Name: assessing stem cell dna integrity for cardiac cell therapy
Uploaded: 2019-01-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Stem Cell DNA Integrity for Cardiac Cell Therapy at JoVE.com

Dette arbeidet var støttes delvis av nasjonale hjerte, lunge og blod Institute tilskudd RO1-HL-99507, HL-114120, HL-131017, HL138023 og UO1-HL-134764 (å J. Zhang) og American Heart Association vitenskapelige Development Grant 17SDG33670677 (til R. Kannappan).

1. comet analysen
<ol><li>
Forberedelse av reagenser
	<ol>
<li>For lav-smelte-punkt agarose, sett 500 mg av lav-smeltende agarose i 100 mL DNA- / RNA-gratis vann. Varme flasken i en mikrobølgeovn til agarose oppløses. Plass flasken i en 37 ° C vannbad inntil nødvendig. Merk: For videre lesing, kan du se Azqueta et al., som studerte effekten av agarose konsentrasjon på DNA-avslapping tid og flere geleelektroforese faktorer23.</li>
		<li>Fortynn SYBR grøn...

<ol>
	<li>Bolli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+stem+cells+in+patients+with+ischaemic+cardiomyopathy+(SCIPIO):+initial+results+of+a+randomised+phase+1+trial.">Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial.</a> The Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).</li><li>Makkar, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracoronary+cardiosphere-derived+cells+for+heart+regeneration+after+myocardial+infarction+(CADUCEUS):+a+prospective,+randomised+phase+1+trial.">Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial.</a> The Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).</li><li>Tomita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+neural+crest+cells+contribute+to+the+dormant+multipotent+stem+cell+in+the+mammalian+heart.">Cardiac neural crest cells contribute to the dormant multipotent stem cell in the mammalian heart.</a> Journal of Cell Biology. 170 (7), 1135-1146 (2005).</li><li>Oyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+side+population+cells+have+a+potential+to+migrate+and+differentiate+into+cardiomyocytes+in+vitro+and+in+vivo.">Cardiac side population cells have a potential to migrate and differentiate into cardiomyocytes in vitro and in vivo.</a> Journal of Cell Biology. 176 (3), 329-341 (2007).</li><li>Fischer, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+myocardial+regeneration+through+genetic+engineering+of+cardiac+progenitor+cells+expressing+Pim-1+kinase.">Enhancement of myocardial regeneration through genetic engineering of cardiac progenitor cells expressing Pim-1 kinase.</a> Circulation. 120 (21), 2077-2087 (2009).</li><li>Cottage, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+progenitor+cell+cycling+stimulated+by+pim-1+kinase.">Cardiac progenitor cell cycling stimulated by pim-1 kinase.</a> Circulation Research. 106 (5), 891-901 (2010).</li><li>Angert, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+the+injured+adult+heart+involves+new+myocytes+potentially+derived+from+resident+cardiac+stem+cells.">Repair of the injured adult heart involves new myocytes potentially derived from resident cardiac stem cells.</a> Circulation Research. 108 (10), 1226-1237 (2011).</li><li>Kannappan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+Modulates+the+Fate+of+Cardiac+Progenitor+Cells+Ex+vivo+and+in+the+Diabetic+Heart+In+vivo.">p53 Modulates the Fate of Cardiac Progenitor Cells Ex vivo and in the Diabetic Heart In vivo.</a> EBioMedicine. 16, 224-237 (2017).</li><li>Hatzistergos, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+stimulate+cardiac+stem+cell+proliferation+and+differentiation.">Bone marrow mesenchymal stem cells stimulate cardiac stem cell proliferation and differentiation.</a> Circulation Research. 107 (7), 913-922 (2010).</li><li>Okita, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells:+opportunities+and+challenges.">Induced pluripotent stem cells: opportunities and challenges.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1575), 2198-2207 (2011).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cardiomyocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+repair+in+a+porcine+model+of+acute+myocardial+infarction+with+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiovascular+cells.">Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells.</a> Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+high+engraftment+of+patient-specific+cardiomyocyte+sheet+using+induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+adult+cardiac+fibroblast.">Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast.</a> Circulation: Heart Failure. 8 (1), 156-166 (2015).</li><li>Hirakawa, K., Midorikawa, K., Oikawa, S., Kawanishi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carcinogenic+semicarbazide+induces+sequence-specific+DNA+damage+through+the+generation+of+reactive+oxygen+species+and+the+derived+organic+radicals.">Carcinogenic semicarbazide induces sequence-specific DNA damage through the generation of reactive oxygen species and the derived organic radicals.</a> Mutation Research. 536 (1-2), 91-101 (2003).</li><li>Martinez, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+and+alkylating+damage+in+DNA.">Oxidative and alkylating damage in DNA.</a> Mutation Research. 544 (2-3), 115-127 (2003).</li><li>Valko, M., Rhodes, C. J., Moncol, J., Izakovic, M., Mazur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+radicals,+metals+and+antioxidants+in+oxidative+stress-induced+cancer.">Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer.</a> Chemico-Biological Interactions. 160 (1), 1-40 (2006).</li><li>Wiseman, H., Halliwell, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Damage+to+DNA+by+reactive+oxygen+and+nitrogen+species:+role+in+inflammatory+disease+and+progression+to+cancer.">Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species: role in inflammatory disease and progression to cancer.</a> Biochemical Journal. 313 (Pt 1), 17-29 (1996).</li><li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelectrophoretic+study+of+radiation-induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells.">Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 123 (1), 291-298 (1984).</li><li>Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells.">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.</a> Experimental Cell Research. 175 (1), 184-191 (1988).</li><li>Goichberg, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-associated+defects+in+EphA2+signaling+impair+the+migration+of+human+cardiac+progenitor+cells.">Age-associated defects in EphA2 signaling impair the migration of human cardiac progenitor cells.</a> Circulation. 128 (20), 2211-2223 (2013).</li><li>Kannappan, R., Mattapally, S., Wagle, P. A., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivation+domain+of+p53+regulates+DNA+repair+and+integrity+in+human+iPS+cells.">Transactivation domain of p53 regulates DNA repair and integrity in human iPS cells.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. , (2018).</li><li>Al-Baker, E. A., Oshin, M., Hutchison, C. J., Kill, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+UV-induced+damage+and+repair+in+young+and+senescent+human+dermal+fibroblasts+using+the+comet+assay.">Analysis of UV-induced damage and repair in young and senescent human dermal fibroblasts using the comet assay.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 126 (6-7), 664-672 (2005).</li><li>Azqueta, A., Gutzkow, K. B., Brunborg, G., Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+more+reliable+comet+assay:+optimising+agarose+concentration,+unwinding+time+and+electrophoresis+conditions.">Towards a more reliable comet assay: optimising agarose concentration, unwinding time and electrophoresis conditions.</a> Mutation Research. 724 (1-2), 41-45 (2011).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7 (10), R100 (2006).</li><li>Paradis, A. N., Gay, M. S., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binucleation+of+cardiomyocytes:+the+transition+from+a+proliferative+to+a+terminally+differentiated+state.">Binucleation of cardiomyocytes: the transition from a proliferative to a terminally differentiated state.</a> Drug Discovery Today. 19 (5), 602-609 (2014).</li></ol>

DNA integritet skildrer celle integritet. Celler med skadet DNA er ofte i stress, og til slutt mister sin integritet. Integriteten til stammen og stem-cell-derived celler som blir propagated å transplantasjon er rektor for cellene å utføre ønsket arbeidet. Transplanting celler med skadet DNA vil resultere i en dårlig engraftment hastighet og ytelse av cellen8,20. Derfor er undersøke DNA integritet før cellen transplantasjon en nødvendig kvalitet kontrollp...

