Name: assessing stem cell dna integrity for cardiac cell therapy
Uploaded: 2019-01-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Stem Cell DNA Integrity for Cardiac Cell Therapy at JoVE.com

Эта работа частично поддержали национальные сердца, легких и крови института грантов RO1-HL-99507, HL-114120, HL-131017, HL138023 и UO1-HL-134764 (с J. Чжан) и американской сердца ассоциации научного развития Грант 17SDG33670677 (до р. Kannappan).

1. комета Assay
<ol><li>
Подготовка реагента
	<ol>
<li>Температура плавления агарозы место легкоплавких агарозы 500 мг в 100 мл ДНК- / РНК свободной воды. Нагрейте бутылку в микроволновой печи до тех пор, пока агарозы растворяет. Поместите бутылку в ванну воды 37 ° C до тех пор, пока требуется.<br...

<ol>
	<li>Bolli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+stem+cells+in+patients+with+ischaemic+cardiomyopathy+(SCIPIO):+initial+results+of+a+randomised+phase+1+trial.">Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial.</a> The Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).</li><li>Makkar, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracoronary+cardiosphere-derived+cells+for+heart+regeneration+after+myocardial+infarction+(CADUCEUS):+a+prospective,+randomised+phase+1+trial.">Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial.</a> The Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).</li><li>Tomita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+neural+crest+cells+contribute+to+the+dormant+multipotent+stem+cell+in+the+mammalian+heart.">Cardiac neural crest cells contribute to the dormant multipotent stem cell in the mammalian heart.</a> Journal of Cell Biology. 170 (7), 1135-1146 (2005).</li><li>Oyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+side+population+cells+have+a+potential+to+migrate+and+differentiate+into+cardiomyocytes+in+vitro+and+in+vivo.">Cardiac side population cells have a potential to migrate and differentiate into cardiomyocytes in vitro and in vivo.</a> Journal of Cell Biology. 176 (3), 329-341 (2007).</li><li>Fischer, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+myocardial+regeneration+through+genetic+engineering+of+cardiac+progenitor+cells+expressing+Pim-1+kinase.">Enhancement of myocardial regeneration through genetic engineering of cardiac progenitor cells expressing Pim-1 kinase.</a> Circulation. 120 (21), 2077-2087 (2009).</li><li>Cottage, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+progenitor+cell+cycling+stimulated+by+pim-1+kinase.">Cardiac progenitor cell cycling stimulated by pim-1 kinase.</a> Circulation Research. 106 (5), 891-901 (2010).</li><li>Angert, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+the+injured+adult+heart+involves+new+myocytes+potentially+derived+from+resident+cardiac+stem+cells.">Repair of the injured adult heart involves new myocytes potentially derived from resident cardiac stem cells.</a> Circulation Research. 108 (10), 1226-1237 (2011).</li><li>Kannappan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+Modulates+the+Fate+of+Cardiac+Progenitor+Cells+Ex+vivo+and+in+the+Diabetic+Heart+In+vivo.">p53 Modulates the Fate of Cardiac Progenitor Cells Ex vivo and in the Diabetic Heart In vivo.</a> EBioMedicine. 16, 224-237 (2017).</li><li>Hatzistergos, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+stimulate+cardiac+stem+cell+proliferation+and+differentiation.">Bone marrow mesenchymal stem cells stimulate cardiac stem cell proliferation and differentiation.</a> Circulation Research. 107 (7), 913-922 (2010).</li><li>Okita, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells:+opportunities+and+challenges.">Induced pluripotent stem cells: opportunities and challenges.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1575), 2198-2207 (2011).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cardiomyocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+repair+in+a+porcine+model+of+acute+myocardial+infarction+with+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiovascular+cells.">Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells.</a> Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+high+engraftment+of+patient-specific+cardiomyocyte+sheet+using+induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+adult+cardiac+fibroblast.">Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast.</a> Circulation: Heart Failure. 8 (1), 156-166 (2015).</li><li>Hirakawa, K., Midorikawa, K., Oikawa, S., Kawanishi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carcinogenic+semicarbazide+induces+sequence-specific+DNA+damage+through+the+generation+of+reactive+oxygen+species+and+the+derived+organic+radicals.">Carcinogenic semicarbazide induces sequence-specific DNA damage through the generation of reactive oxygen species and the derived organic radicals.</a> Mutation Research. 536 (1-2), 91-101 (2003).</li><li>Martinez, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+and+alkylating+damage+in+DNA.">Oxidative and alkylating damage in DNA.</a> Mutation Research. 544 (2-3), 115-127 (2003).</li><li>Valko, M., Rhodes, C. J., Moncol, J., Izakovic, M., Mazur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+radicals,+metals+and+antioxidants+in+oxidative+stress-induced+cancer.">Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer.</a> Chemico-Biological Interactions. 160 (1), 1-40 (2006).</li><li>Wiseman, H., Halliwell, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Damage+to+DNA+by+reactive+oxygen+and+nitrogen+species:+role+in+inflammatory+disease+and+progression+to+cancer.">Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species: role in inflammatory disease and progression to cancer.</a> Biochemical Journal. 313 (Pt 1), 17-29 (1996).</li><li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelectrophoretic+study+of+radiation-induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells.">Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 123 (1), 291-298 (1984).</li><li>Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells.">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.</a> Experimental Cell Research. 175 (1), 184-191 (1988).</li><li>Goichberg, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-associated+defects+in+EphA2+signaling+impair+the+migration+of+human+cardiac+progenitor+cells.">Age-associated defects in EphA2 signaling impair the migration of human cardiac progenitor cells.</a> Circulation. 128 (20), 2211-2223 (2013).</li><li>Kannappan, R., Mattapally, S., Wagle, P. A., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivation+domain+of+p53+regulates+DNA+repair+and+integrity+in+human+iPS+cells.">Transactivation domain of p53 regulates DNA repair and integrity in human iPS cells.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. , (2018).</li><li>Al-Baker, E. A., Oshin, M., Hutchison, C. J., Kill, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+UV-induced+damage+and+repair+in+young+and+senescent+human+dermal+fibroblasts+using+the+comet+assay.">Analysis of UV-induced damage and repair in young and senescent human dermal fibroblasts using the comet assay.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 126 (6-7), 664-672 (2005).</li><li>Azqueta, A., Gutzkow, K. B., Brunborg, G., Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+more+reliable+comet+assay:+optimising+agarose+concentration,+unwinding+time+and+electrophoresis+conditions.">Towards a more reliable comet assay: optimising agarose concentration, unwinding time and electrophoresis conditions.</a> Mutation Research. 724 (1-2), 41-45 (2011).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7 (10), R100 (2006).</li><li>Paradis, A. N., Gay, M. S., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binucleation+of+cardiomyocytes:+the+transition+from+a+proliferative+to+a+terminally+differentiated+state.">Binucleation of cardiomyocytes: the transition from a proliferative to a terminally differentiated state.</a> Drug Discovery Today. 19 (5), 602-609 (2014).</li></ol>

