Name: assessing stem cell dna integrity for cardiac cell therapy
Uploaded: 2019-01-25T14:00:00
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Questo lavoro è stato supportato in parte dal National Heart, Lung e sangue Istituto sovvenzioni RO1-HL-99507, HL-114120, HL-131017, HL138023 e UO1-HL-134764 (a Zhang J.) e dall'American Heart Association scientifico Development Grant 17SDG33670677 (di R. Michel).

1. comet Assay
<ol><li>
Preparazione dei reagenti
	<ol>
<li>Per punto di fusione basso dell'agarosi, porre in 100 mL di DNA - 500 mg di agarosio basso punto di fusione / RNA senza acqua. Riscaldare la bottiglia in un forno a microonde fino a quando si scioglie l'agarosio. Posizionare la bottiglia in un bagno di acqua di 37 ° C fino a quando necessario. Nota: Per approfondimenti, Vedi Azqueta et al., che ha studiato gli effetti della concentrazione di agarosio sul tempo di svolgimen...

<ol>
	<li>Bolli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+stem+cells+in+patients+with+ischaemic+cardiomyopathy+(SCIPIO):+initial+results+of+a+randomised+phase+1+trial.">Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial.</a> The Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).</li><li>Makkar, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracoronary+cardiosphere-derived+cells+for+heart+regeneration+after+myocardial+infarction+(CADUCEUS):+a+prospective,+randomised+phase+1+trial.">Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial.</a> The Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).</li><li>Tomita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+neural+crest+cells+contribute+to+the+dormant+multipotent+stem+cell+in+the+mammalian+heart.">Cardiac neural crest cells contribute to the dormant multipotent stem cell in the mammalian heart.</a> Journal of Cell Biology. 170 (7), 1135-1146 (2005).</li><li>Oyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+side+population+cells+have+a+potential+to+migrate+and+differentiate+into+cardiomyocytes+in+vitro+and+in+vivo.">Cardiac side population cells have a potential to migrate and differentiate into cardiomyocytes in vitro and in vivo.</a> Journal of Cell Biology. 176 (3), 329-341 (2007).</li><li>Fischer, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+myocardial+regeneration+through+genetic+engineering+of+cardiac+progenitor+cells+expressing+Pim-1+kinase.">Enhancement of myocardial regeneration through genetic engineering of cardiac progenitor cells expressing Pim-1 kinase.</a> Circulation. 120 (21), 2077-2087 (2009).</li><li>Cottage, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+progenitor+cell+cycling+stimulated+by+pim-1+kinase.">Cardiac progenitor cell cycling stimulated by pim-1 kinase.</a> Circulation Research. 106 (5), 891-901 (2010).</li><li>Angert, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+the+injured+adult+heart+involves+new+myocytes+potentially+derived+from+resident+cardiac+stem+cells.">Repair of the injured adult heart involves new myocytes potentially derived from resident cardiac stem cells.</a> Circulation Research. 108 (10), 1226-1237 (2011).</li><li>Kannappan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+Modulates+the+Fate+of+Cardiac+Progenitor+Cells+Ex+vivo+and+in+the+Diabetic+Heart+In+vivo.">p53 Modulates the Fate of Cardiac Progenitor Cells Ex vivo and in the Diabetic Heart In vivo.</a> EBioMedicine. 16, 224-237 (2017).</li><li>Hatzistergos, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+stimulate+cardiac+stem+cell+proliferation+and+differentiation.">Bone marrow mesenchymal stem cells stimulate cardiac stem cell proliferation and differentiation.</a> Circulation Research. 107 (7), 913-922 (2010).</li><li>Okita, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells:+opportunities+and+challenges.">Induced pluripotent stem cells: opportunities and challenges.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1575), 2198-2207 (2011).