Name: assessing stem cell dna integrity for cardiac cell therapy
Uploaded: 2019-01-25T14:00:00
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이 작품은 국가 심 혼, 폐, 혈액 연구소 보조금 RO1-HL-99507에 의해 부분적으로 지원 HL-114120, HL-131017, HL138023, 및 UO1-HL-134764 (하 제이 장)와 미국 심장 협회 과학적인 개발 그랜트 17SDG33670677 (R. Kannappan)에 의해.

1. 혜성 분석 결과
<ol><li>
시 약 준비
	<ol>
<li>낮은 용 해 점 agarose 낮은 녹는 agarose의 500 mg 100 ml의 DNA-장소/물 RNA-무료. agarose를 녹이 고 때까지 전자 레인지에서 병을 열. 37 ° C 물 목욕까지 필요에 병을 배치 합니다. 참고: 추가 읽기를 위해 Azqueta 그 외 여러분, DNA 해제 시간 및 여러 전기 요소23agarose 농도의 영향을 공부한 참조.</li>
		<li>재고 염료 솔루?...

<ol>
	<li>Bolli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+stem+cells+in+patients+with+ischaemic+cardiomyopathy+(SCIPIO):+initial+results+of+a+randomised+phase+1+trial.">Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial.</a> The Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).</li><li>Makkar, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracoronary+cardiosphere-derived+cells+for+heart+regeneration+after+myocardial+infarction+(CADUCEUS):+a+prospective,+randomised+phase+1+trial.">Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial.</a> The Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).</li><li>Tomita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+neural+crest+cells+contribute+to+the+dormant+multipotent+stem+cell+in+the+mammalian+heart.">Cardiac neural crest cells contribute to the dormant multipotent stem cell in the mammalian heart.</a> Journal of Cell Biology. 170 (7), 1135-1146 (2005).</li><li>Oyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+side+population+cells+have+a+potential+to+migrate+and+differentiate+into+cardiomyocytes+in+vitro+and+in+vivo.">Cardiac side population cells have a potential to migrate and differentiate into cardiomyocytes in vitro and in vivo.</a> Journal of Cell Biology. 176 (3), 329-341 (2007).</li><li>Fischer, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+myocardial+regeneration+through+genetic+engineering+of+cardiac+progenitor+cells+expressing+Pim-1+kinase.">Enhancement of myocardial regeneration through genetic engineering of cardiac progenitor cells expressing Pim-1 kinase.</a> Circulation. 120 (21), 2077-2087 (2009).</li><li>Cottage, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+progenitor+cell+cycling+stimulated+by+pim-1+kinase.">Cardiac progenitor cell cycling stimulated by pim-1 kinase.</a> Circulation Research. 106 (5), 891-901 (2010).</li><li>Angert, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+the+injured+adult+heart+involves+new+myocytes+potentially+derived+from+resident+cardiac+stem+cells.">Repair of the injured adult heart involves new myocytes potentially derived from resident cardiac stem cells.</a> Circulation Research. 108 (10), 1226-1237 (2011).</li><li>Kannappan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+Modulates+the+Fate+of+Cardiac+Progenitor+Cells+Ex+vivo+and+in+the+Diabetic+Heart+In+vivo.">p53 Modulates the Fate of Cardiac Progenitor Cells Ex vivo and in the Diabetic Heart In vivo.</a> EBioMedicine. 16, 224-237 (2017).</li><li>Hatzistergos, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+stimulate+cardiac+stem+cell+proliferation+and+differentiation.">Bone marrow mesenchymal stem cells stimulate cardiac stem cell proliferation and differentiation.</a> Circulation Research. 107 (7), 913-922 (2010).</li><li>Okita, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells:+opportunities+and+challenges.">Induced pluripotent stem cells: opportunities and challenges.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1575), 2198-2207 (2011).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cardiomyocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+repair+in+a+porcine+model+of+acute+myocardial+infarction+with+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiovascular+cells.">Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells.</a> Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+high+engraftment+of+patient-specific+cardiomyocyte+sheet+using+induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+adult+cardiac+fibroblast.">Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast.</a> Circulation: Heart Failure. 8 (1), 156-166 (2015).</li><li>Hirakawa, K., Midorikawa, K., Oikawa, S., Kawanishi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carcinogenic+semicarbazide+induces+sequence-specific+DNA+damage+through+the+generation+of+reactive+oxygen+species+and+the+derived+organic+radicals.">Carcinogenic semicarbazide induces sequence-specific DNA damage through the generation of reactive oxygen species and the derived organic radicals.</a> Mutation Research. 536 (1-2), 91-101 (2003).</li><li>Martinez, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+and+alkylating+damage+in+DNA.">Oxidative and alkylating damage in DNA.</a> Mutation Research. 544 (2-3), 115-127 (2003).</li><li>Valko, M., Rhodes, C. J., Moncol, J., Izakovic, M., Mazur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+radicals,+metals+and+antioxidants+in+oxidative+stress-induced+cancer.">Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer.</a> Chemico-Biological Interactions. 160 (1), 1-40 (2006).</li><li>Wiseman, H., Halliwell, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Damage+to+DNA+by+reactive+oxygen+and+nitrogen+species:+role+in+inflammatory+disease+and+progression+to+cancer.">Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species: role in inflammatory disease and progression to cancer.</a> Biochemical Journal. 313 (Pt 1), 17-29 (1996).</li><li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelectrophoretic+study+of+radiation-induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells.">Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 123 (1), 291-298 (1984).</li><li>Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells.">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.</a> Experimental Cell Research. 175 (1), 184-191 (1988).</li><li>Goichberg, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-associated+defects+in+EphA2+signaling+impair+the+migration+of+human+cardiac+progenitor+cells.">Age-associated defects in EphA2 signaling impair the migration of human cardiac progenitor cells.</a> Circulation. 128 (20), 2211-2223 (2013).</li><li>Kannappan, R., Mattapally, S., Wagle, P. A., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivation+domain+of+p53+regulates+DNA+repair+and+integrity+in+human+iPS+cells.">Transactivation domain of p53 regulates DNA repair and integrity in human iPS cells.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. , (2018).</li><li>Al-Baker, E. A., Oshin, M., Hutchison, C. J., Kill, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+UV-induced+damage+and+repair+in+young+and+senescent+human+dermal+fibroblasts+using+the+comet+assay.">Analysis of UV-induced damage and repair in young and senescent human dermal fibroblasts using the comet assay.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 126 (6-7), 664-672 (2005).</li><li>Azqueta, A., Gutzkow, K. B., Brunborg, G., Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+more+reliable+comet+assay:+optimising+agarose+concentration,+unwinding+time+and+electrophoresis+conditions.">Towards a more reliable comet assay: optimising agarose concentration, unwinding time and electrophoresis conditions.</a> Mutation Research. 724 (1-2), 41-45 (2011).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7 (10), R100 (2006).</li><li>Paradis, A. N., Gay, M. S., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binucleation+of+cardiomyocytes:+the+transition+from+a+proliferative+to+a+terminally+differentiated+state.">Binucleation of cardiomyocytes: the transition from a proliferative to a terminally differentiated state.</a> Drug Discovery Today. 19 (5), 602-609 (2014).</li></ol>

DNA 무결성을 셀 무결성을 그렸다. 손상된 DNA와 세포 스트레스에 자주 하 고 결국 그들의 완전성을 잃고. 줄기와 줄기 세포 유래 세포 이식 목적으로 전파 되 고 되는 그들의 원하는 기능을 수행 하는 셀에 대 한 주은. 손상된 DNA와 세포 이식 셀8,20의 성능과 가난한 engraftment 속도 발생할 것 이다. 따라서, 세포 이식 전에 DNA 무결성 검사는 필요한 품질 관리...

