Name: assessing stem cell dna integrity for cardiac cell therapy
Uploaded: 2019-01-25T14:00:00
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この作品は、国立心臓、肺、血液研究所助成金 RO1-HL-99507、によって部分で支えられた HL-114120 UO1 HL-134764 (j. 張) に、HL138023、HL 131017、アメリカ心臓協会の科学的な開発補助金 17SDG33670677 (R. Kannappan) します。

1. コメットアッセイ
<ol><li>
試薬の準備
	<ol>
<li>低融点アガロースの低融点アガロースの 500 mg を 100 mL の DNA - に/水の RNA 無料します。Agarose が溶けるまで電子レンジでボトルを加熱します。37 ° C の水浴必要になるまでにボトルを置きます。 注:さらに、DNA の巻き戻しの時間といくつかの電気泳動の要因23agarose 濃度の影響を検討した Azqueta et al., ?...

<ol>
	<li>Bolli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+stem+cells+in+patients+with+ischaemic+cardiomyopathy+(SCIPIO):+initial+results+of+a+randomised+phase+1+trial.">Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial.</a> The Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).</li><li>Makkar, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracoronary+cardiosphere-derived+cells+for+heart+regeneration+after+myocardial+infarction+(CADUCEUS):+a+prospective,+randomised+phase+1+trial.">Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial.</a> The Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).</li><li>Tomita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+neural+crest+cells+contribute+to+the+dormant+multipotent+stem+cell+in+the+mammalian+heart.">Cardiac neural crest cells contribute to the dormant multipotent stem cell in the mammalian heart.</a> Journal of Cell Biology. 170 (7), 1135-1146 (2005).</li><li>Oyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+side+population+cells+have+a+potential+to+migrate+and+differentiate+into+cardiomyocytes+in+vitro+and+in+vivo.">Cardiac side population cells have a potential to migrate and differentiate into cardiomyocytes in vitro and in vivo.</a> Journal of Cell Biology. 176 (3), 329-341 (2007).</li><li>Fischer, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+myocardial+regeneration+through+genetic+engineering+of+cardiac+progenitor+cells+expressing+Pim-1+kinase.">Enhancement of myocardial regeneration through genetic engineering of cardiac progenitor cells expressing Pim-1 kinase.</a> Circulation. 120 (21), 2077-2087 (2009).</li><li>Cottage, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+progenitor+cell+cycling+stimulated+by+pim-1+kinase.">Cardiac progenitor cell cycling stimulated by pim-1 kinase.</a> Circulation Research. 106 (5), 891-901 (2010).</li><li>Angert, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+the+injured+adult+heart+involves+new+myocytes+potentially+derived+from+resident+cardiac+stem+cells.">Repair of the injured adult heart involves new myocytes potentially derived from resident cardiac stem cells.</a> Circulation Research. 108 (10), 1226-1237 (2011).</li><li>Kannappan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+Modulates+the+Fate+of+Cardiac+Progenitor+Cells+Ex+vivo+and+in+the+Diabetic+Heart+In+vivo.">p53 Modulates the Fate of Cardiac Progenitor Cells Ex vivo and in the Diabetic Heart In vivo.</a> EBioMedicine. 16, 224-237 (2017).</li><li>Hatzistergos, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+stimulate+cardiac+stem+cell+proliferation+and+differentiation.">Bone marrow mesenchymal stem cells stimulate cardiac stem cell proliferation and differentiation.</a> Circulation Research. 107 (7), 913-922 (2010).</li><li>Okita, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells:+opportunities+and+challenges.">Induced pluripotent stem cells: opportunities and challenges.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1575), 2198-2207 (2011).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cardiomyocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+repair+in+a+porcine+model+of+acute+myocardial+infarction+with+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiovascular+cells.">Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells.</a> Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+high+engraftment+of+patient-specific+cardiomyocyte+sheet+using+induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+adult+cardiac+fibroblast.">Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast.</a> Circulation: Heart Failure. 8 (1), 156-166 (2015).</li><li>Hirakawa, K., Midorikawa, K., Oikawa, S., Kawanishi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carcinogenic+semicarbazide+induces+sequence-specific+DNA+damage+through+the+generation+of+reactive+oxygen+species+and+the+derived+organic+radicals.">Carcinogenic semicarbazide induces sequence-specific DNA damage through the generation of reactive oxygen species and the derived organic radicals.</a> Mutation Research. 536 (1-2), 91-101 (2003).</li><li>Martinez, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+and+alkylating+damage+in+DNA.">Oxidative and alkylating damage in DNA.</a> Mutation Research. 544 (2-3), 115-127 (2003).</li><li>Valko, M., Rhodes, C. J., Moncol, J., Izakovic, M., Mazur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+radicals,+metals+and+antioxidants+in+oxidative+stress-induced+cancer.">Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer.</a> Chemico-Biological Interactions. 160 (1), 1-40 (2006).</li><li>Wiseman, H., Halliwell, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Damage+to+DNA+by+reactive+oxygen+and+nitrogen+species:+role+in+inflammatory+disease+and+progression+to+cancer.">Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species: role in inflammatory disease and progression to cancer.</a> Biochemical Journal. 313 (Pt 1), 17-29 (1996).</li><li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelectrophoretic+study+of+radiation-induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells.">Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 123 (1), 291-298 (1984).</li><li>Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells.">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.</a> Experimental Cell Research. 175 (1), 184-191 (1988).</li><li>Goichberg, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-associated+defects+in+EphA2+signaling+impair+the+migration+of+human+cardiac+progenitor+cells.">Age-associated defects in EphA2 signaling impair the migration of human cardiac progenitor cells.</a> Circulation. 128 (20), 2211-2223 (2013).</li><li>Kannappan, R., Mattapally, S., Wagle, P. A., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivation+domain+of+p53+regulates+DNA+repair+and+integrity+in+human+iPS+cells.">Transactivation domain of p53 regulates DNA repair and integrity in human iPS cells.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. , (2018).</li><li>Al-Baker, E. A., Oshin, M., Hutchison, C. J., Kill, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+UV-induced+damage+and+repair+in+young+and+senescent+human+dermal+fibroblasts+using+the+comet+assay.">Analysis of UV-induced damage and repair in young and senescent human dermal fibroblasts using the comet assay.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 126 (6-7), 664-672 (2005).</li><li>Azqueta, A., Gutzkow, K. B., Brunborg, G., Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+more+reliable+comet+assay:+optimising+agarose+concentration,+unwinding+time+and+electrophoresis+conditions.">Towards a more reliable comet assay: optimising agarose concentration, unwinding time and electrophoresis conditions.</a> Mutation Research. 724 (1-2), 41-45 (2011).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7 (10), R100 (2006).</li><li>Paradis, A. N., Gay, M. S., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binucleation+of+cardiomyocytes:+the+transition+from+a+proliferative+to+a+terminally+differentiated+state.">Binucleation of cardiomyocytes: the transition from a proliferative to a terminally differentiated state.</a> Drug Discovery Today. 19 (5), 602-609 (2014).</li></ol>