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cardiomyocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+repair+in+a+porcine+model+of+acute+myocardial+infarction+with+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiovascular+cells.">Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells.</a> Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+high+engraftment+of+patient-specific+cardiomyocyte+sheet+using+induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+adult+cardiac+fibroblast.">Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast.</a> Circulation: Heart Failure. 8 (1), 156-166 (2015).</li><li>Hirakawa, K., Midorikawa, K., Oikawa, S., Kawanishi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carcinogenic+semicarbazide+induces+sequence-specific+DNA+damage+through+the+generation+of+reactive+oxygen+species+and+the+derived+organic+radicals.">Carcinogenic semicarbazide induces sequence-specific DNA damage through the generation of reactive oxygen species and the derived organic radicals.</a> Mutation Research. 536 (1-2), 91-101 (2003).</li><li>Martinez, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+and+alkylating+damage+in+DNA.">Oxidative and alkylating damage in DNA.</a> Mutation Research. 544 (2-3), 115-127 (2003).</li><li>Valko, M., Rhodes, C. J., Moncol, J., Izakovic, M., Mazur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+radicals,+metals+and+antioxidants+in+oxidative+stress-induced+cancer.">Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer.</a> Chemico-Biological Interactions. 160 (1), 1-40 (2006).</li><li>Wiseman, H., Halliwell, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Damage+to+DNA+by+reactive+oxygen+and+nitrogen+species:+role+in+inflammatory+disease+and+progression+to+cancer.">Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species: role in inflammatory disease and progression to cancer.</a> Biochemical Journal. 313 (Pt 1), 17-29 (1996).</li><li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelectrophoretic+study+of+radiation-induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells.">Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 123 (1), 291-298 (1984).</li><li>Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells.">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.</a> Experimental Cell Research. 175 (1), 184-191 (1988).</li><li>Goichberg, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-associated+defects+in+EphA2+signaling+impair+the+migration+of+human+cardiac+progenitor+cells.">Age-associated defects in EphA2 signaling impair the migration of human cardiac progenitor cells.</a> Circulation. 128 (20), 2211-2223 (2013).</li><li>Kannappan, R., Mattapally, S., Wagle, P. A., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivation+domain+of+p53+regulates+DNA+repair+and+integrity+in+human+iPS+cells.">Transactivation domain of p53 regulates DNA repair and integrity in human iPS cells.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. , (2018).</li><li>Al-Baker, E. A., Oshin, M., Hutchison, C. J., Kill, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+UV-induced+damage+and+repair+in+young+and+senescent+human+dermal+fibroblasts+using+the+comet+assay.">Analysis of UV-induced damage and repair in young and senescent human dermal fibroblasts using the comet assay.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 126 (6-7), 664-672 (2005).</li><li>Azqueta, A., Gutzkow, K. B., Brunborg, G., Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+more+reliable+comet+assay:+optimising+agarose+concentration,+unwinding+time+and+electrophoresis+conditions.">Towards a more reliable comet assay: optimising agarose concentration, unwinding time and electrophoresis conditions.</a> Mutation Research. 724 (1-2), 41-45 (2011).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7 (10), R100 (2006).</li><li>Paradis, A. N., Gay, M. S., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binucleation+of+cardiomyocytes:+the+transition+from+a+proliferative+to+a+terminally+differentiated+state.">Binucleation of cardiomyocytes: the transition from a proliferative to a terminally differentiated state.</a> Drug Discovery Today. 19 (5), 602-609 (2014).</li></ol>