Целостность ДНК изображает целостность клеток. Клетки с поврежденной ДНК часто в стресс и в конечном итоге потерять их целостность. Целостность стволовых стволовых клеток, полученных клеток, которые распространяются для целей трансплантации и основных ячеек для выполнения их требуем...

Экспериментальные и клинические данные показывают, что трансплантация клеток умеренно может улучшить левого желудочка сократительной производительность при отсутствии сердца1,2,3,4,5 ,6,,78,9. Последние достижения открыли дальнейшего обжалования возможности для сердечно-сосудистой системы регенерации; к ним относятся принудительный выражение перепрограммирования факторов в соматических клетках побудить плюрипотентности и дифференцировать эти индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC) в различных линий сердца, главное cardiomyocyte (CM)10, 11 , 12 , 13. Наследственный материал в каждой ячейке, включая искусственно созданные iPSCs и iPSC производные см (iPS см), является ДНК. Генетические инструкции, хранящиеся в ДНК диктует рост, развитие и функции клеток, тканей, органов и организмов. ДНК не является инертным; Мобильный метаболитов, таких как карбонильных кислорода и азота, и алкилирующие агенты могут причина ДНК повреждения в vitro и in vivo в14,,1516,17. Важно отметить, что повреждение ДНК интуитивно происходит в каждой клетке, с частотой значительный. Если эти убытки не исправить, это приведет к мутации ДНК, сотовой старение, потеря целостности ДНК и ячеек, и возможно, заболеваний, включая раковые заболевания, угрожающие жизни. Таким образом сохраняя целостность ДНК имеет важное значение для любой ячейки, особенно iPSCs, которая имеет огромный потенциал в клинике.
Для оценки количества и целостности изолированных геномной ДНК, дорогое оборудование доступны на рынке. Однако не существует простых и экономически эффективных методов для оценки целостности ДНК в клетках без изоляции клеток. Кроме того пользователь ДНК-деградации во время изоляции ДНК является одним из основных недостатков в использовании этих методов. Одноклеточных гель электрофореза (известный как комета пробирного)18,19 и γH2A.X immunolabeling8 методы являются фундаментальные подходы в исследовательских лабораториях для оценки повреждения ДНК. Эти два метода не требуется дорогостоящее оборудование или изолированные геномной ДНК для анализа ДНК целостности8,,2021. Поскольку эти методы были выполнены с всей клетки; пользователя индуцированной деградации ДНК/РНК/белков во время подготовки пробы не будет затрагивать эти протоколы. Здесь чтобы оценить повреждение ДНК и ДНК повреждения ответ в стволовых и стволовых клеток, полученных клеток, мы предоставляем пошаговые протоколы для выполнения как комета пробирного и γH2A.X immunolabeling. Кроме того сочетание этих двух подходов, мы предлагаем наивно оценки, которая может использоваться для оценки пригодности клеток для трансплантации.
Комета пробирного, или одну ячейку электрофорез геля, измеряет разрывы ДНК в клетках. Клетки, встроенные в легкоплавких агарозы лизированы в форме нуклеоидах, содержащих supercoiled ДНК. После электрофореза небольшие кусочки фрагментированных ДНК и сломанной нити ДНК мигрируют через агарозы поры, тогда как нетронутыми ДНК, из-за их огромного размера и конъюгирования их с белками матрицы, будет иметь ограничения миграции. Шаблон окрашенных ДНК под микроскопом флуоресценции имитирует кометы. Голова кометы содержит нетронутыми ДНК и хвост состоит из фрагментов и сломанной нити ДНК. Фракция повреждения ДНК может измеряться по интенсивности флуоресценции поврежденной ДНК (хвост кометы) относительно неизменной интенсивности (голова кометы) ДНК. Данный параметр хвост момент может быть рассчитана, как показано на рисунке 1.
Повреждение ДНК вызывает фосфорилирование гистона Н2А. X (γH2A.X) в Ser139, ATM, ATR и ДНК-PK киназы. Фосфорилирование и вербовка Н2А. X на разрывы ДНК пряди называется ДНК повреждения ответ (РДР) и быстро происходит после повреждения ДНК. Этот процесс, КПП опосредованной клеточного цикла ареста и ДНК инициировал ремонт процессы. После успешного завершения восстановления ДНК γH2A.X dephosphorylated и инактивированных фосфатаз. Длительные и несколько разрывы ДНК пряди приводят к накоплению очагов γH2A.X в ДНК. Это указывает на неспособность ячейки для ремонта повреждений ДНК и потеря целостности ДНК. Эти очаги γH2A.X в ДНК может быть идентифицирован и количество DDR очагов могут быть подсчитаны с использованием протокола в разделе 2.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slide</td>
			<td>Millicell</td>
			<td>PEZGS0816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td>Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure 
			Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson Immuno 
			Research Laboratories</td>
			<td>711-545-152 
			(RRID: AB_2313584)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson Immuno 
			Research Laboratories</td>
			<td>711-165-152 
			(RRID:AB_2307443)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco B-27 Supplement, Serum Free,</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel growth factor reduced</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhalloidinA488</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2577 (RRID: AB_2118010)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR&#160;Green I nucleic acid gel stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Low melting Point Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Antifade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing stem cell dna integrity for cardiac cell therapy