DNA の完全性は、細胞の完全性を描いています。損傷 DNA と細胞ストレスが多いし、最終的にその整合性を失います。幹と幹細胞由来の細胞が移植を目的として伝達されているの整合性は、その目的の機能を実行するセルのプリンシパルです。損傷 DNA と細胞移植生着不全率と細胞8,20のパフォーマンスになります。したがって、細胞移植前に DNA の検...

実験的ならびに臨床的細胞移植することができます心1,2,3,4,5 を失敗して左心室収縮性能を改善して適度に示します ,6,7,8,9。最近の進歩は、心血管の再生のための機会をさらに魅力的な開いています。体細胞に多能性を誘導し、異なる心臓系統、重要な心筋細胞 (CM)10、にこれらの誘導多能性幹細胞 (iPSC) を区別するためにリプログラミング因子の強制発現が含まれます11,12,13。 人工的に生成された Ips と iPSC 由来 CM (iPS CM)、などを含むすべてのセルの遺伝性材料の DNA です。DNA に格納されている遺伝命令は、成長、開発、および細胞、組織、器官、生物の機能を決定します。DNA ではない不活性です。細胞の代謝、活性酸素、カルボニル、窒素種などとアルキル化剤は原因 DNA の in vitro および in vivo で14,15,16,17を傷つけることができます。重要なは、重要な頻度のすべてのセルで直感的に DNA 損傷が発生します。これらの損傷が修正されていない場合それは DNA の突然変異、細胞の老化、DNA ・細胞の整合性、および多分、生命を脅かす癌を含む疾患の損失に します。したがって、DNA の整合性を維持する任意のセル、特にクリニックの巨大な潜在性を持つ Ips に不可欠です。
数量やゲノムの DNA の分離の整合性を評価する高価な機器は市場で利用できます。ただし、セルを孤立させることがなく細胞内 DNA の整合性を評価するためにシンプルでコスト効率の良い方法もありません。さらに、ユーザーによる DNA 分解 DNA の隔離は、これらのメソッドを使用して主な欠点の 1 つです。単細胞ゲル電気泳動 (コメット試験法として知られている)18,19と γH2A.X 反応8テクニックは、DNA 損傷を評価するための研究所の根本的なアプローチ。これらの 2 つの方法では、高価な機器や DNA 整合性8,20,21を分析するゲノム DNA の分離は必要ありません。全体のセル; これらの技術で実行されましたので、サンプル準備の間に DNA、RNA、タンパク質分解のユーザー誘導は、これらのプロトコルには影響を与えません。ここでは、DNA 損傷と幹と幹細胞由来細胞における DNA 損傷応答を査定する、彗星法と γH2A.X 反応の両方を実行するステップバイ ステップのプロトコルを提供します。また、これらの 2 つのアプローチを組み合わせて、移植細胞の適合性を評価するために使用できます素朴な評価を提案します。
コメットアッセイ、または単一セルの電気泳動のゲル、細胞での DNA 切断を測定します。低融点アガロースに埋め込まれた細胞は、スーパー コイル DNA を含むフォーム ユーグレナグラシリスに分離します。彼らの巨大なサイズとマトリックス蛋白質とその活用のため、そのまま DNA は制限された移行を持っているに対し電気泳動に断片化された DNA と壊れた dna の小さな断片はアガロースゲル細孔に移行します。蛍光顕微鏡下でステンド グラスの DNA のパターンは、彗星を模倣します。彗星の頭にそのままな DNA が含まれていると尾を断片で構成され、壊れた dna。DNA 損傷の割合は、そのまま DNA (彗星頭部) 強度を基準にして損傷した DNA (彗星の尾) の蛍光強度が測定できます。図 1に示すように、パラメーター テール モーメントを計算できます。
DNA 損傷は、ヒストン H2A のリン酸化を誘導します。DNA PK、ATR、ATM キナーゼ (γH2A.X) を Ser139 で X。リン酸化と H2A の募集。DNA 鎖切断に X は、DNA 損傷応答 (DDR) と呼び、DNA が破損している後急速に起こる。次のこのプロセス、細胞周期のチェックポイントを介した逮捕、DNA 修復プロセスが開始されます。DNA の修復が正常に完了した後、γH2A.X は脱燐酸化し、脱燐酸化酵素による不活化します。長時間、複数の DNA 鎖切断は、dna γH2A.X 巣の蓄積に 。これは、DNA 損傷と DNA の完全性の損失を修復する細胞のできないことを示します。DNA のこれらの γH2A.X の巣によって識別できます、セクション 2 のプロトコルを使用して DDR 巣の数を数えることができます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slide</td>
			<td>Millicell</td>
			<td>PEZGS0816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td>Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure 
			Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson Immuno 
			Research Laboratories</td>
			<td>711-545-152 
			(RRID: AB_2313584)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson Immuno 
			Research Laboratories</td>
			<td>711-165-152 
			(RRID:AB_2307443)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco B-27 Supplement, Serum Free,</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel growth factor reduced</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhalloidinA488</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2577 (RRID: AB_2118010)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR&#160;Green I nucleic acid gel stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Low melting Point Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Antifade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing stem cell dna integrity for cardiac cell therapy

幹と幹細胞由来細胞様々 な変性疾患の再生治療として大きな可能性があります。DNA は、幹細胞を含むすべてのセル内の遺伝データの倉庫との整合性はその再生能力の基本。幹細胞移植のための必要な数を達成するためにラボでの急速な伝播を受けます。加速された細胞の成長は活性酸素、カルボニル、アルキル化剤など、蓄積した代謝物による DNA の完全性の損失につながります。これらの細胞を移植生着不全と悪化の器官の再生になります。また、突然変異、dna、細胞老化細胞の DNA 損傷リードを移植とおそらく、生命を脅かすがんなどの病気。したがって、移植細胞の適合性を評価するための品質管理法のための即時の必要性があります。ここでは、幹細胞移植前の DNA の完全性の評価手順のプロトコルを提供します。

ひと誘導多能性幹細胞の培養や DNA の完全性の測定として使用された DNA 損傷とテール モーメント コメットアッセイによって分析されました。iPS 細胞は、低融点アガロースに埋め込まれているされ、ガラス スライド上に配置。セルは、スーパー コイル DNA を取得する、アルカリ溶液に続いての換散バッファーと扱われた。ユーグレナグラシリス、electrophoresed し、彗?...

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Assessing Stem Cell DNA Integrity for Cardiac Cell Therapy

心臓の細胞治療幹細胞 DNA の完全性を評価します。

ここでは、幹細胞移植前の DNA の完全性の評価分析のため実験のセットアップの詳細な説明を提供します。

Stem and stem-cell-derived cells have immense potential as a regenerative therapy for various degenerative diseases. DNA is the storehouse of genetic data ...