실험 및 임상 증거 세포 이식 적당히 마음1,2,,34,5 실패의 좌 심 실 수축 성능을 향상 시킬 수 보여줍니다. ,6,7,,89. 최근 진보 심혈 관 재생;에 대 한 기회를 더 매력적인 연 이러한 체세포 pluripotency 유도 다른 심장 계보, 중요 한 것은 cardiomyocyte (CM)10, 으로이 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)를 구분 하기에 재활 요인의 강제 식 포함 11 , 12 , 13. 인위적으로 생성 된 Ipsc, iPSC 파생 CM (iPS-CM)를 포함 하 여 모든 세포에서 유전 물질은 DNA. DNA에 저장 된 유전 지시 지시 성장, 개발 및 셀, 조직, 장기, 그리고 유기 체 기능. DNA는 불활성; 세포 대사 산물, 반응성 산소, 생성, 질소 종 등 하 고 에이전트 alkylating 손상 될 수 있습니다 원인 DNA 생체 외에서 그리고 vivo에서14,15,,1617. 중요 한 것은, DNA 손상 중요 한 주파수를 가진 모든 셀에 직관적으로 발생합니다. 경우 이러한 손해는 해결 되지 않으면, 그것은 DNA 돌연변이, 세포 노화, DNA와 세포 무결성, 그리고 아마도, 질병, 생명을 위협 하는 암 등의 손실 이어질 것입니다. 따라서, DNA 무결성 유지 특히 Ipsc, 병원에서 엄청난 잠재력을 가진 어떤 셀에 필수적 이다.
수량 및 고립 된 게놈 DNA의 무결성을 평가, 고가의 장비 시장에 유효 하다. 그러나, 셀을 분리 하지 않고 셀에 DNA 무결성을 평가 하기 위해 아무 간단 하 고 비용 효율적인 방법이 있다. 또한, DNA 분리 하는 동안 DNA 저하 사용자 유도 이러한 메서드를 사용 하 여 주요 단점 중 하나입니다. 단일 셀 젤 전기 이동 법 (혜성 분석 결과 라고도 함)18,19 와 γH2A.X immunolabeling8 기술 연구 실험실에서 DNA 손상 평가 대 한 근본적인 접근 있습니다. 이러한 두 가지 방법 고가의 장비 또는 DNA 무결성8,,2021분석 하 고립 된 게놈 DNA를 필요 하지 않습니다. 이후, 이러한 기술은 전체 셀; 수행 되었습니다. 샘플 준비 하는 동안 사용자 유도 DNA/RNA/단백질 저하는 이러한 프로토콜에 영향을 미치지 않습니다. 여기, DNA 손상 및 줄기와 줄기 세포 유래 세포에서 DNA 손상 응답 평가, 우리 혜성 분석 결과 및 γH2A.X immunolabeling를 모두 수행 하는 단계별 프로토콜을 제공 합니다. 또한, 결합이 두 가지 방법, 제안 한다 순진한 평가 이식에 대 한 셀의 적합성을 평가 하는 데 사용할 수 있습니다.
혜성 분석 결과, 또는 단일 셀 젤 전기 이동 법, 세포에서 DNA 나누기를 측정 한다. 낮은 녹는 agarose에 포함 된 셀은 supercoiled DNA를 포함 하는 양식 nucleoids을 lysed. 전기 이동 법, 그들의 거 대 한 크기와 매트릭스 단백질 그들의 활용 그대로 DNA 제한 마이그레이션 갖습니다 반면 agarose 숨 구멍을 통해 작은 조각 조각난된 DNA와 깨진된 DNA 가닥의 마이그레이션합니다. 형광 현미경으로 얼룩진된 DNA의 패턴은 혜성을 모방합니다. 그대로 DNA를 포함 하는 혜성 머리와 꼬리 조각의 구성 및 고장 DNA 가닥. DNA 손상의 분수는 그대로 DNA (혜성 머리) 강도 기준으로 손상 된 DNA (혜성 꼬리)의 형광 강도 의해 측정할 수 있습니다. 그림 1과 같이 매개 변수 꼬리 순간을 계산할 수 있습니다.
DNA 손상 히스톤 H2A의 인 산화를 유도 한다. ATM, ATR, 및 DNA-PK kinases 여 Ser139에서 (γH2A.X) X. 인 산화 그리고 H2A의 모집입니다. DNA 가닥 나누기에서 X DNA 손상 응답 (DDR) 이라고 하 고 DNA 손상 후 급속 하 게 일어난다. 이 과정, 세포 주기 검문소 중재 체포 및 DNA 복구 프로세스가 시작 됩니다. DNA 수리 완료 후 γH2A.X dephosphorylated 이며 가수분해에 의해 비활성화. 연장 하 고 여러 개의 DNA 가닥 나누기 DNA에 γH2A.X foci의 축적으로 이어질. 이 DNA 손상 및 DNA 무결성의 손실 복구 하 셀의 무 능력을 나타냅니다. 이러한 γH2A.X foci DNA에 의해 확인 될 수 있다 그리고 2 절에서 프로토콜을 사용 하 여 DDR foci의 수를 계산 하실 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slide</td>
			<td>Millicell</td>
			<td>PEZGS0816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td>Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure 
			Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson Immuno 
			Research Laboratories</td>
			<td>711-545-152 
			(RRID: AB_2313584)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson Immuno 
			Research Laboratories</td>
			<td>711-165-152 
			(RRID:AB_2307443)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco B-27 Supplement, Serum Free,</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel growth factor reduced</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhalloidinA488</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2577 (RRID: AB_2118010)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR&#160;Green I nucleic acid gel stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Low melting Point Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Antifade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing stem cell dna integrity for cardiac cell therapy

