Name: assessing stem cell dna integrity for cardiac cell therapy
Uploaded: 2019-01-25T14:00:00
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Este trabalho foi financiado em parte pelo nacional do coração, pulmão e sangue Instituto bolsas RO1-HL-99507, HL-114120, HL-131017, HL138023 e UO1-HL-134764 (para J. Zhang) e pela American coração Associação científica desenvolvimento Grant 17SDG33670677 (a. R. Kannappan).

1. ensaio cometa
<ol><li>
Preparação do reagente
	<ol>
<li>Para agarose de baixo ponto de fusão, coloque 500 mg de agarose de baixo ponto de fusão em 100 mL de DNA - RNA-livre água /. Aqueça a garrafa em um forno de microondas, até que se dissolva a agarose. Coloque o frasco num banho de água de 37 ° C até que seja necessário. Nota: Para ler mais, consulte Azqueta et al, que estudou os efeitos da concentração de agarose no tempo DNA-desenrolar e vários fatores de elect...

<ol>
	<li>Bolli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+stem+cells+in+patients+with+ischaemic+cardiomyopathy+(SCIPIO):+initial+results+of+a+randomised+phase+1+trial.">Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial.</a> The Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).</li><li>Makkar, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracoronary+cardiosphere-derived+cells+for+heart+regeneration+after+myocardial+infarction+(CADUCEUS):+a+prospective,+randomised+phase+1+trial.">Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial.</a> The Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).</li><li>Tomita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+neural+crest+cells+contribute+to+the+dormant+multipotent+stem+cell+in+the+mammalian+heart.">Cardiac neural crest cells contribute to the dormant multipotent stem cell in the mammalian heart.</a> Journal of Cell Biology. 170 (7), 1135-1146 (2005).</li><li>Oyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+side+population+cells+have+a+potential+to+migrate+and+differentiate+into+cardiomyocytes+in+vitro+and+in+vivo.">Cardiac side population cells have a potential to migrate and differentiate into cardiomyocytes in vitro and in vivo.</a> Journal of Cell Biology. 176 (3), 329-341 (2007).</li><li>Fischer, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+myocardial+regeneration+through+genetic+engineering+of+cardiac+progenitor+cells+expressing+Pim-1+kinase.">Enhancement of myocardial regeneration through genetic engineering of cardiac progenitor cells expressing Pim-1 kinase.</a> Circulation. 120 (21), 2077-2087 (2009).</li><li>Cottage, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+progenitor+cell+cycling+stimulated+by+pim-1+kinase.">Cardiac progenitor cell cycling stimulated by pim-1 kinase.</a> Circulation Research. 106 (5), 891-901 (2010).</li><li>Angert, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+the+injured+adult+heart+involves+new+myocytes+potentially+derived+from+resident+cardiac+stem+cells.">Repair of the injured adult heart involves new myocytes potentially derived from resident cardiac stem cells.</a> Circulation Research. 108 (10), 1226-1237 (2011).</li><li>Kannappan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+Modulates+the+Fate+of+Cardiac+Progenitor+Cells+Ex+vivo+and+in+the+Diabetic+Heart+In+vivo.">p53 Modulates the Fate of Cardiac Progenitor Cells Ex vivo and in the Diabetic Heart In vivo.</a> EBioMedicine. 16, 224-237 (2017).</li><li>Hatzistergos, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+stimulate+cardiac+stem+cell+proliferation+and+differentiation.">Bone marrow mesenchymal stem cells stimulate cardiac stem cell proliferation and differentiation.</a> Circulation Research. 107 (7), 913-922 (2010).</li><li>Okita, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells:+opportunities+and+challenges.">Induced pluripotent stem cells: opportunities and challenges.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1575), 2198-2207 (2011).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cardiomyocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+repair+in+a+porcine+model+of+acute+myocardial+infarction+with+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiovascular+cells.">Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells.</a> Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+high+engraftment+of+patient-specific+cardiomyocyte+sheet+using+induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+adult+cardiac+fibroblast.">Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast.</a> Circulation: Heart Failure. 8 (1), 156-166 (2015).</li><li>Hirakawa, K., Midorikawa, K., Oikawa, S., Kawanishi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carcinogenic+semicarbazide+induces+sequence-specific+DNA+damage+through+the+generation+of+reactive+oxygen+species+and+the+derived+organic+radicals.">Carcinogenic semicarbazide induces sequence-specific DNA damage through the generation of reactive oxygen species and the derived organic radicals.</a> Mutation Research. 536 (1-2), 91-101 (2003).</li><li>Martinez, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+and+alkylating+damage+in+DNA.">Oxidative and alkylating damage in DNA.</a> Mutation Research. 544 (2-3), 115-127 (2003).</li><li>Valko, M., Rhodes, C. J., Moncol, J., Izakovic, M., Mazur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+radicals,+metals+and+antioxidants+in+oxidative+stress-induced+cancer.">Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer.</a> Chemico-Biological Interactions. 160 (1), 1-40 (2006).</li><li>Wiseman, H., Halliwell, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Damage+to+DNA+by+reactive+oxygen+and+nitrogen+species:+role+in+inflammatory+disease+and+progression+to+cancer.">Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species: role in inflammatory disease and progression to cancer.</a> Biochemical Journal. 313 (Pt 1), 17-29 (1996).</li><li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelectrophoretic+study+of+radiation-induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells.">Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 123 (1), 291-298 (1984).</li><li>Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells.">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.</a> Experimental Cell Research. 175 (1), 184-191 (1988).</li><li>Goichberg, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-associated+defects+in+EphA2+signaling+impair+the+migration+of+human+cardiac+progenitor+cells.">Age-associated defects in EphA2 signaling impair the migration of human cardiac progenitor cells.</a> Circulation. 128 (20), 2211-2223 (2013).</li><li>Kannappan, R., Mattapally, S., Wagle, P. A., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivation+domain+of+p53+regulates+DNA+repair+and+integrity+in+human+iPS+cells.">Transactivation domain of p53 regulates DNA repair and integrity in human iPS cells.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. , (2018).</li><li>Al-Baker, E. A., Oshin, M., Hutchison, C. J., Kill, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+UV-induced+damage+and+repair+in+young+and+senescent+human+dermal+fibroblasts+using+the+comet+assay.">Analysis of UV-induced damage and repair in young and senescent human dermal fibroblasts using the comet assay.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 126 (6-7), 664-672 (2005).</li><li>Azqueta, A., Gutzkow, K. B., Brunborg, G., Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+more+reliable+comet+assay:+optimising+agarose+concentration,+unwinding+time+and+electrophoresis+conditions.">Towards a more reliable comet assay: optimising agarose concentration, unwinding time and electrophoresis conditions.</a> Mutation Research. 724 (1-2), 41-45 (2011).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7 (10), R100 (2006).</li><li>Paradis, A. N., Gay, M. S., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binucleation+of+cardiomyocytes:+the+transition+from+a+proliferative+to+a+terminally+differentiated+state.">Binucleation of cardiomyocytes: the transition from a proliferative to a terminally differentiated state.</a> Drug Discovery Today. 19 (5), 602-609 (2014).</li></ol>

Integridade do DNA retrata a integridade celular. Células com DNA danificado são frequentemente em stress e eventualmente perdem sua integridade. A integridade do tronco e células tronco-derivado de células que estão sendo propagadas para fins de transplante é principal para as células executar sua função pretendida. Transplante de células com DNA danificado resultaria em uma taxa de enxertia pobre e desempenho da célula8,20. Por conseguinte, examinar ...