心筋症などの新生児疾患では、人工多能性幹細胞由来細胞を用いた再生療法は、大きな可能性を秘めています。しかし、インビトロでの細胞増殖の加速は、活性酸素種などの蓄積代謝産物によるDNA損傷をもたらす。これらのDNA損傷細胞を移植すると、臓器の生着と再生が悪くなります。移植前に、細胞の品質を評価する必要があります。ここでは、幹細胞のDNA損傷を評価するための2つのステップバイステッププロトコルを提供します。手順を実証するには、研究者のジェシカ・ミラー、研究者のニヒル・マルデカール、ラボ技術者のヴァサンティ・ラジャセカランが行われます。まず、500ミリグラムの低融解アガロースを100ミリリットルのDNA-RNAフリー水に入れます。アガロースが溶けるまで電子レンジでボトルを加熱します。その後、必要になるまでボトルを摂氏37度の水浴に入れます。あらかじめコーティングされた彗星スライドを準備するには、ガラススライドに0.5%アガロースの数滴を置きます。すぐにアガロースを広げ、カバースリップを使用してアガロースコーティングの薄い層を形成する。紫外線による細胞損傷を避けるために低光条件下で働き、10マイクロリットルの細胞懸濁液と90マイクロリットルのアガロース溶液をチューブに混ぜます。アガロースが固化するのを防ぐために、チューブを摂氏37度の水浴に入れます。気泡を導入せずに溶液を混合し、ピペット70マイクロリットルをスポット当たり、プレコーティングされた彗星スライドに入れる。ピペットチップを用いて、細胞アガロース混合物を広げて薄い層を形成する。スライドを摂氏4度に15分間置きます。容器内で、スライドを冷溶液バッファーに完全に沈めます。容器を暗闇の中に4度摂氏1時間置きます。溶解バッファーを冷アルカリ溶液に交換してください。スライドが完全に統合されていることを確認します。さらに30分間、4°Cで容器を暗闇の中に残した後、水平電気泳動タンクにスライドを置きます。スライドが完全に沈むまで冷アルカリ電気泳動バッファーでタンクを充填します。15~30分間、1ボルト/センチメートルで電圧を印加します。容器に、冷たい脱イオン水でスライドを完全に水に浸す。2分後、脱イオン水を取り出し、新鮮な脱イオン水を加え、このステップをもう一度繰り返します。次に、脱イオン水を冷70%エタノールに交換する。5分後、スライドを傾けずにそっと取り出し、空気を乾燥させます。乾燥したら、各スポットに100マイクロリットルの希釈DNA染料を加え、室温で15分待ちます。FITCフィルターを使用して、蛍光顕微鏡で、サンプルあたり合計50~100個の彗星の画像を撮影します。テキストプロトコルに記載されている培養iPS由来心筋細胞。iPS由来の心筋細胞をチャンバースライドで見るために、まず培養培地をウェルから捨て、PBSで細胞を3回洗浄する。ウェルあたり0.25%トリプシンの1ミリリットルを追加し、5分間摂氏37度でインキュベートします。細胞剥離のために顕微鏡の下でプレートを確認してください。その後、トリプシンを停止するためにCMMの1ミリリットルを追加します。セル懸濁液を15ミリリットルチューブに入れ、遠心分離機を摂氏4度と200倍のgで5分間置きます。培地を捨て、CMMを1ミリリットル加え、細胞を再中断します。セルを数え、CMMの1.6ミリリットルで200万個の細胞を得るために細胞数を調整します。今8ウェルチャンバースライドの井戸ごとに細胞懸濁液の200マイクロリットルをシード。スライドを軽くタップすると、ウェルの周りに細胞が広がります。37°Cで細胞をインキュベートします。iPS由来の心筋細胞ドキソルビシン処理では、iPS由来の心筋細胞のウェルから培養培地を捨て、PBSで細胞を洗浄します。1マイクロモルドキソルビシンで細胞を摂氏37度で4時間治療します。培地を吸引し、細胞をPBSで洗浄する。免疫標識を行うために、PBSで細胞を3回洗浄し、各ウェルに200マイクロリットルの新しく調製した4%パラホルムアルデヒドを加えます。室温で暗い中で20分間細胞を固定します。PBSで細胞を洗浄した後、ウェルあたり200マイクロリットルのブロッキングバッファーを加え、室温で加湿したチャンバーに30分間ブロックします。ブロッキングバッファーを取り外し、200マイクロリットルの一次抗体溶液を添加します。室温で暗い加湿室で45分間インキュベートした後、PBSでウェルを3回洗浄します。PBSを取り除き、2次抗体ミックスの200マイクロリットルを追加します。室温で暗い加湿チャンバーで45分間インキュベートします。その後、PBSで井戸を3回洗います。アンチフェードでスライドを取り付ける前に、脱イオン水で洗います。カバーグラスを置き、スライドを暗闇の中で摂氏4度で保管します。共焦点顕微鏡を使用して、サンプルごとにランダムフィールドの画像を3~5枚撮影し、画像解析に進みます。次に、テキスト プロトコルに示されている手順に従います。画像のパラメータを設定するには、解析対象の画像をファイル リストにドラッグします。入力モジュールで、画像を選択します。