줄기 줄기 세포 유래 세포는 다양 한 퇴행 성 질환 재생 치료로 서 엄청난 잠재력이 있다. DNA는 줄기 세포를 포함 하 여 모든 셀에서 유전 정보의 창 고입니다 그리고 그것의 무결성은 재생 능력에 기본적 이다. 줄기 세포가 식 위한 필요한 수를 달성 하기 위해 실험실에서 급속 한 전파를 받 다. 빠른된 세포 성장 반응 산소, 생성, 에이전트 alkylating 등 축적 된 대사 산물에 의해 DNA 무결성의 손실에 지도 한다. 이 세포를 이식 가난한 engraftment 및 악화 장기의 재생 발생할 것 이다. 또한, 돌연변이, DNA 불안정, 세포 노화, DNA 손상 세포 리드를 이식 하 고 가능 하 게, 생명이 암 같은 질병. 따라서,이 식 위한 세포의 적합성을 평가 하는 품질 관리 방법에 대 한 즉각적인 필요가 있다. 여기, 우리는 이전에 세포 이식 줄기 세포의 DNA 무결성의 평가 대 한 단계별 프로토콜을 제공합니다.

인간 유도 만능 줄기 세포를 배양 하 고 DNA 무결성의 측정으로 사용 되었다, DNA 손상 및 꼬리 순간 혜성 분석 결과 의해 분석 되었다. iPS 세포는 낮은 녹는 점 agarose에 포함 되었고 유리 슬라이드에 배치. 셀, 다음, 세포의 용 해 버퍼, 이어서 supercoiled DNA를 알칼리 성 해결책으로 취급 됩니다. Nucleoids electrophoresed 했다 고 혜성 DNA 염료 (그림 1A-D</str...

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Assessing Stem Cell DNA Integrity for Cardiac Cell Therapy

심장 세포 치료를 위한 줄기 세포 DNA 무결성을 평가

여기, 우리 세포 이식 전에 줄기 세포에서 DNA 무결성의 평가의 분석 실험 설정에 대 한 자세한 설명을 제공합니다.

Stem and stem-cell-derived cells have immense potential as a regenerative therapy for various degenerative diseases. DNA is the storehouse of genetic data ...