Evidências experimentais e clínicas demonstra que o transplante de células moderadamente pode melhorar o desempenho contrátil do ventrículo esquerdo de falhando corações1,2,3,4,5 ,6,7,8,9. Avanços recentes abriram ainda mais atraentes oportunidades de regeneração cardiovascular; Estes incluem a expressão forçada de reprogramação fatores em células somáticas para induzir a pluripotência e diferenciar essas células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) em diferentes linhagens cardíacas, importante casos (CM)10, 11 , 12 , 13. o material hereditário em todas as células, incluindo os artificialmente gerado iPSCs e derivado de iPSC CM (iPS-CM), é DNA. Instruções genéticas armazenadas no DNA dita o crescimento, desenvolvimento e função de células, tecidos, órgãos e organismos. DNA não é inerte; metabólitos, tais como reativas de oxigênio, carbonila e espécies de nitrogênio, de células e agentes alquilantes pode DNA causa danos in vitro e in vivo14,15,16,17. Importante, o dano ao DNA ocorre intuitivamente em cada célula, com uma frequência significativa. Se esses danos não são corrigidos, conduzirá a mutação de DNA, senescência celular, a perda da integridade do DNA e células e possivelmente, doenças, incluindo câncer fatal. Portanto, mantendo a integridade do DNA é essencial para qualquer célula, especialmente iPSCs, que tem um enorme potencial na clínica.
Para avaliar a quantidade e a integridade do DNA genômico de isolados, equipamento caro está disponível no mercado. No entanto, não há nenhum método simples e econômico para avaliar a integridade do DNA nas células sem isolar as células. Além disso, degradação de DNA induzida pelo usuário durante o isolamento do DNA é uma das principais desvantagens em usar esses métodos. O gel de célula única eletroforese (conhecido como ensaio cometa)18,19 e γH2A.X immunolabeling8 técnicas é abordagens fundamentais em laboratórios de pesquisa para avaliar o dano do ADN. Esses dois métodos não exigem equipamentos caros ou DNA genômico isolado para analisar DNA integridade8,20,21. Desde então, estas técnicas têm sido realizadas com células toda; degradação de DNA/RNA/proteína induzida pelo usuário durante a preparação da amostra não afetará a esses protocolos. Aqui, para avaliar os danos ao DNA e resposta de dano do ADN no tronco e células tronco-células-derivadas, nós fornecemos protocolos passo a passo para executar tanto o cometa do ensaio e γH2A.X immunolabeling. Além disso, combinando essas duas abordagens, propomos uma avaliação ingênua que pode ser usada para avaliar a adequação da célula para transplante.
O ensaio cometa, ou célula única electroforese do gel, mede as quebras de DNA nas células. Incorporado em agarose de baixo ponto de fusão de células lysed para nucleoids de formulário contendo DNA supercoiled. Após eletroforese, pequenos pedaços de DNA fragmentado e fios quebrados de DNA migram através dos poros de agarose, Considerando que o DNA intacto, devido ao seu enorme tamanho e sua conjugação com a proteína da matriz, terá uma migração restrita. O padrão de DNA manchada sob um microscópio de fluorescência imita um cometa. A cabeça do cometa contém DNA intacto e a cauda é composta de fragmentos de quebrar cadeias de ADN. A fração de dano do ADN pode ser medida pela intensidade da fluorescência do DNA danificado (cauda de cometa) em relação a intensidade de (cabeça de cometa) de DNA intacta. O momento de cauda do parâmetro pode ser calculado como mostrado na Figura 1.
Danos ao DNA induz a fosforilação de histona H2A. X (γH2A.X) no Ser139 por quinases ATM, ATR e DNA-PK. A fosforilação e o recrutamento da H2A. X em quebras da cadeia de ADN é chamada de resposta de dano de DNA (DDR) e acontece rapidamente depois que o DNA é danificado. Após este processo, detenção de ciclo de celular mediada por ponto de verificação e DNA são iniciados os processos de reparação. Após a conclusão bem-sucedida de reparação do ADN, γH2A.X é dephosphorylated e inativado por fosfatases. Prolongada e múltiplas quebras DNA levam ao acúmulo de focos γH2A.X no DNA. Isto indica a incapacidade da célula para reparar os danos do DNA e a perda da integridade do DNA. Estes focos γH2A.X no DNA podem ser identificados por... e o número de focos DDR pode ser contado usando o protocolo na secção 2.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slide</td>
			<td>Millicell</td>
			<td>PEZGS0816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td>Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure 
			Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson Immuno 
			Research Laboratories</td>
			<td>711-545-152 
			(RRID: AB_2313584)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson Immuno 
			Research Laboratories</td>
			<td>711-165-152 
			(RRID:AB_2307443)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco B-27 Supplement, Serum Free,</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel growth factor reduced</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhalloidinA488</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2577 (RRID: AB_2118010)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR&#160;Green I nucleic acid gel stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Low melting Point Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Antifade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing stem cell dna integrity for cardiac cell therapy

