Name: assessing stem cell dna integrity for cardiac cell therapy
Uploaded: 2019-01-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Stem Cell DNA Integrity for Cardiac Cell Therapy at JoVE.com

Detta arbete var stöds delvis av nationella hjärta, lungor och blod Institute bidrag RO1-HL-99507, HL-114120, HL-131017, HL138023 och UO1-HL-134764 (till J. Zhang) och av amerikanska hjärtat Association vetenskapliga utveckling Grant 17SDG33670677 (till R. Gitta).

1. kometen Assay
<ol><li>
REAGENSBEREDNING
	<ol>
<li>För låg--smältpunkt agaros, placera 500 mg låg-smältande agaros i 100 mL DNA- / RNA-gratis vatten. Värm flaskan i en mikrovågsugn tills Agarens upplöser. Placera flaskan i 37 ° C vattenbad tills den behövs. Obs: För vidare läsning, se Azqueta et al., som studerat effekterna av agaros koncentrationen på DNA-återgång tiden och flera elektrofores faktorer23.</li>
		<li>Späd SYBR green DNA färg...

<ol>
	<li>Bolli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+stem+cells+in+patients+with+ischaemic+cardiomyopathy+(SCIPIO):+initial+results+of+a+randomised+phase+1+trial.">Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial.</a> The Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).</li><li>Makkar, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracoronary+cardiosphere-derived+cells+for+heart+regeneration+after+myocardial+infarction+(CADUCEUS):+a+prospective,+randomised+phase+1+trial.">Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial.</a> The Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).</li><li>Tomita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+neural+crest+cells+contribute+to+the+dormant+multipotent+stem+cell+in+the+mammalian+heart.">Cardiac neural crest cells contribute to the dormant multipotent stem cell in the mammalian heart.</a> Journal of Cell Biology. 170 (7), 1135-1146 (2005).</li><li>Oyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+side+population+cells+have+a+potential+to+migrate+and+differentiate+into+cardiomyocytes+in+vitro+and+in+vivo.">Cardiac side population cells have a potential to migrate and differentiate into cardiomyocytes in vitro and in vivo.</a> Journal of Cell Biology. 176 (3), 329-341 (2007).</li><li>Fischer, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+myocardial+regeneration+through+genetic+engineering+of+cardiac+progenitor+cells+expressing+Pim-1+kinase.">Enhancement of myocardial regeneration through genetic engineering of cardiac progenitor cells expressing Pim-1 kinase.</a> Circulation. 120 (21), 2077-2087 (2009).</li><li>Cottage, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+progenitor+cell+cycling+stimulated+by+pim-1+kinase.">Cardiac progenitor cell cycling stimulated by pim-1 kinase.</a> Circulation Research. 106 (5), 891-901 (2010).</li><li>Angert, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+the+injured+adult+heart+involves+new+myocytes+potentially+derived+from+resident+cardiac+stem+cells.">Repair of the injured adult heart involves new myocytes potentially derived from resident cardiac stem cells.</a> Circulation Research. 108 (10), 1226-1237 (2011).</li><li>Kannappan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+Modulates+the+Fate+of+Cardiac+Progenitor+Cells+Ex+vivo+and+in+the+Diabetic+Heart+In+vivo.">p53 Modulates the Fate of Cardiac Progenitor Cells Ex vivo and in the Diabetic Heart In vivo.</a> EBioMedicine. 16, 224-237 (2017).</li><li>Hatzistergos, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+stimulate+cardiac+stem+cell+proliferation+and+differentiation.">Bone marrow mesenchymal stem cells stimulate cardiac stem cell proliferation and differentiation.</a> Circulation Research. 107 (7), 913-922 (2010).</li><li>Okita, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells:+opportunities+and+challenges.">Induced pluripotent stem cells: opportunities and challenges.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1575), 2198-2207 (2011).