Experimental og klinisk bevis viser at cellen transplantasjon moderat kan forbedre venstre ventrikkel kontraktile ytelsen av sviktende hjerter1,2,3,4,5 ,6,7,8,9. Nylige fremskritt har åpnet tiltalende ytterligere muligheter for hjerte gjenfødelse; Disse inkluderer tvunget uttrykket omprogrammering faktorer i somatiske celler å indusere pluripotency og skille disse indusert pluripotent stamceller (iPSC) i ulike cardiac linjene, viktigere cardiomyocyte (CM)10, 11 , 12 , 13. arvelige materialet i hver celle, inkludert kunstig generert iPSCs og iPSC-avledet CM (iPS-CM), er DNA. Den genetiske instruksjoner lagret i DNA dikterer vekst, utvikling og funksjon av celler, vev, organer og organismer. DNA er ikke inert; celle metabolitter, som reaktive oksygen, karbonyl og nitrogen arter, og alkylating agenter kan forårsake DNA skade i vitro og in vivo14,15,16,17. Viktigere, oppstår DNA skade intuitivt i hver celle, med en betydelig frekvens. Hvis disse skader ikke korrigeres, vil det føre til DNA mutasjon, mobilnettet senescence, tap av DNA og celle integritet og muligens sykdommer, inkludert livstruende kreft. Derfor er beholder DNA integritet avgjørende for en celle, spesielt iPSCs, som har et enormt potensial i klinikken.
For vurdering av antall og isolert genomisk DNA, er dyrt utstyr tilgjengelig på markedet. Det er imidlertid ingen enkel og kostnadseffektiv metoder å vurdere DNA integritet i celler uten å isolere cellene. Videre er bruker-indusert DNA fornedrelse under DNA isolasjon en av de største ulempene ved disse metodene. Encellede gel geleelektroforese (kjent som kometen analysen)18,19 og γH2A.X immunolabeling8 teknikkene er grunnleggende metoder i laboratorier for å vurdere DNA skade. Disse to metodene krever ikke dyrt utstyr eller isolert genomisk DNA å analysere DNA integritet8,20,21. Siden er disse teknikkene utført med hele celler. bruker-indusert DNA/RNA/protein fornedrelse under eksempel utarbeidelsen påvirker ikke disse protokollene. Her, for å vurdere DNA skade og DNA skade respons i stammen og stem-cell-derived celler, gir vi trinnvise protokoller for å utføre både comet analysen og γH2A.X immunolabeling. Videre foreslår vi kombinere disse to tilnærmingene, en naiv vurdering som kan brukes til å evaluere cellens egnethet for transplantasjon.
Comet analysen, eller encellede gel geleelektroforese, måler DNA pauser i celler. Celler i lav-smeltende agarose er lysed til skjemaet nucleoids som inneholder supercoiled DNA. På geleelektroforese vandrer små biter av fragmentert DNA og brutt DNA tilnærmingene gjennom agarose porene, mens intakt DNA, sine enorme og deres Bøyning med matrix protein, vil ha en begrenset overføring. Mønsteret av farget DNA under fluorescens mikroskop etterligner en komet. Comet hodet inneholder intakt DNA og halen er består av fragmenter og brutt DNA tilnærmingene. Brøkdel av DNA skade kan måles ved fluorescens intensiteten av skadet DNA (kometen hale) i forhold til intakt DNA (comet leder) intensiteten. Parameteren hale øyeblikket kan beregnes som vist i figur 1.
DNA skade induserer fosforylering av histone H2A. X (γH2A.X) på Ser139 av ATM, ATR og DNA-PK kinaser. Den fosforylering og rekruttering av H2A. X på DNA strand bryter kalles DNA skade svar (DDR) og skjer raskt etter DNA er skadet. Etter denne prosessen, checkpoint-mediert celle syklus arrestasjon og DNA reparasjon prosesser er igangsatt. Etter en vellykket gjennomføring av DNA-reparasjon, er γH2A.X dephosphorylated inaktivert av phosphatases Langvarig og flere DNA strand bryter føre til opphopning av γH2A.X foci i DNA. Dette angir cellens manglende evne til å reparere DNA-skader og tap av DNA integritet. Disse γH2A.X foci i DNA kan identifiseres ved og antall DDR foci kan telles ved hjelp av protokollen i § 2.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slide</td>
			<td>Millicell</td>
			<td>PEZGS0816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td>Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure 
			Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson Immuno 
			Research Laboratories</td>
			<td>711-545-152 
			(RRID: AB_2313584)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson Immuno 
			Research Laboratories</td>
			<td>711-165-152 
			(RRID:AB_2307443)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco B-27 Supplement, Serum Free,</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel growth factor reduced</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhalloidinA488</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2577 (RRID: AB_2118010)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR&#160;Green I nucleic acid gel stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Low melting Point Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Antifade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing stem cell dna integrity for cardiac cell therapy