Tronco e células tronco-células-derivadas têm imenso potencial como uma terapia regenerativa para várias doenças degenerativas. DNA é o armazém de dados genéticos em todas as células, incluindo células-tronco, e sua integridade é fundamental para a sua capacidade de regeneração. Células-tronco passam por propagação rápida em laboratórios para alcançar os números necessários para transplante. Crescimento acelerado celular leva à perda da integridade do DNA por metabólitos acumulados, como reativas de oxigênio, carbonila e agentes alquilantes. Estas células de transplantação resultaria em enxertia pobre e regeneração do órgão se deteriorando. Além disso, transplante de células de DNA danificado leva a mutações, instabilidade do DNA, senescência celular e possivelmente, fatais doenças como o câncer. Portanto, há uma necessidade imediata de um método de controle de qualidade avaliar a adequação da célula para transplante. Aqui, nós fornecemos protocolos passo a passo para a avaliação da integridade da DNA de células antes do transplante de células-tronco.

Células-tronco pluripotentes induzidas humanas foram cultivadas, e os danos do DNA e o momento de cauda, que eram usados como uma medida de integridade do DNA, foram analisados por meio de ensaio cometa. células iPS foram incorporadas em agarose de baixo ponto de fusão e colocadas em uma lâmina de vidro. As células foram, em seguida, tratadas com tampão de Lise, seguido por uma solução alcalina, para obter o DNA supercoiled. Nucleoids foram electrophoresed e cometas foram visualiz...

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Assessing Stem Cell DNA Integrity for Cardiac Cell Therapy

Avaliar a integridade do DNA de células-tronco para terapia celular cardíaca

Aqui, nós fornecemos uma descrição detalhada de uma instalação experimental para uma análise da avaliação da integridade do DNA em células antes do transplante de células-tronco.

Stem and stem-cell-derived cells have immense potential as a regenerative therapy for various degenerative diseases. DNA is the storehouse of genetic data ...