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cardiomyocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+repair+in+a+porcine+model+of+acute+myocardial+infarction+with+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiovascular+cells.">Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells.</a> Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+high+engraftment+of+patient-specific+cardiomyocyte+sheet+using+induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+adult+cardiac+fibroblast.">Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast.</a> Circulation: Heart Failure. 8 (1), 156-166 (2015).</li><li>Hirakawa, K., Midorikawa, K., Oikawa, S., Kawanishi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carcinogenic+semicarbazide+induces+sequence-specific+DNA+damage+through+the+generation+of+reactive+oxygen+species+and+the+derived+organic+radicals.">Carcinogenic semicarbazide induces sequence-specific DNA damage through the generation of reactive oxygen species and the derived organic radicals.</a> Mutation Research. 536 (1-2), 91-101 (2003).</li><li>Martinez, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+and+alkylating+damage+in+DNA.">Oxidative and alkylating damage in DNA.</a> Mutation Research. 544 (2-3), 115-127 (2003).</li><li>Valko, M., Rhodes, C. J., Moncol, J., Izakovic, M., Mazur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+radicals,+metals+and+antioxidants+in+oxidative+stress-induced+cancer.">Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer.</a> Chemico-Biological Interactions. 160 (1), 1-40 (2006).</li><li>Wiseman, H., Halliwell, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Damage+to+DNA+by+reactive+oxygen+and+nitrogen+species:+role+in+inflammatory+disease+and+progression+to+cancer.">Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species: role in inflammatory disease and progression to cancer.</a> Biochemical Journal. 313 (Pt 1), 17-29 (1996).</li><li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelectrophoretic+study+of+radiation-induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells.">Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 123 (1), 291-298 (1984).</li><li>Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells.">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.</a> Experimental Cell Research. 175 (1), 184-191 (1988).</li><li>Goichberg, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-associated+defects+in+EphA2+signaling+impair+the+migration+of+human+cardiac+progenitor+cells.">Age-associated defects in EphA2 signaling impair the migration of human cardiac progenitor cells.</a> Circulation. 128 (20), 2211-2223 (2013).</li><li>Kannappan, R., Mattapally, S., Wagle, P. A., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivation+domain+of+p53+regulates+DNA+repair+and+integrity+in+human+iPS+cells.">Transactivation domain of p53 regulates DNA repair and integrity in human iPS cells.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. , (2018).</li><li>Al-Baker, E. A., Oshin, M., Hutchison, C. J., Kill, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+UV-induced+damage+and+repair+in+young+and+senescent+human+dermal+fibroblasts+using+the+comet+assay.">Analysis of UV-induced damage and repair in young and senescent human dermal fibroblasts using the comet assay.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 126 (6-7), 664-672 (2005).</li><li>Azqueta, A., Gutzkow, K. B., Brunborg, G., Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+more+reliable+comet+assay:+optimising+agarose+concentration,+unwinding+time+and+electrophoresis+conditions.">Towards a more reliable comet assay: optimising agarose concentration, unwinding time and electrophoresis conditions.</a> Mutation Research. 724 (1-2), 41-45 (2011).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7 (10), R100 (2006).</li><li>Paradis, A. N., Gay, M. S., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binucleation+of+cardiomyocytes:+the+transition+from+a+proliferative+to+a+terminally+differentiated+state.">Binucleation of cardiomyocytes: the transition from a proliferative to a terminally differentiated state.</a> Drug Discovery Today. 19 (5), 602-609 (2014).</li></ol>