また、入力モジュールでメタデータを選択し、名前と型を選択します。グループの場合は、[いいえ] を選択します。分析モジュールで作業し、色をグレーに選択します。次に、[スムーズ]を選択し、プライマリ オブジェクトを特定して、もう一度スムーズを選択します。次に、[フィーチャの拡張または抑制] を選択し、[プライマリ オブジェクトの識別] を選択します。解析モジュールで作業を続け、リレート オブジェクトを選択し、オブジェクトを分類して、最後にスプレッドシートにエクスポートを選択します。左下のパネルで[画像を解析]をクリックして、画像解析を実行します。解析が正常に完了すると、複数の画像が生成されます。CSV ファイルが生成され、コンピューター上の適切な場所に保存されます。このファイルには、さらなる分析のための定量的データが含まれています。私の実験画像と呼ばれるスプレッドシートでは、列Bは最大5つの切妻を持つ核の数を持ち、列Dは5以上の切り球を持つ核の数を持つことになります。列 B と D を追加して、核の総数を取得します。すべての画像に対してこれらの手順を繰り返し、すべての分析の前に私の実験ファイル名を変更します。ドキスト処理および非処理iPS細胞からの彗星の代表的な顕微鏡写真をここに示す。iPS細胞にはDNA損傷の基底量が見られ、DNA損傷と尾の瞬間のほんの一部として表された。しかし、このドキソ処理はiPS細胞のDNA損傷を期待通り増加させ、多能性幹細胞におけるDNA完全性を評価するために彗星アッセイを使用できることを示している。ガンマH2AX免疫標識の代表的な顕微鏡写真は、より低い倍率で、より高い倍率でここに示されている。対照iPS由来心筋細胞では、細胞の90%以上が1核当たり5未満のDDR病巣を有していた。そして、細胞の合計10%未満は、核あたり6以上のDDR病巣を有していた。6ヶ月間培養したiPS由来の心筋細胞の場合、細胞の90%未満は核あたり最大5つのDDR病巣を有し、合計13%以上の細胞が核1核当たり6つ以上のDDR病巣を有していた。一方、ドキソ処理されたiPS由来の心筋細胞では、80%未満の細胞が核あたり最大5つのDDR病巣を有していた。そして、細胞の合計約24%が核あたり6以上のDDR病巣を有していた。このデータは、長期にわたるiPS由来の心筋細胞培養およびドキソ治療が著しいDNA損傷を引き起こしたことを示しており、細胞移植には不向きである。これは電気泳動に影響を与える可能性があるため、細胞懸濁液を混合しながら変数を避けることは非常に重要です。この手順に従って、様々なタイプの細胞を用いて彗星アッセイおよび免疫標識手順を行うことができる。これらの技術は、細胞移植研究に使用される前に、様々な種類の細胞がDNA損傷を評価することを可能にする。

Research

JoVE Journal

Genetics

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

具体的にはヒト細胞における選択的スプライシングを操作するために工学人工要因

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

ビオチン化ソラレンを用いたRNA-RNA相互作用のマッピング

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

ハイスループットフォーマットでの遺伝子型CRISPR / Cas9媒介ノックアウト変異体に蛍光PCR-キャピラリーゲル電気泳動法を用いました

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

大規模な gRNA ライブラリ生産 DNA の任意のソースからの普遍的なプロトコル

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

テロメラーゼ逆転写酵素蛋白質の RNA 依存 RNA ポリメラーゼ活性の半定量的な検出

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

In Vivoモデル システムとしてゼブラフィッシュを用いた DNA 複製タイミングのプロファイリング

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 によるマウスおよび人間の造血前駆細胞の高効率遺伝子破壊

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

組合せの単一セルは分子を特徴付ける方法・肺浸潤異質性ひと幹と前駆細胞集団

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

分離の特性と人間の歯小嚢細胞のマイクロ Rna を用いた遺伝子組み換え

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...