Integrità del DNA ritrae l'integrità delle cellule. Cellule con DNA danneggiato sono frequentemente nello sforzo e alla fine perdono la loro integrità. L'integrità delle cellule staminali e derivati da cellule staminali che sono essere propagate ai fini del trapianto è principale per le cellule di svolgere la loro funzione desiderata. Trapianto di cellule con DNA danneggiato avrebbe provocato un tasso di attecchimento poveri e prestazioni della cella8,20. Di...

La prova sperimentale e clinica dimostra che il trapianto di cellule moderatamente può migliorare le prestazioni contrattile del ventricolo sinistro della mancata cuori1,2,3,4,5 ,6,7,8,9. Recenti progressi hanno aperto ulteriormente accattivante opportunità per rigenerazione cardiovascolare; Questi includono l'espressione forzata di fattori di riprogrammazione di cellule somatiche per indurre pluripotenza e differenziare queste cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) in diversi lignaggi cardiache, soprattutto del cardiomyocyte (CM)10, 11 , 12 , 13. il materiale ereditario in ogni cellula, compresi i iPSCs generata artificialmente e CM iPSC-derivato (iPS-CM), è il DNA. Le istruzioni genetiche memorizzate nel DNA determina la crescita, lo sviluppo e funzione di cellule, tessuti, organi e organismi. Il DNA non è inerte; metaboliti, come reattivi dell'ossigeno carbonilico e specie dell'azoto, di cella e gli agenti d'alchilazione può DNA causa danni in vitro e in vivo14,15,16,17. D'importanza, il danno del DNA si verifica in modo intuitivo in ogni cellula, con una frequenza significativa. Se questi danni non sono corretti, che porterà a mutazione del DNA, senescenza cellulare, la perdita di integrità del DNA e delle cellule e possibilmente, malattie, compreso i cancri mortali. Quindi, mantenendo l'integrità del DNA è essenziale per qualsiasi cella, soprattutto iPSCs, che ha un enorme potenziale nella clinica.
Per valutare la quantità e l'integrità del DNA genomico isolato, costose attrezzature sono disponibile sul mercato. Tuttavia, non ci sono nessun metodi semplici ed economici per valutare l'integrità del DNA in cellule senza isolare le cellule. Inoltre, utente-indotta di degradazione del DNA durante l'isolamento del DNA è uno dei principali svantaggi nell'uso di questi metodi. Le singole cellule gel elettroforesi (noto come analisi della cometa)18,19 e γH2A.X immunolabeling8 tecniche sono approcci fondamentali nei laboratori di ricerca per valutare il danno del DNA. Questi due metodi non richiedono attrezzature costose o isolato il DNA di genomic per analizzare DNA integrità8,20,21. Da allora, queste tecniche sono state effettuate con cellule intere; degradazione di DNA/RNA/proteina indotta da utente durante la preparazione del campione non influiranno questi protocolli. Qui, per valutare il danno del DNA e la risposta al danno al DNA in cellule staminali e derivati da cellule staminali, forniamo dettagliati protocolli per eseguire sia il comet assay e γH2A.X immunolabeling. Inoltre, la combinazione di questi due approcci, proponiamo una valutazione ingenuo che può essere utilizzata per valutare l'idoneità della cella per il trapianto.
Il test della cometa, o cella singola elettroforesi del gel, misura le rotture del DNA nelle cellule. Incorporato in basso punto di fusione dell'agarosi le cellule vengono lisate per nucleoids modulo contenente DNA supercoiled. All'elettroforesi, piccoli pezzi di DNA frammentato e filamenti di DNA rotti migrano attraverso i pori di agarosio, considerando che il DNA intatto, a causa della loro enorme dimensione e la loro coniugazione con la proteina della matrice, avrà una migrazione con restrizioni. Il modello di DNA macchiato con un microscopio a fluorescenza imita una cometa. La testa di cometa contiene DNA intatto e la coda è composta da frammenti e rotta filamenti di DNA. La frazione di danno del DNA può essere misurata con l'intensità di fluorescenza del DNA danneggiato (coda della cometa) riguardante l'intensità di (testa di cometa) DNA intatto. Il momento di coda di parametro può essere calcolato come illustrato nella Figura 1.
Danno al DNA induce la fosforilazione dell'istone H2A. X (γH2A.X) a Ser139 da chinasi ATM, ATR e DNA-PK. La fosforilazione e l'assunzione di H2A. X alle rotture del filo del DNA si chiama risposta al danno al DNA (DDR) e avviene rapidamente dopo il DNA è danneggiato. A seguito di questo processo, arresto del ciclo cellulare di checkpoint-mediata e DNA vengono avviati processi di riparazione. Dopo il completamento della riparazione del DNA, γH2A.X è defosforilata e inattivato da fosfatasi. Prolungata e più rotture del filo del DNA portano all'accumulo di γH2A.X i fuochi nel DNA. Questo indica l'incapacità delle cellule di riparare il danno del DNA e la perdita di integrità del DNA. Questi focolai γH2A.X nel DNA possono essere identificati da e il numero dei fuochi DDR può essere contato utilizzando il protocollo nella sezione 2.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slide</td>
			<td>Millicell</td>
			<td>PEZGS0816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td>Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure 
			Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson Immuno 
			Research Laboratories</td>
			<td>711-545-152 
			(RRID: AB_2313584)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson Immuno 
			Research Laboratories</td>
			<td>711-165-152 
			(RRID:AB_2307443)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco B-27 Supplement, Serum Free,</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel growth factor reduced</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhalloidinA488</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2577 (RRID: AB_2118010)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR&#160;Green I nucleic acid gel stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Low melting Point Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Antifade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing stem cell dna integrity for cardiac cell therapy