Стебель и стволовых клеток, полученных клетки имеют огромный потенциал как регенеративной терапии для различных дегенеративных заболеваний. ДНК является склад генетических данных во всех клетках, в том числе стволовых клеток, и ее целостность имеет основополагающее значение для его регенеративные способности. Стволовые клетки претерпевают быстрое распространение в лабораториях для достижения необходимого числа для трансплантации. Ускоренное клеточный рост приводит к потере целостности ДНК накопленных метаболитов, таких как кислорода, карбонил и алкилирующие агенты. Пересадка эти клетки приведет к плохой приживления и регенерации органов ухудшение. Кроме того, пересадке ДНК поврежденных клеток приводит к мутации, нестабильность ДНК и клеточного старения и возможно, угрожающих жизни заболеваний, как рак. Таким образом существует настоятельная необходимость для метода контроля качества для оценки пригодности клеток для трансплантации. Здесь мы предоставляем пошаговые протоколы для оценки целостности ДНК стволовых клеток до трансплантации клеток.

Были искусственного человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, и повреждения ДНК и хвост момент, которые были использованы как мера целостности ДНК, были проанализированы пробирного кометы. ИПК клетки были встроенные в температура плавления агарозы и ...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Stem Cell DNA Integrity for Cardiac Cell Therapy at JoVE.com

Assessing Stem Cell DNA Integrity for Cardiac Cell Therapy

Оценки целостности ДНК стволовых клеток для сердечно клеточной терапии

Здесь мы предоставляем подробное описание экспериментальной установки для анализа оценки целостности ДНК в стволовых клеток до трансплантации клеток.

Stem and stem-cell-derived cells have immense potential as a regenerative therapy for various degenerative diseases. DNA is the storehouse of genetic data ...

