרופורזה אלקליין קר עד שהשקופיות יהיה שקוע לחלוטין. יש למרוח מתח בסנטימטר אחד במשך 15 עד 30 דקות. במיכל, שקוע לחלוטין את המגלשה במים קרים deionized.לאחר שתי דקות, להסיר את המים deionized ולהוסיף מים deionized טריים, ולאחר מכן לחזור על צעד זה בפעם השנייה. לאחר מכן, החלף את המים deionized עם קר 70%אתנול. לאחר חמש דקות, להסיר בעדינות את השקופית מבלי להטות אותו ולתת לו אוויר יבש.לאחר התייבשות, להוסיף 100 microliters של צבע DNA מדולל לכל נקודה, ולחכות 15 דקות בטמפרטורת החדר. באמצעות מסנן FITC במיקרוסקופ epifluorescence, לצלם תמונות של 50 עד 100 שביט בסך הכל לכל מדגם. תרבות iPS נגזר קרדיומיוציטים כמתואר בפרוטוקול הטקסט.כדי לראות את הקרדיומיוציטים שמקורם ב- iPS בשקופיות קאמריות, השלך תחילה את מדיום התרבות מה בארות, ושטף את התאים שלוש פעמים עם PBS. מוסיפים מיליליטר אחד של 0.25% טריפסין ל באר, ו דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. בדוק את הצלחת תחת מיקרוסקופ לניתוק תאים.לאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של CMM כדי לעצור את טריפסין. מניחים את ההשעיה התא בצינור 15 מיליליטר וצנטריפוגה במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס ו 200 פעמים g. השלך את המדיום, הוסף מיליליטר אחד של CMM ולחץ מחדש על התאים.ספור את התאים והתאם את ספירת התאים כדי להשיג שני מיליון תאים ב- 1.6 מיליליטר של CMM. עכשיו זרע 200 microliters של השעיית תא ל הבאר של שקופית תא שמונה בארות. הקש על השקופית בעדינות כדי להפיץ את התאים מסביב לרחבה.דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס. לטיפול ב- cardiomyocyte doxorubicin שמקורו ב- iPS, השלך את מדיום התרבות מ בארות קרדיומיוציט שמקורן ב- iPS, ושטוף את התאים עם PBS. לטפל בתאים עם טוקסורוביצין מיקרומולרי אחד במשך ארבע שעות ב 37 מעלות צלזיוס.שאפו את המדיום, ושטפו את התאים עם PBS. כדי לבצע immunolabeling, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS ולהוסיף 200 microliters של טרי מוכן 4% paraformaldehyde לכל באר. לתקן את התאים במשך 20 דקות בחושך בטמפרטורת החדר.לאחר שטיפת התאים עם PBS, להוסיף 200 microliters של חיץ חסימה ל הבאר, ולחסום במשך 30 דקות בתא לח בטמפרטורת החדר. הסר את מאגר החסימה והוסף 200 מיקרוליטרים של פתרון נוגדנים ראשוני. לאחר הדגירה במשך 45 דקות בתא לח כהה בטמפרטורת החדר, לשטוף את בארות שלוש פעמים עם PBS.הסר את PBS ולהוסיף 200 microliters של תערובת נוגדנים משנית. דגירה במשך 45 דקות בתא לח כהה בטמפרטורת החדר. ואז לשטוף את בארות שלוש פעמים עם PBS.לשטוף עם מים deionized לפני הרכבה את המגלשות עם antifade. מניחים כיסוי, ולאחסן את המגלשות בחושך בארבע מעלות צלזיוס. באמצעות מיקרוסקופ קונפוקל, לקחת שלוש עד חמש תמונות של שדות אקראיים לכל מדגם ולהמשיך ניתוח תמונה.כדי לספור את מוקד התגובה נזק DNA, להוריד ולהתקין CellProfiler. בחר קובץ, ייבוא, צינור מהקובץ ובחר את קובץ הצבר בשם puncti gamma-H2AX. גרור ושחרר את התיקיה המכילה את התמונות שנרכשו של מוקדי גאמא-H2AX לחלון רשימת הקבצים בסעיף תמונות מודולי קלט לניתוח.לאחר מכן בצע את ההוראות כפי שמוצג בפרוטוקול הטקסט. כדי להגדיר את הפרמטרים לתמונות, גרור את התמונה הרצויה לניתוח לרשימת הקבצים. תחת מודולי קלט, בחר תמונות.גם במודולים של קלט, בחר מטה-נתונים ולאחר מכן בחר שמות וסוגים. עבור קבוצות, בחר לא. עבודה במודולים ניתוח, לבחור צבע לאפור.לאחר מכן בחרו 'החלק', בחרו 'זהה אובייקטים ראשיים' ובחרו שוב 'חלק'. לאחר מכן בחר שפר או העלם תכונות ולאחר מכן בחר זהה אובייקטים ראשיים. עדיין עובד במודולים ניתוח, לבחור קשר אובייקטים, לאחר מכן לסווג אובייקטים, ולבסוף לבחור ייצוא לגיליון אלקטרוני.לחצו על 'נתח תמונות' בחלונית הימנית התחתונה כדי לבצע ניתוח תמונה. עם השלמתו המוצלחת של הניתוח, נוצרות מספר תמונות. שים לב לקובץ ה- CSV שנוצר ו נשמר במיקום המתאים במחשב.קובץ זה מכיל את הנתונים הכמותיים לניתוח נוסף. בגיליון האלקטרוני שנקרא תמונת הניסוי שלי, בעמודה B יהיה מספר הגרעינים שיש להם עד חמישה פנצ'טי, ולעמודה D יהיה מספר הגרעינים שיש להם יותר מחמישה פנצ'טי. הוסף עמודות B ו- D כדי לקבל את המספר הכולל של גרעינים.חזור על שלבים אלה עבור כל התמונות, שינוי שם קובץ הניסוי שלי לפני כל ניתוח. מיקרוגרפים מייצגים של שביטים מתאים iPS שטופלו בטוקסו ולא טופלו מוצגים כאן. כמות בסיס של נזק לדנ"א נמצאה בתאי IPS, שבאה לידי ביטוי כשבר של נזק לדנ"א ולרגע הזנב.עם זאת, טיפול טוקסו הגדיל את נזק ה-DNA בתאי iPS כצפוי, המציין כי ניתן להשתמש בבדיקת שביט כדי להעריך את שלמות ה- DNA בתאי גזע פלוריפוטנטיים. מיקרוגרפים מייצגים של אימונאבלינג גאמא-H2AX מוצגים כאן, בהגדלה נמוכה יותר ובהגדלה גבוהה יותר. בשליטה iPS נגזר cardiomyocytes, יותר מ 90% של התאים היו פחות מחמישה FOCI DDR לכל גרעיני.ובסך הכל פחות מ-10% מהתאים היו יותר משישה מוקדי DDR לכל גרעינים. עבור קרדיומיוציטים שמקורם ב-iPS במשך שישה חודשים, פחות מ-90% מהתאים היו עד חמישה מוקדי DDR לכל גרעינים, ובסך הכל יותר מ-13% מהתאים היו יותר משישה מוקדי DDR לכל גרעינים. בעוד שבקרדיומיוציטים שטופלו ב-iPS, פחות מ-80% מהתאים היו עד חמישה מוקדי DDR לכל גרעינים.ובסך הכל כ -24% מהתאים היו יותר משישה מוקדי DDR לכל גרעינים. נתונים אלה מצביעים על כך שתרבות תאי קרדיומיוציט ממושכת שמקורה ב- iPS וטיפול בדוקסו גרמו לנזק משמעותי בדנ"א, מה שהופך אותם ללא מתאימים להשתלת תאים. חשוב מאוד להימנע משתנים תוך ערבוב ההשעיה התא, כמו זה עשוי להשפיע על אלקטרופורזה.בעקבות הליך זה, אתה יכול לבצע את בדיקות שביט ואת ההליכים immunolabeling עם תאים מסוגים שונים. טכניקות אלה יאפשרו תאים מסוגים שונים להיות מוערך עבור נזק DNA לפני שימוש במחקרים השתלת תאים.