심근병증과 같은 신생아 질환의 경우, 유도된 만능 줄기 세포 유래 세포를 이용한 재생 요법은 엄청난 잠재력을 갖는다. 그러나, 체외 가속 세포 성장은 반응성 산소 종과 같은 축적된 대사산물에 의한 DNA 손상으로 이어집니다. 이 DNA 손상한 세포를 이식하는 것은 기관의 나쁜 이식 및 재생 귀착될 것입니다.이식하기 전에 세포의 품질을 평가해야합니다. 여기서 우리는 줄기 세포의 DNA 손상을 평가하기 위하여 2개의 단계별 프로토콜을 제공합니다. 절차를 시연하는 것은 제시카 밀러, 연구원, 니킬 마르데카르, 연구원, 바산티 라자세카란, 실험실 기술자가 될 것입니다.먼저, DNA-RNA 프리 워터 100 밀리리터에 500밀리그램의 저용 아가로즈를 배치하십시오. 아가로즈가 녹을 때까지 전자 레인지에 병을 가열합니다. 그런 다음 병은 필요할 때까지 섭씨 37도의 수조에 놓습니다.미리 코팅된 혜성 슬라이드를 준비하려면 유리 슬라이드에 0.5% 아가로즈 몇 방울을 놓습니다. 즉시 아가로즈를 확산하여 커버슬립을 사용하여 아가로즈 코팅의 얇은 층을 형성한다. 자외선으로 인한 세포 손상을 피하기 위해 저조도 조건에서 작업하고, 10 마이크로리터의 세포 현탁액과 90 마이크로리터의 아가로즈 용액을 튜브에 혼합합니다.아가로즈가 고화되는 것을 방지하기 위해 튜브를 섭씨 37도 의 수조에 놓습니다. 기포를 도입하지 않고 솔루션을 혼합하고, 피펫 70 마이크로리터는 미리 코팅된 혜성 슬라이드에 자리한 자리당 70마이크로리터를 제공합니다. 파이펫 팁을 사용하여 세포 아가로즈 혼합물을 확산하여 얇은 층을 형성합니다.슬라이드를 섭씨 4도에 15분간 놓습니다. 용기에 차가운 리시스 버퍼에 슬라이드를 완전히 잠급합니다. 용기를 1시간 동안 섭씨 4도에 어둠 안에 놓습니다.용해 버퍼를 차가운 알칼리성 솔루션으로 교체합니다. 슬라이드가 완전히 잠겨 있는지 확인합니다. 또 다른 30 분 동안 4섭씨에서 어둠 속에서 컨테이너를 떠난 후, 수평 전기 전도 탱크에 슬라이드를 배치합니다.슬라이드가 완전히 잠기면 탱크를 차가운 알칼리성 전기 포충제 버퍼로 채웁니다. 15~30분 동안 1볼트의 전압을 1센티미터로 바에 바치면 됩니다. 용기에 차가운 탈이온 물에 슬라이드를 완전히 잠급합니다.2분 후, 탈이온된 물을 제거하고 신선한 탈이온수를 추가한 다음 이 단계를 두 번째로 반복합니다. 다음으로, 탈이온수를 차가운 70%에탄올로 바꿉다. 5분 후, 슬라이드를 기울이지 않고 부드럽게 제거하고 공기를 건조하게 합니다.일단 건조되면, 각 지점에 희석 된 DNA 염료 100 마이크로 리터를 추가하고 실온에서 15 분을 기다립니다. 피플루오렌스 현미경에서 FITC 필터를 사용하여 샘플 당 총 50~100개의 혜성 이미지를 가져가십시오. 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 문화 iPS 유래 심근세포.챔버 슬라이드에서 iPS 유래 심근세포를 보려면 먼저 우물에서 배양 배지를 버리고 PBS로 세포를 세 번 세척하십시오. 잘 하면 0.25%의 1밀리리터를 추가하고 5분간 섭씨 37도에서 배양합니다. 세포 분리를 위해 현미경의 밑에 접시를 확인하십시오.그런 다음 트립신을 중지 CMM의 1 밀리리터를 추가합니다. 세포 현탁액을 섭씨 4도에서 5분간 원심분리기와 원심분리기에 200배나 배치합니다. 매체를 폐기하고 CMM의 밀리리터 1밀리리터를 추가하고 셀을 다시 일시 중지합니다.세포를 계산하고 CMM의 1.6 밀리리터에서 2백만 개의 세포를 얻기 위해 세포 수를 조정합니다. 