Cellule staminali e derivati da cellule staminali hanno un potenziale immenso come terapia rigenerativa per varie malattie degenerative. Il DNA è il magazzino dei dati genetici in tutte le cellule, comprese le cellule staminali, e la sua integrità è fondamentale per la sua capacità rigenerativa. Cellule staminali subiscono rapida propagazione nei laboratori per ottenere i numeri necessari per il trapianto. Crescita accelerata delle cellule porta alla perdita di integrità del DNA dai metaboliti accumulati, come reattive dell'ossigeno, del carbonilico e agenti alchilanti. Trapianto di queste cellule porterebbe a scarso attecchimento e rigenerazione dell'organo deterioramento. Inoltre, trapiantando cellule con DNA danneggiato porta a mutazioni, instabilità del DNA, senescenza cellulare e possibilmente, life-threatening malattie come il cancro. Di conseguenza, c'è un'esigenza immediata di un metodo di controllo di qualità valutare l'idoneità della cella per il trapianto. Qui, forniamo dettagliate protocolli per la valutazione dell'integrità del DNA delle cellule staminali prima del trapianto di cellule.

Cellule staminali pluripotenti indotte umane sono state coltivate e il danno del DNA e al momento di coda, che sono stati utilizzati come misura dell'integrità del DNA, sono stati analizzati dall'analisi della cometa. le cellule iPS sono state incorporate nell'agarosi di basso-punto di fusione e posti su un vetrino. Le cellule sono state, quindi, trattate con buffer di Lisi, seguita da una soluzione alcalina, per ottenere il DNA supercoiled. Nucleoids erano electrophoresed e comete sono ...

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Assessing Stem Cell DNA Integrity for Cardiac Cell Therapy

Valutazione dell'integrità del DNA di cellule staminali per la terapia cellulare cardiaca

Qui, forniamo una descrizione dettagliata di un apparato sperimentale per un'analisi della valutazione dell'integrità del DNA nelle cellule staminali prima del trapianto di cellule.

Stem and stem-cell-derived cells have immense potential as a regenerative therapy for various degenerative diseases. DNA is the storehouse of genetic data ...