Research

JoVE Journal

Genetics

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

הנדסה גורמים מלאכותיים כדי לתמרן באופן ספציפי שחבור אלטרנטיבי בתאים אנושיים

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

מיפוי RNA-RNA אינטראקציות גלובלי באמצעות Psoralen Biotinylated

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

באמצעות טכניקה ג&#39;ל אלקטרופורזה פלורסנט PCR-נימי הגנוטיפ קריספר / Cas9 בתיווך נוק מוטאנטים בתוך פורמט תפוקה גבוהה

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

פרוטוקול אוניברסלי עבור gRNA בקנה מידה גדול ספריית הפקה מכל מקור ה-DNA

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

גילוי הכמותיים למחצה של RNA תלוית RNA פולימראז פעילות החלבון רוורס טרנסקריפטאז טלומראז אנושי

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

פרופיל תזמון שכפול ה-DNA באמצעות דג זברה כמערכת מודל In Vivo

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

שיבוש גנטי יעילים ביותר מאתר ואנושי Hematopoietic ובתאים מאת CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

הגישה קומבינטורית תא בודד כדי לאפיין את מולקולרית והטרוגניות Immunophenotypic של גזע האדם ואוכלוסיות קדמון

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

בידוד, אפיון, ההנדסה הגנטית מבוסס-MicroRNA, בתאי גזע אנושיים זקיק שיניים

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...