이제 8웰 챔버 슬라이드의 웰 당 셀 서스펜션의 200 마이크로 리터를 시드. 슬라이드를 부드럽게 눌러 셀을 우물 주위에 분산시다.섭씨 37도에서 세포를 배양합니다. iPS 유래 심근세포 독소루비신 치료의 경우, iPS 유래 심근세포 유정으로부터 배양 배지를 버리고 PBS로 세포를 세척한다. 섭씨 37도에서 4시간 동안 1마이크로몰러 독소비신으로 세포를 치료하십시오.매체를 흡인하고 PBS로 세포를 씻으세요. 면역 라벨링을 수행하려면 PBS로 세포를 세 번 씻고 새로 준비된 4% 파라포름알데히드 200마이크로리터를 각 웰에 추가합니다. 실온에서 어둠 속에서 20 분 동안 셀을 고정합니다.PBS로 세포를 세척한 후, 우물당 200마이크로리터의 블로킹 버퍼를 추가하고 실온에서 가습 챔버에서 30분 동안 차단합니다. 차단 버퍼를 제거하고 1 차 항체 용액의 200 마이크로 리터를 추가합니다. 실온에서 어두운 가습 챔버에서 45 분 동안 배양 한 후 PBS로 우물을 세 번 씻으시다.PBS를 제거하고 이차 항체 믹스의 200 마이크로 리터를 추가합니다. 실온에서 어두운 가습 챔버에서 45 분 동안 배양하십시오. 그런 다음 PBS로 우물을 세 번 씻으시면 됩니다.페이드 페이드로 슬라이드를 장착하기 전에 탈이온물로 씻으십시오. 커버 글래스를 놓고 슬라이드를 섭씨 4도에 어둠 속에서 보관합니다. 공초점 현미경을 사용하여 샘플 당 무작위 필드의 3 ~ 5 개의 이미지를 가지고 이미지 분석을 진행합니다.DNA 손상 응답 포시를 계산하려면 CellProfiler를 다운로드하고 설치하십시오. 파일, 가져오기, 파이프라인을 선택하고 puncti 감마-H2AX라는 파이프라인 파일을 선택합니다. 감마-H2AX 초점의 획득된 이미지가 포함된 폴더를 분석을 위해 입력 모듈 이미지 섹션의 파일 목록 창에 드래그 앤 드롭합니다.그런 다음 텍스트 프로토콜에 표시된 대로 지침을 따릅니다. 이미지에 대한 매개 변수를 설정하려면 분석을 위해 원하는 이미지를 파일 목록에 드래그합니다. 입력 모듈에서 이미지를 선택합니다.또한 입력 모듈에서 메타데이터를 선택한 다음 이름과 유형을 선택합니다. 그룹의 경우 아니요를 선택합니다. 분석 모듈에서 작업할 경우 색상을 회색으로 선택합니다.그런 다음 매끄러운 선택을 선택하고 기본 개체를 식별하고 다시 원활하게 선택합니다. 그런 다음 피쳐를 향상시키거나 억제한 다음 기본 개체 식별을 선택합니다. 여전히 분석 모듈에서 작업하고 관련 개체를 선택한 다음 개체를 분류한 다음 마지막으로 스프레드시트로 내보내기를 선택합니다.왼쪽 아래 패널의 이미지를 분석하여 이미지 분석을 수행합니다. 분석이 성공적으로 완료되면 여러 이미지가 생성됩니다. 생성되어 컴퓨터의 적절한 위치에 저장되는 CSV 파일을 확인합니다.이 파일에는 추가 분석을 위한 정량적 데이터가 포함되어 있습니다. 내 실험 이미지라고 하는 스프레드시트에서, 열 B는 최대 5개의 펑크를 갖는 핵의 수를 가지며, 열 D는 5개 이상의 펑크를 갖는 핵의 수를 가질 것이다. 컬럼 B와 D를 추가하여 총 핵 수를 가져옵니다.모든 이미지에 대해 다음 단계를 반복하여 모든 분석 전에 내 실험 파일 이름을 변경합니다. 독소 처리 및 비처리 iPS 세포에서 혜성의 대표적인 현미경 표는 여기에서 도시된다. DNA 손상의 기저 양은 IPS 세포에서 발견되었으며, DNA 손상및 꼬리 모멘절의 일부로 표현되었습니다.그러나, 독소 치료는 예상대로 iPS 세포에서 DNA 손상을 증가시켰으며, 혜성 분석체가 다능성 줄기 세포에서 DNA 무결성을 평가하는 데 사용될 수 있음을 나타낸다. 