Stilk og stem-cell-derived celler har enorme potensial som en regenererende terapi for ulike degenerative sykdommer. DNA er Stabburet genetisk data i alle celler, inkludert stamceller, integriteten er grunnleggende for regenerativ evnen. Stamceller gjennomgår rask overføring i laboratorier for å oppnå de nødvendige numrene for transplantasjon. Akselerert cellevekst fører til tap av DNA integritet av akkumulert metabolitter, som reaktive oksygen, karbonyl og alkylating agenter. Transplantere disse cellene vil resultere i fattig engraftment og fornyelse av den forverrede orgelet. Videre transplanting DNA-skadet cellene fører til mutasjoner, DNA ustabilitet, mobilnettet senescence, og muligens livstruende sykdommer som kreft. Derfor er det et umiddelbart behov for en kvalitetskontroll-metoden for å evaluere cellens egnethet for transplantasjon. Her gir vi trinnvise protokoller for vurdering av DNA integritet stamceller før cellen transplantasjon.

Menneskelige indusert pluripotent stamceller ble kultivert og DNA skade og hale øyeblikket, som ble brukt som et mål på DNA integritet, ble analysert av kometen analysen. iPS celler var innebygd i lav-smelte-punkt agarose og plassert på et glass lysbilde. Cellene ble, deretter behandlet med lyseringsbuffer, etterfulgt av en alkalisk løsning, hente supercoiled DNA. Nucleoids var electrophoresed og kometer var visualisert av DNA dye (figur 1A-D</st...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Stem Cell DNA Integrity for Cardiac Cell Therapy at JoVE.com

Assessing Stem Cell DNA Integrity for Cardiac Cell Therapy

Vurdere Stem Cell DNA integritet for Cardiac cellen terapi

Her gir vi en detaljert beskrivelse av en eksperimentelle oppsett for en analyse av vurdering av DNA integritet i stamceller før cellen transplantasjon.

Stem and stem-cell-derived cells have immense potential as a regenerative therapy for various degenerative diseases. DNA is the storehouse of genetic data ...