Для неонатальных заболеваний, таких как кардиомиопатия, регенеративная терапия с использованием индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных клеток имеет огромный потенциал. Однако ускоренный рост клеток в пробирке приводит к повреждению ДНК накопленными метаболитами, такими как реактивные виды кислорода. Трансплантация этих поврежденных ДНК клеток приведет к плохой при пересадке и регенерации органа.Перед трансплантацией необходимо оценить качество клеток. Здесь мы предоставляем два пошаговых протокола для оценки повреждения ДНК в стволовых клетках. Демонстрация процедур будет Джессика Миллер, исследователь, Nikhil Mardhekar, исследователь, и Vasanthi Rajasekaran, лаборант.Для начала поместите 500 миллиграммов низкоплавильной агарозы в 100 миллилитров ДНК-РНК свободной воды. Нагрейте бутылку в микроволновой печи, пока агароза не растворится. Затем поместите бутылку в 37-градусную ванну с водой до тех пор, пока это необходимо.Чтобы подготовить предварительно покрытые слайды кометы, поместите несколько капель 0,5%agarose на стеклянную горку. Немедленно выложить агарозу, чтобы сформировать тонкий слой агарозного покрытия с помощью крышки. Работая в условиях низкой освещенности, чтобы избежать повреждения клеток, вызванных ультрафиолетовым светом, смешайте 10 микролитров клеточной подвески и 90 микролитров раствора агарозы в трубке.Поместите трубку в 37-градусную ванну с водой, чтобы предотвратить затвердевающую агарозу. Смешайте раствор без введения пузырьков воздуха и пипетки 70 микролитров на место на предварительно покрытой кометной горке. Используя наконечник пипетки, распределить смесь агарозы клетки, чтобы сформировать тонкий слой.Поместите слайд при четырех градусах по Цельсию в течение 15 минут. В контейнере полностью погрузите горку в холодный лизный буфер. Поместите контейнер в темноте при четырех градусах по Цельсию в течение одного часа.Замените буфер лиза холодным щелочным раствором. Убедитесь, что слайды полностью погружены в воду. Оставив контейнер в темноте при четырех градусах по Цельсию еще на 30 минут, поместите горку в горизонтальный электрофорезный бак.Заполните бак холодным щелочным электрофорезным буфером до тех пор, пока горки не будут полностью погружены в воду. Нанесите напряжение на один вольт на сантиметр в течение 15-30 минут. В контейнере полностью погрузим горку в холодную деионизированную воду.Через две минуты снимите деионизированную воду и добавьте свежую деионизированную воду, а затем повторите этот шаг во второй раз. Далее замените деионизированную воду холодным 70%этанолом. Через пять минут аккуратно удалите слайд, не наклоняя его и дайте ему высохнуть.После того, как сушеные, добавить 100 микролитров разбавленного красителя ДНК в каждом месте, и ждать 15 минут при комнатной температуре. Используя фильтр FITC в микроскопе эпифлуоресценции, сделайте снимки от 50 до 100 комет в общей сложности на образец. Культура iPS-производных кардиомиоцитов, как описано в текстовом протоколе.Чтобы увидеть кардиомиоциты, полученные iPS, в камерных слайдах, сначала выбросьте культурную среду из колодцев и трижды промыте клетки с помощью PBS. Добавьте один миллилитр 0,25%трипсина на колодец и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение пяти минут. Проверьте пластину под микроскопом для клеточного отслоения.Затем добавьте один миллилитр CMM, чтобы остановить трипсин. Поместите подвеску клетки в 15-миллилитровую трубку и центрифугу в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и 200 раз г. Откажитесь от среды, добавьте один миллилитр МММ и повторно посовелите клетки.Подсчитайте клетки и отрегулируйте количество клеток, чтобы получить два миллиона клеток в 1,6 миллилитров CMM. Теперь семя 200 микролитров клеточной подвески на колодец из восьми-хорошо камеры слайда. Нажмите слайд осторожно, чтобы распространить клетки вокруг хорошо.Инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию. Для лечения кардиомиоцитов доксорубицина, полученных iPS, отбросить культурную среду из колодцев кардиомиоцитов, полученных iPS, и промыть клетки с помощью PBS. Лечить клетки с одномомолярного доксорубицина в течение четырех часов при 37 градусах по Цельсию.Аспирировать среды, и мыть клетки с PBS. Для выполнения иммунолабеля, мыть клетки три раза с PBS и добавить 200 микролитров свежеприготовленных 4%paraformaldehyde к каждому хорошо. Исправить клетки в течение 20 минут в темноте при комнатной температуре.После мытья клеток с PBS, добавить 200 микролитров блокирующего буфера на колодец, и блок в течение 30 минут в увлажненной камере при комнатной температуре. Удалите блокирующий буфер и добавьте 200 микролитров первичного раствора антител. После инкубации в течение 45 минут в темной увлажненной камере при комнатной температуре, мыть колодцы три раза с PBS.Удалите PBS и добавьте 200 микролитров вторичной смеси антител. Инкубировать в течение 45 минут в темной увлажненной камере при комнатной температуре. Затем мыть колодцы три раза с PBS.Вымойте деионизированной водой перед монтажом горок с антифадой. Поместите крышку стекла, и хранить слайды в темноте при четырех градусах по Цельсию. Используя конфокальный микроскоп, сделайте три-пять изображений случайных полей на образец и приступайте к анализу изображений.