Per le malattie neonatale come la cardiomiopatia, la terapia rigenerativa con cellule staminali pluripotenti indotte ha un enorme potenziale. Tuttavia, la crescita accelerata delle cellule in vitro porta al danno del DNA da parte di metaboliti accumulati come le specie reattive dell'ossigeno. Il trapianto di queste cellule danneggiate dal DNA comporterebbe uno scarso innesto e rigenerazione dell'organo.Prima del trapianto, la qualità delle cellule deve essere valutata. Qui forniamo due protocolli passo-passo per valutare il danno al DNA nelle cellule staminali. A dimostrare le procedure saranno Jessica Miller, ricercatrice, Nikhil Mardhekar, ricercatrice, e Vasanthi Rajasekaran, tecnico di laboratorio.Per iniziare, posizionare 500 milligrammi di agarosio a bassa fusione in 100 millilitri di acqua priva di DNA-RNA. Scaldare la bottiglia in un forno a microonde fino a quando l'agarosio si dissolve. Quindi, posizionare la bottiglia in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius fino a quando necessario.Per preparare diapositive di comete pre-rivestite, posizionare alcune gocce dello 0,5% di agarosio su uno scivolo di vetro. Stendere immediatamente l'agarosio per formare un sottile strato di rivestimento di agarosio utilizzando un copripasta. Lavorando in condizioni di scarsa illuminazione per evitare danni cellulari indotti dalla luce ultravioletta, mescolare 10 microlitri di sospensione cellulare e 90 microlitri di soluzione di agarosio in un tubo.Posizionare il tubo in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius per evitare che l'agarosio si solidifica. Mescolare la soluzione senza introdurre bolle d'aria e pipettare 70 microlitri per punto sul vetrino pre-rivestito. Utilizzando una punta di pipetta, stendere la miscela di agarosio cellulare per formare uno strato sottile.Posizionare la diapositiva a quattro gradi Celsius per 15 minuti. In un contenitore, immergere completamente lo scivolo nel tampone di lysis fredda. Posizionare il contenitore al buio a quattro gradi Celsius per un'ora.Sostituire il tampone di lisi con soluzione alcalina fredda. Assicurarsi che le diapositive siano completamente sommerse. Dopo aver lasciato il contenitore al buio a quattro gradi Celsius per altri 30 minuti, posizionare lo scivolo in un serbatoio di elettroforesi orizzontale.Riempire il serbatoio con tampone di elettroforesi alcalina fredda fino a quando i vetrini sono completamente sommersi. Applicare la tensione a un volt per centimetro per 15-30 minuti. In un contenitore, immergere completamente lo scivolo in acqua fredda deionizzata.Dopo due minuti, rimuovere l'acqua deionizzata e aggiungere acqua fresca deionizzata, quindi ripetere questo passaggio una seconda volta. Quindi, sostituire l'acqua deionizzata con 70% di etanolo freddo. Dopo cinque minuti, rimuovere delicatamente lo scivolo senza inclinarlo e lasciarlo asciugare all'aria.Una volta asciugato, aggiungere 100 microlitri di colorante di DNA diluito in ogni punto e attendere 15 minuti a temperatura ambiente. Utilizzando un filtro FITC in un microscopio a epifluorescenza, scatta immagini da 50 a 100 comete in totale per campione. Cultura cardiomiociti derivati da iPS come descritto nel protocollo di testo.Per vedere i cardiomiociti derivati da iPS nelle diapositive da camera, prima scartare il mezzo di coltura dai pozzi e lavare le cellule tre volte con PBS. Aggiungere un millilitro dello 0,25% di tripside per pozzo e incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Controllare la piastra al microscopio per il distacco cellulare.Quindi aggiungere un millilitro di CMM per fermare la tripina. Posizionare la sospensione cellulare in un tubo da 15 millilitri e centrifugare per cinque minuti a quattro gradi Celsius e 200 volte g. Scartare il mezzo, aggiungere un millilitro di CMM e rimospend le celle.Contare le celle e regolare il conteggio delle celle per ottenere due milioni di celle in 1,6 millilitri di CMM. Ora semina 200 microlitri di sospensione cellulare per pozzo dello scivolo da camera a otto pozzi. Toccare delicatamente la diapositiva per stendere le celle intorno al pozzo.Incubare le cellule a 37 gradi Celsius. Per il trattamento con doxorubicina di cardiomiociti derivato da iPS, scartare il mezzo di coltura dai pozzi cardiomiociti derivati da iPS e lavare le cellule con PBS. Trattare le cellule con doxorubicina un micromolare per quattro ore a 37 gradi Celsius.Aspirare il mezzo e lavare le cellule con PBS. Per eseguire l'immunoetichettatura, lavare le cellule tre volte con PBS e aggiungere 200 microlitri di paraformaldeide al 4% preparata al momento ad ogni pozzo. Fissare le cellule per 20 minuti al buio a temperatura ambiente.Dopo aver lavato le celle con PBS, aggiungere 200 microlitri di tampone di blocco per pozzo e bloccare per 30 minuti in una camera umidificata a temperatura ambiente. Rimuovere il tampone di blocco e aggiungere 200 microlitri di soluzione anticorpale primaria. Dopo aver incubato per 45 minuti in una camera umidificata scura a temperatura ambiente, lavare i pozzi tre volte con PBS.Rimuovere il PBS e aggiungere 200 microlitri di miscela di anticorpi secondari. Incubare per 45 minuti in una camera umidificata scura a temperatura ambiente. Quindi lavare i pozzi tre volte con PBS.Lavare con acqua deionizzata prima di montare gli scivoli con antifade. Posizionare un vetro di copertura e conservare gli scivoli al buio a quattro gradi Celsius. Utilizzando un microscopio confocale, prendi da tre a cinque immagini di