For neonatal sykdommer som kardiomyopati, regenerativ terapi ved hjelp av indusert pluripotente stamcelleavledede celler har massivt potensial. In vitro akselerert cellevekst fører imidlertid til DNA-skade av akkumulerte metabolitter som reaktive oksygenarter. Transplantasjon av disse DNA-skadede cellene ville resultere i dårlig engraftment og regenerering av orgelet.Før transplantasjon bør kvaliteten på cellene vurderes. Her gir vi to trinnvise protokoller for å vurdere DNA-skaden i stamceller. Demonstrere prosedyrene vil være Jessica Miller, en forsker, Nikhil Mardhekar, en forsker, og Vasanthi Rajasekaran, en lab tekniker.Til å begynne med, plasser 500 milligram med lavtsmeltende agarose i 100 milliliter DNA-RNA fritt vann. Varm flasken i en mikrobølgeovn til agarose oppløses. Deretter plasserer du flasken i et 37-graders Celsius vannbad til det trengs.For å forberede forhåndsbelagte kometlyser, plasser noen dråper 0,5% agarose på et glasssklie. Spre straks agarose for å danne et tynt lag med agarose belegg ved hjelp av en coverslip. Arbeide under dårlige lysforhold for å unngå ultrafiolett lysindusert celleskade, bland 10 mikroliter cellefjæring og 90 mikroliter agaroseoppløsning i et rør.Plasser røret i et 37-graders Celsius vannbad for å hindre at agarose fra størkning. Bland løsningen uten å introdusere luftbobler, og pipette 70 mikroliter per flekk på den forhåndsbelagte kometsklien. Ved hjelp av en pipettespiss, spred celleasjroseblandingen for å danne et tynt lag.Plasser lysbildet på fire grader Celsius i 15 minutter. I en beholder, helt senke lysbildet i kald lysis buffer. Plasser beholderen i mørket ved fire grader Celsius i en time.Bytt lysisbufferen med kald alkalisk løsning. Kontroller at lysbildene er helt nedsenket. Etter å ha forlatt beholderen i mørket ved fire grader Celsius i ytterligere 30 minutter, plasser lysbildet i en horisontal elektroforesetank.Fyll tanken med kald alkalisk elektroforesebuffer til lysbildene er helt nedsenket. Påfør spenning på en volt per centimeter i 15 til 30 minutter. I en beholder, helt nedsenk lysbildet i kaldt deionisert vann.Etter to minutter, fjern det deioniserte vannet og tilsett friskt deionisert vann, og gjenta deretter dette trinnet en gang til. Deretter erstatter du det avioniserte vannet med kaldt 70% etanol. Etter fem minutter, fjern forsiktig lysbildet uten å vippe den og la det lufttørke.Når det er tørket, tilsett 100 mikroliter fortynnet DNA-fargestoff til hvert sted, og vent 15 minutter ved romtemperatur. Bruk et FITC-filter i et epifluorescence-mikroskop, ta bilder av totalt 50 til 100 kometer per prøve. Kultur iPS-avledede kardiomyocytter som beskrevet i tekstprotokollen.For å se iPS-avledede kardiomyocytter i kammersklier, kast først kulturmediet fra brønnene, og vask cellene tre ganger med PBS. Tilsett en milliliter på 0,25% Trypsin per brønn, og inkuber ved 37 grader Celsius i fem minutter. Kontroller platen under et mikroskop for celleavløsning.Deretter legger du til en milliliter CMM for å stoppe Trypsin. Legg cellefjæringen i et 15-milliliter rør og sentrifuge i fem minutter ved fire grader Celsius og 200 ganger g. Kast mediet, tilsett en milliliter CMM, og gjenoppbruk cellene.Telle cellene og justere celleantallet for å få to millioner celler i 1,6 milliliter CMM. Nå frø 200 mikroliter av celle suspensjon per brønn av åtte-brønns kammer lysbilde. Trykk forsiktig på lysbildet for å spre cellene rundt brønnen.Inkuber cellene ved 37 grader Celsius. For iPS-avledet kardiomyocytt doksorubicinbehandling, kast kulturmediet fra de iPS-avledede kardiomyocytebrønnene, og vask cellene med PBS. Behandle cellene med en mikromolar doksorubicin i fire timer ved 37 grader Celsius.Aspirer mediet, og vask cellene med PBS. For å utføre immunolabeling, vask cellene tre ganger med PBS og tilsett 200 mikroliter nylaget 4% paraformaldehyd til hver brønn. Fest cellene i 20 minutter i mørket ved romtemperatur.Etter å ha vasket cellene med PBS, tilsett 200 mikroliter blokkerer buffer per brønn, og blokkerer i 30 minutter i et fuktet kammer ved romtemperatur. Fjern blokkeringsbufferen og legg til 200 mikroliter primær antistoffløsning. Etter inkubering i 45 minutter i et mørkt fuktet kammer ved romtemperatur, vask brønnene tre ganger med PBS.Fjern PBS og tilsett 200 mikroliter sekundær antistoffblanding. Inkuber i 45 minutter i et mørkt fuktet kammer ved romtemperatur. Vask deretter brønnene tre ganger med PBS.Vask med deionisert vann før du monterer lysbildene med antifade. Plasser et dekkglass, og lagre lysbildene i mørket ved fire grader Celsius. Bruk et konfokalt mikroskop, ta tre til fem bilder av tilfeldige