Для подсчета ДНК повреждения ответ foci, скачать и установить CellProfiler. Выберите файл, импорт, конвейер из файла и выберите файл конвейера под названием puncti gamma-H2AX. Перетащите и опустите папку, содержащую приобретенные изображения гамма-H2AX foci, в окно списка файлов в разделе изображений входных модулей для анализа.Затем следуйте инструкциям, как показано в текстовом протоколе. Чтобы установить параметры для изображений, перетащите нужное изображение для анализа в список файлов. Под входные модули выберите изображения.Также в входных модулях выберите метаданные, а затем выберите имена и типы. Для групп выберите нет. Работая в аналитических модулях, выберите цвет серый.Затем выберите гладкий, выберите определить основные объекты, и снова выберите гладкой. Далее выберите улучшить или подавить функции, а затем выбрать определить основные объекты. По-прежнему работая в аналитических модулях, выберите связанные объекты, затем классифицируем объекты и, наконец, выберите экспорт в электронную таблицу.Нажмите проанализировать изображения в нижней левой панели для выполнения анализа изображений. При успешном завершении анализа генерируется несколько изображений. Обратите внимание на файл CSV, который генерируется и сохраняется в соответствующем месте на компьютере.Этот файл содержит количественные данные для дальнейшего анализа. В электронной таблице, называемой моим экспериментальное изображение, столбец B будет иметь количество ядер, которые имеют до пяти puncti, и столбец D будет иметь количество ядер, которые имеют более пяти puncti. Добавьте столбцы B и D, чтобы получить общее количество ядер.Повторите эти шаги для всех изображений, изменив имя файла эксперимента перед каждым анализом. Здесь показаны репрезентативные микрографы комет из доксо-обработанных и необработавных клеток iPS. Базальное количество повреждений ДНК было обнаружено в клетках iPS, выраженное как доля повреждения ДНК и хвостовой момент.Тем не менее, лечение доксо увеличило повреждение ДНК в клетках iPS, как и ожидалось, что указывает на то, что анализ кометы может быть использован для оценки целостности ДНК в плюрипотентных стволовых клетках. Здесь показаны репрезентативные микрографы иммунолабеля гамма-H2AX при более низком увеличении и при более высоком увеличении. В контрольных кардиомиоцитах, полученных iPS, более 90% клеток имели менее пяти DDR foci на ядра.И в общей сложности менее 10% клеток имели более шести DDR foci на ядра. Для кардиомиоцитов, полученных iPS, которые культурированы в течение шести месяцев, менее 90% клеток имели до пяти DDR foci на ядра, и в общей сложности более 13% клеток имели более шести DDR foci на ядра. В то время как в доксо-обработанных иПС полученных кардиомиоцитов, менее 80% клеток было до пяти DDR очагов на ядра.И в общей сложности около 24% клеток имели более шести DDR foci на ядра. Эти данные свидетельствуют о том, что длительная культура клеток кардиомиоцитов, полученных iPS, и лечение доксо индуцируют значительные повреждения ДНК, что делает их непригодными для трансплантации клеток. Очень важно избегать переменных при смешивании клеточной подвески, так как это может повлиять на электрофорез.Следуя этой процедуре, вы можете выполнить анализ кометы и иммунолабеля процедуры с клетками различных типов. Эти методы позволят для клеток различных видов, которые будут оцениваться на повреждение ДНК, прежде чем использоваться в исследованиях трансплантации клеток.

Research

JoVE Journal

Genetics

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

Инженерной искусственных факторов в частности Манипулирование альтернативного сплайсинга в клетках человека

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Сопоставление взаимодействия РНК-РНК в глобальном масштабе с использованием биотинилированного псоралена

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Использование Флуоресцентный ПЦР-капиллярного электрофореза гель Техника генотипу CRISPR / cas9-опосредованной Нокаут Мутанты в формате высокой пропускной способностью

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

Универсальный протокол для крупномасштабных gRNA библиотека производства из любого источника ДНК

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Полуколичественного обнаружение РНК зависимой РНК-полимеразы активности человека теломеразы транскриптазы белка

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Профилирования времени репликации ДНК, используя данио рерио как в естественных условиях модель системы

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Высокоэффективные гена срыв мышиных и человека гемопоэтических предшественников клеток ТРИФОСФАТЫ/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

Комбинаторные одноклеточных подход к характеризуют молекулярных и иммунофенотипических неоднородность человеческих стволовых и прогениторных населения

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Изоляция, характеристика и микроРНК основе генетической модификации человека Стоматологическая фолликула стволовых клеток

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...