감마-H2AX 면역 라벨링의 대표적인 현미경 사진은 낮은 배율과 더 높은 배율로 여기에 표시됩니다. 대조군 iPS 유래 심근세포에서, 세포의 90% 이상이 핵당 5개 미만의 DDR 포시를 가졌다.그리고 세포의 10% 미만의 총 핵 당 6 개 이상의 DDR foci했다. 6개월 동안 배양된 iPS 유래 심근세포의 경우, 세포의 90% 미만은 핵당 최대 5개의 DDR 포시를 가지고 있었으며, 세포의 총 13% 이상이 핵당 6개 이상의 DDR foci를 가졌다. 독소 처리된 iPS 유래 심근세포에서 반면, 세포의 80% 미만은 핵당 최대 5개의 DDR foci를 가졌다.그리고 세포의 대략 24%의 총에는 핵 당 6개 이상의 DDR foci가 있었습니다. 이 데이터는 장기간 iPS 유래 심근 세포 배양 및 독소 처리가 중요한 DNA 손상을 유도한다는 것을 나타내지 않으며, 세포 이식에 적합하지 않습니다. 이 전기 포에 영향을 미칠 수 있기 때문에 세포 현탁액을 혼합하는 동안 변수를 피하는 것이 매우 중요합니다.이 절차에 따라, 당신은 혜성 분석 및 다양한 유형의 세포와 면역 라벨링 절차를 수행 할 수 있습니다. 이 기술은 세포 이식 연구 결과에서 이용되기 전에 각종 종류의 세포가 DNA 손상을 위해 평가될 수 있게 할 것입니다.

Research

JoVE Journal

Genetics

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

인공 요소 엔지니어 것은 특히 인간 세포에서의 스 플라이 싱을 조작 할

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

연구

유전학

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Biotinylated Psoralen을 사용하여 RNA-RNA 상호 작용을 세계적으로 매핑

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

CRISPR을 유전자형하기 위해 형광 PCR-모세관 젤 전기 영동 기술을 사용 / 높은 처리량 형식으로 녹아웃 돌연변이를 Cas9 매개

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

대규모 gRNA DNA 소스에서 라이브러리 제작에 대 한 범용 프로토콜

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

인간의 Telomerase 역전사 단백질의 RNA 의존 RNA 중 합 효소 활동의 반 정량적 검출

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

DNA 복제 타이밍 Zebrafish Vivo에서 모델 시스템으로 사용 하 여 프로 파일링

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9에 의해 Murine 인간과 조 혈 조상 세포의 고효율 유전자 장애

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

분자 특성 조합 단일 셀 접근 및 인간의 줄기 및 조상 인구 Immunophenotypic이

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

절연, 특성화 및 예측에 관한 기반 유전자 조작 인간 치과 여 포 줄기 세포의

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...