campi casuali per campione e procedi all'analisi delle immagini.Per contare i focolai di risposta ai danni del DNA, scaricare e installare CellProfiler. Selezionate file, importate, condotte dal file e scegliete il file della tubazione denominato puncti gamma-H2AX. Trascinare la cartella contenente le immagini acquisite dei fuochi gamma-H2AX nella finestra dell'elenco dei file nella sezione immagini dei moduli di input per l'analisi.Quindi seguire le istruzioni come mostrato nel protocollo di testo. Per impostare i parametri per le immagini, trascinare l'immagine desiderata per l'analisi nell'elenco dei file. In Moduli di input selezionare immagini.Anche nei moduli di input, selezionare i metadati e quindi selezionare nomi e tipi. Per i gruppi, selezionare no. Lavorando nei moduli di analisi, selezionare da colore a grigio.Quindi selezionare smussato, identificare gli oggetti primari e selezionare di nuovo liscio. Selezionare quindi migliora o sopprimere le feature e quindi identificare gli oggetti primari. Ancora lavorando nei moduli di analisi, selezionare Correla oggetti, quindi classificare gli oggetti e infine selezionare esporta in foglio di calcolo.Fate clic su Analizza immagini nel pannello in basso a sinistra per eseguire l'analisi delle immagini. Al completamento dell'analisi, vengono generate diverse immagini. Si noti il file CSV generato e salvato nel percorso appropriato nel computer.Questo file contiene i dati quantitativi per ulteriori analisi. Nel foglio di calcolo chiamato immagine dell'esperimento, la colonna B avrà il numero di nuclei che hanno fino a cinque puncti, e la colonna D avrà il numero di nuclei che hanno più di cinque puncti. Aggiungere le colonne B e D per ottenere il numero totale di nuclei.Ripetere questi passaggi per tutte le immagini, modificando il nome del file dell'esperimento prima di ogni analisi. Qui sono riportate micrografie rappresentative di comete provenienti da cellule iPS non trattate e non trattate. Una quantità basale di danno al DNA è stata trovata nelle cellule iPS, espressa come frazione del danno al DNA e del momento della coda.Tuttavia, il trattamento doxo ha aumentato il danno al DNA nelle cellule iPS come previsto, indicando che il test della cometa può essere utilizzato per valutare l'integrità del DNA nelle cellule staminali pluripotenti. Qui sono mostrate micrografie rappresentative dell'immunoetichettatura gamma-H2AX, con un ingrandimento inferiore e un ingrandimento più elevato. Nei cardiomiociti derivati dall'iPS di controllo, più del 90% delle cellule aveva meno di cinque focolai DDR per nuclei.E un totale di meno del 10% delle cellule aveva più di sei focolai DDR per nuclei. Per i cardiomiociti derivati dall'iPS coltivati per sei mesi, meno del 90% delle cellule aveva fino a cinque focolai DDR per nuclei, e un totale di oltre il 13% delle cellule aveva più di sei focolai DDR per nuclei. Mentre nei cardiomiociti derivati dall'iPS trattati con doxo, meno dell'80% delle cellule aveva fino a cinque focolai DDR per nuclei.E un totale di circa il 24% delle cellule aveva più di sei focolai DDR per nuclei. Questi dati indicano che la coltura prolungata di cellule cardiomiociti derivate da iPS e il trattamento doxo hanno indotto danni significativi al DNA, rendendoli inadatti al trapianto di cellule. È molto importante evitare variabili durante la miscelazione della sospensione cellulare, in quanto ciò potrebbe influire sull'elettroforesi.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire i test delle comete e le procedure di immunoetichettatura con cellule di vari tipi. Queste tecniche consentiranno di valutare cellule di vario tipo per il danno al DNA prima di essere utilizzate negli studi sul trapianto di cellule.

Research

JoVE Journal

Genetics

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

Ingegneria fattori artificiali per manipolare in modo specifico l&#39;alternanza di splicing nelle cellule umane

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Ricerca

Genetica

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Mappatura delle interazioni RNA-RNA globalmente utilizzando Psoralen biotinilato

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Usando una tecnica fluorescente PCR-capillare elettroforesi su gel al genotipo CRISPR / Cas9 mediata Knockout Mutants in un formato high-throughput

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

Un protocollo universale per gRNA su larga scala produzione di libreria da qualsiasi fonte di DNA

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Rilevamento semi-quantitativa dell'attività della RNA polimerasi RNA-dipendente della proteina di Human Telomerase Reverse Transcriptase

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Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Tempo di replicazione del DNA utilizzando Zebrafish come un sistema di modello In Vivo di profilatura

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Rottura del Gene altamente efficiente di cellule progenitrici ematopoietiche Murine ed umane di CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

Una combinatoria unicellulare approccio per la caratterizzazione molecolare e Immunophenotypic eterogeneità del tronco umano e popolazioni di cellule progenitrici

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Isolamento, caratterizzazione e MicroRNA-basato di modificazione genetica di cellule staminali del follicolo dentale umano

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...