Para doenças neonatais como cardiomiopatia, a terapia regenerativa usando células-tronco pluripotentes induzidas tem um enorme potencial. No entanto, o crescimento acelerado das células in vitro leva a danos no DNA por metabólitos acumulados, como espécies reativas de oxigênio. Transplantar essas células danificadas pelo DNA resultaria em má engrafia e regeneração do órgão.Antes do transplante, a qualidade das células deve ser avaliada. Aqui fornecemos dois protocolos passo a passo para avaliar os danos de DNA em células-tronco. Os procedimentos serão Jessica Miller, pesquisadora, Nikhil Mardhekar, pesquisadora, e Vasanthi Rajasekaran, técnica de laboratório.Para começar, coloque 500 miligramas de agarose de baixo derretimento em 100 mililitros de água livre de DNA-RNA. Aqueça a garrafa em um forno de micro-ondas até que a ágarose se dissolva. Em seguida, coloque a garrafa em um banho de água de 37 graus Celsius até que seja necessário.Para preparar slides de cometas pré-revestidos, coloque algumas gotas de 0,5% em um slide de vidro. Espalhe imediatamente a agarose para formar uma fina camada de revestimento de agarose usando um deslizamento de tampa. Trabalhando sob condições de baixa luz para evitar danos celulares ultravioletas induzidos pela luz, misture 10 microliters de suspensão celular e 90 microliters de solução agarose em um tubo.Coloque o tubo em um banho de água de 37 graus Celsius para evitar que a agarose se solidifique. Misture a solução sem introduzir bolhas de ar e pipeta 70 microliters por ponto no slide do cometa pré-revestido. Usando uma ponta de pipeta, espalhe a mistura de agarose celular para formar uma camada fina.Coloque o slide em quatro graus Celsius por 15 minutos. Em um recipiente, submerga completamente o deslizamento em tampão de lise fria. Coloque o recipiente no escuro a quatro graus Celsius por uma hora.Substitua o tampão de lise por solução alcalina fria. Certifique-se de que os slides estão completamente submersos. Depois de deixar o recipiente no escuro a quatro graus Celsius por mais 30 minutos, coloque o slide em um tanque de eletroforese horizontal.Encha o tanque com tampão de eletroforese alcalina a frio até que os slides estejam completamente submersos. Aplique tensão a um volt por centímetro por 15 a 30 minutos. Em um recipiente, submerga completamente o escorregador em água deionizada fria.Depois de dois minutos, retire a água deionizada e adicione água deionizada fresca e, em seguida, repita esta etapa uma segunda vez. Em seguida, substitua a água deionizada por 70% de etanol frio. Depois de cinco minutos, remova suavemente o slide sem inclinar-o e deixe-o secar.Uma vez seco, adicione 100 microliters de corante de DNA diluído em cada ponto, e espere 15 minutos em temperatura ambiente. Usando um filtro FITC em um microscópio de epifluorescência, tire imagens de 50 a 100 cometas no total por amostra. Cardiomiócitos derivados do iPS, como descrito no protocolo de texto.Para ver os cardiomiócitos derivados do iPS em lâminas de câmara, primeiro descarte o meio de cultura dos poços e lave as células três vezes com PBS. Adicione um mililitro de 0,25% Trypsin por poço, e incubar a 37 graus Celsius por cinco minutos. Verifique a placa sob um microscópio para desprendimento celular.Em seguida, adicione um mililitro de CMM para parar o Trypsin. Coloque a suspensão celular em um tubo de 15 mililitros e centrífuga por cinco minutos a quatro graus Celsius e 200 vezes g. Descarte o meio, adicione um mililitro de CMM e resuspenque as células.Conte as células e ajuste a contagem celular para obter dois milhões de células em 1,6 mililitros de CMM. Agora semente 200 microliters de suspensão celular por poço do slide de câmara de oito poços. Toque no slide suavemente para espalhar as células ao redor do poço.Incubar as células a 37 graus Celsius. Para o tratamento de doxorubicina cardiomiócito derivado do iPS, descarte o meio de cultura dos poços de cardiomocíte derivados do iPS e lave as células com PBS. Trate as células com doxorubicina de um micromolar por quatro horas a 37 graus Celsius.Aspire o meio e lave as células com PBS. Para realizar o imunolabelamento, lave as células três vezes com PBS e adicione 200 microliters de 4% de paraformaldeído recém-preparado a cada poço. Conserte as células por 20 minutos no escuro à temperatura ambiente.Depois de lavar as células com PBS, adicione 200 microliters de tampão de bloqueio por poço, e bloqueie por 30 minutos em uma câmara umidificada à temperatura ambiente. Remova o buffer de bloqueio e adicione 200 microliters da solução de anticorpos primários. Depois de incubar por 45 minutos em uma câmara escura umidificada à temperatura ambiente, lave os poços três vezes com PBS.Remova o PBS e adicione 200 microliters de mistura de anticorpos secundários. Incubar por 45 minutos em uma câmara escura umidificada à temperatura ambiente. Em seguida, lave os poços três vezes com PBS.Lave com água deionizada antes de montar os slides com antifado. Coloque um copo de cobertura e armazene os slides no escuro a quatro graus Celsius. Usando um microscópio confocal, pegue de três a cinco imagens de campos aleatórios por amostra e prossiga