felt per prøve og fortsett til bildeanalyse.Hvis du vil telle DNA-skaderesponsen foci, laster du ned og installerer CellProfiler. Velg fil, importer, pipeline fra filen, og velg pipeline-filen med navnet puncti gamma-H2AX. Dra og slipp mappen som inneholder de kjøpte bildene av gamma-H2AX foci til fillistevinduet i delen inndatamoduler bilder for analyse.Følg deretter instruksjonene som vist i tekstprotokollen. Hvis du vil angi parameterne for bildene, drar du ønsket bilde for analyse til fillisten. Velg bilder under inndatamoduler.Velg metadata i inndatamoduler, og velg deretter navn og typer. Velg Nei for grupper. Velg farge til grått i analysemoduler.Velg deretter glatt, velg identifiser primære objekter, og velg problemfritt igjen. Velg deretter forbedre eller undertrykke funksjoner, og velg deretter identifiser primære objekter. Fortsatt arbeider i analysemoduler, velg relatere objekter, klassifisere objekter, og til slutt velge eksport til regneark.Klikk på analyser bilder nederst til venstre for å utføre bildeanalyse. Ved vellykket gjennomføring av analysen genereres flere bilder. Legg merke til CSV-filen som genereres og lagres på riktig sted på datamaskinen.Denne filen inneholder kvantitative data for videre analyse. I regnearket kalt mitt eksperimentbilde, vil kolonne B ha antall kjerner som har opptil fem punktspill, og kolonne D vil ha antall kjerner som har mer enn fem punktspill. Legg til kolonne B og D for å få totalt antall kjerner.Gjenta disse trinnene for alle bilder, endre eksperimentet filnavn før hver analyse. Representative mikrografer av kometer fra doxo-behandlede og ikke-behandlede iPS-celler vises her. En basal mengde DNA-skade ble funnet i iPS-celler, uttrykt som en brøkdel av DNA-skade og haleøyeblikk.Doxo-behandlingen økte imidlertid DNA-skaden hos iPS-celler som forventet, noe som indikerer at kometanalysen kan brukes til å vurdere DNA-integritet i pluripotente stamceller. Representative mikrografer av gamma-H2AX immunolabeling er vist her, ved lavere forstørrelse og ved høyere forstørrelse. I kontrollen iPS-avledet kardiomyocytter hadde mer enn 90% av cellene mindre enn fem DDR foci per kjerner.Og totalt mindre enn 10% av cellene hadde mer enn seks DDR foci per kjerner. For iPS-avledede kardiomyocytter dyrket i seks måneder, hadde mindre enn 90% av cellene opptil fem DDR foci per kjerner, og totalt mer enn 13% av cellene hadde mer enn seks DDR foci per kjerner. Mens i doxo-behandlet iPS-avledet kardiomyocytter, mindre enn 80% av cellene hadde opptil fem DDR foci per kjerner.Og totalt ca 24% av cellene hadde mer enn seks DDR foci per kjerner. Disse dataene indikerer at langvarig iPS-avledet kardiomyocyttcellekultur og doxobehandling forårsaket betydelig DNA-skade, noe som gjorde dem uegnet for celletransplantasjon. Det er svært viktig å unngå variabler mens du blander cellefjæringen, da dette kan påvirke elektroforesen.Etter denne prosedyren kan du utføre kometanalysene og immunolabelprosedyrene med celler av ulike typer. Disse teknikkene vil tillate celler av ulike slag som skal vurderes for DNA-skade før de brukes i celletransplantasjonsstudier.

Research

JoVE Journal

Genetics

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

Ingeniør Kunstige Faktorer å Spesifikt Manipulere alternativ spleising i humane celler

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Kartlegging av RNA-RNA-interaksjoner globalt ved bruk av biotinylert psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Ved hjelp av en Fluorescent PCR-kapillar-gelelektroforese teknikken for å genotype CRISPR / Cas9-mediert knockout-mutanter i en high-throughput-format

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

En universell protokoll for store gRNA biblioteket produksjon fra en DNA-kilde

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Semi kvantitative påvisning av RNA-avhengig RNA Polymerase aktivitet av menneskelig Telomerase revers transkriptase Protein

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profilering DNA replikering Timing bruker sebrafisk som en In Vivo modellsystem

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Svært effektiv Gene avbrudd i Murine og menneskelig blodkreft stamfar celler av CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

En kombinasjon encellede tilnærming som karakteriserer den molekylære og Immunophenotypic heterogenitet menneskelige stammen og stamfar bestander

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Isolering og karakterisering MicroRNA-baserte genetisk modifisering av menneskelig Dental hårsekken stamceller

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...