para análise de imagem.Para contar os focos de resposta a danos de DNA, baixe e instale o CellProfiler. Selecione arquivo, importação, pipeline do arquivo e escolha o arquivo de pipeline chamado puncti gamma-H2AX. Arraste e solte a pasta contendo as imagens adquiridas de focos gama-H2AX para a janela de lista de arquivos na seção de imagens dos módulos de entrada para análise.Em seguida, siga as instruções como mostrado no protocolo de texto. Para definir os parâmetros das imagens, arraste a imagem desejada para análise na lista de arquivos. Em módulos de entrada, selecione imagens.Também em módulos de entrada, selecione metadados e selecione nomes e tipos. Para grupos, selecione não. Trabalhando em módulos de análise, selecione cor a cinza.Em seguida, selecione suavemente, selecione identificar objetos primários e selecione novamente suavemente. Em seguida, selecione melhorar ou suprimir recursos e, em seguida, selecione identificar objetos primários. Ainda trabalhando em módulos de análise, selecione objetos de relação, depois classifique objetos e, finalmente, selecione exportar para planilha.Clique em analisar imagens no painel inferior esquerdo para realizar a análise da imagem. Na conclusão bem sucedida da análise, várias imagens são geradas. Observe o arquivo CSV gerado e salvo no local apropriado no computador.Este arquivo contém os dados quantitativos para análise posterior. Na planilha chamada minha imagem de experimento, a coluna B terá o número de núcleos que têm até cinco puncti, e a coluna D terá o número de núcleos que possuem mais de cinco puncti. Adicione as colunas B e D para obter o número total de núcleos.Repita estes passos para todas as imagens, alterando o meu nome de arquivo de experimento antes de cada análise. Micrografos representativos de cometas de células iPS tratadas com doxo e não tratadas são mostrados aqui. Uma quantidade basal de dano de DNA foi encontrada em células iPS, expressas como uma fração de dano de DNA e momento da cauda.No entanto, o tratamento do doxo aumentou o dano de DNA em células iPS como esperado, indicando que o ensaio do cometa pode ser usado para avaliar a integridade do DNA em células-tronco pluripotentes. Micrografos representativos da imunolabeling gama-H2AX são mostrados aqui, em menor ampliação e em maior ampliação. No controle de cardiomiócitos derivados do iPS, mais de 90% das células apresentavam menos de cinco focos de DDR por núcleos.E um total de menos de 10% das células tinha mais de seis focos de DDR por núcleos. Para cardiomiócitos derivados do iPS cultivados por seis meses, menos de 90% das células tinham até cinco focos de DDR por núcleos, e um total de mais de 13% das células tinham mais de seis focos de DDR por núcleos. Considerando que nos cardiomiócitos derivados do doxo iPS, menos de 80% das células tinham até cinco focos de DDR por núcleos.E um total de cerca de 24% das células tinham mais de seis focos de DDR por núcleos. Esses dados indicam que a cultura celular cardiomiócito derivada do iPS prolongada e o tratamento doxo induziram danos significativos no DNA, tornando-os inadequados para transplante celular. É muito importante evitar variáveis ao misturar a suspensão celular, pois isso pode afetar a eletroforese.Após este procedimento, você pode realizar os ensaios do cometa e os procedimentos de imunolabeling com células de vários tipos. Essas técnicas permitirão que células de vários tipos sejam avaliadas para danos ao DNA antes de serem usadas em estudos de transplante celular.

Research

JoVE Journal

Genetics

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

Engenharia de fatores artificiais para manipular Especificamente splicing alternativo em células humanas

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Genética

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Mapeando as Interações RNA-ARN Globalmente Usando Psoraleno Biotinilado

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Usando uma técnica de PCR fluorescente-capilar Electroforese em Gel de genótipo CRISPR / cas9 mediada KO mutantes em um formato de elevado rendimento

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

Um protocolo Universal para grande escala gRNA biblioteca de produção a partir de qualquer fonte de DNA

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Detecção semi-quantitativa de atividade RNA-dependente do RNA polimerase humana Telomerase Transcriptase reversa proteína

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Sincronismo de replicação de DNA usando Zebrafish como um sistema modelo In Vivo de criação de perfil

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Disrupção do Gene altamente eficiente de células progenitoras hematopoiéticas murino e humano por CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

Uma combinatória célula única abordagem para caracterizar o Molecular e imunofenotípica heterogeneidade de tronco humano e populações de Progenitor

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Isolamento, caracterização e baseada em MicroRNA modificação genética de células-tronco humanas folículo Dental

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...