DNA integritet porträtterar cellernas integritet. Celler med skadat DNA är ofta stress och så småningom förlorar sin integritet. Stamceller och stamceller-cell-derived celler som sprids i syfte att transplantation integritet är rektor för cellerna att utföra deras önskad funktion. Transplantation av celler med skadat DNA skulle resultera i en dålig engraftment hastighet och prestanda av cell8,20. Att undersöka DNA integritet före stamcellstransplantat...

Experimentella och kliniska bevis visar att stamcellstransplantation kan måttligt förbättra vänster kammare kontraktila misslyckas hjärtan1,2,3,4,5 ,6,7,8,9. Senaste framstegen har öppnat ytterligare tilltalande möjligheter för kardiovaskulär föryngring. Dessa omfattar uttrycket påtvingad omplanering faktorer i kroppsceller att inducera pluripotency och differentiera dessa inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) i olika hjärt härstamningar, huvudsakligen hjärtmuskelcellen (CM)10, 11 , 12 , 13. de ärftligt materiellt i varje cell, inklusive artificiellt genererade iPSCs och iPSC-derived CM (iPS-CM), är DNA. De genetiska instruktioner lagras i DNA dikterar tillväxt, utveckling och funktion av celler, vävnader, organ och organismer. DNA är inte inert; cell metaboliter, såsom reaktiva syre, karbonyl och kväve arter, och alkylerande medel kan orsaka DNA skada in vitro- och in vivo14,15,16,17. Ännu viktigare, uppstår DNA-skador intuitivt i varje cell, med en betydande frekvens. Om dessa skador inte åtgärdas kommer det leda till DNA mutation, cellulära åldras, förlusten av DNA och cell integritet, och eventuellt sjukdomar, inklusive livshotande cancerformer. Därför är behåller DNA integritet viktigt till en cell, särskilt iPSCs, som har en enorm potential i kliniken.
För att bedöma kvantitet och integritet isolerat genomiskt DNA, finns dyra utrustning tillgänglig på marknaden. Men finns det inga enkla och kostnadseffektiva metoder för att bedöma integriteten DNA i cellerna utan att isolera cellerna. Dessutom är användare-inducerad DNA nedbrytning under DNA isolering en av de stora nackdelarna med att använda dessa metoder. Encelliga gelelektrofores (känd som komet assay)18,19 och γH2A.X immunolabeling8 tekniker är grundläggande synsätt i forskningslaboratorier för bedömning av DNA-skador. Dessa två metoder kräver inte dyr utrustning eller isolerat genomiskt DNA att analysera DNA integritet8,20,21. Eftersom har dessa tekniker utförts med hela celler; användaren-inducerad DNA/RNA/protein nedbrytning under provberedningen kommer inte att påverka dessa protokoll. Här, för att bedöma DNA-skada och DNA skada svar i stammen och stem-cell-derived celler, tillhandahåller vi stegvisa protokoll för att utföra båda komet assay och γH2A.X immunolabeling. Dessutom föreslår vi att kombinera dessa två strategier, en naiv bedömning som kan användas för att bedöma cellens lämplighet för transplantation.
Det komet assay eller encelliga gel elektrofores, åtgärder DNA raster i celler. Celler inbäddade i låg-smältande agaros är lyserat till formuläret nucleoids innehållande supercoiled DNA. Vid elektrofores migrera små bitar av fragmenterade DNA och trasiga DNA-strängar genom agarosgelelektrofores porerna, medan intakta DNA, på grund av sin enorma storlek och deras konjugering med proteinet matrix, kommer att ha en begränsad invandring. Mönstret av färgade DNA i fluorescens Mikroskop härmar en komet. Komet huvudet innehåller intakta DNA och svansen är består av fragment och trasiga DNA-strängar. Fraktionen av DNA-skador kan mätas genom fluorescensintensiteten hos skadade DNA (komet svans) relativt intakta DNA (komet huvud) intensiteten. Parametern svans nu kan beräknas som visas i figur 1.
DNA-skada inducerar fosforyleringen av Histon H2A. X (γH2A.X) på Ser139 av ATM, ATR och DNA-PK kinaser. Fosforylering och rekrytering av H2A. X vid DNA strand raster kallas DNA skador svar (DDR) och händer snabbt efter DNA är skadad. Efter denna process, checkpoint-medierad cellcykelarrest och DNA reparationsprocesser initieras. Efter det framgångsrika slutförandet av DNA-reparation, är γH2A.X defosforyleras och inaktiverat av fosfataser. Långvarig och flera DNA strand raster leda till ansamling av γH2A.X foci i DNA. Detta anger cellens oförmåga att reparera DNA-skador och förlust av DNA integritet. Dessa γH2A.X foci i DNA kan identifieras genom och antalet DDR foci kan räknas med protokollet i avsnitt 2.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slide</td>
			<td>Millicell</td>
			<td>PEZGS0816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td>Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure 
			Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson Immuno 
			Research Laboratories</td>
			<td>711-545-152 
			(RRID: AB_2313584)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson Immuno 
			Research Laboratories</td>
			<td>711-165-152 
			(RRID:AB_2307443)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco B-27 Supplement, Serum Free,</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel growth factor reduced</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhalloidinA488</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2577 (RRID: AB_2118010)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR&#160;Green I nucleic acid gel stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Low melting Point Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Antifade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing stem cell dna integrity for cardiac cell therapy

Stammen och stem-cell-derived celler har enorm potential som en regenerativ terapi för olika degenerativa sjukdomar. DNA är förrådshuset av genetiska data i alla celler, inklusive stamceller, och dess integritet är grundläggande för dess regenerativ förmåga. Stamceller genomgå forförökningen i labb att uppnå den nödvändiga nummer för transplantation. Accelererad celltillväxt leder till förlust av DNA integritet av ackumulerade metaboliter, såsom reaktiva syre, karbonyl och alkylerande medel. Transplantera dessa celler skulle resultera i dålig engraftment och regenerering av försämrade orgeln. Dessutom omplantering DNA-skadade celler leder till mutationer, DNA instabilitet, cellulära åldras, och möjligen livshotande sjukdomar som cancer. Därför finns det ett omedelbart behov av en kvalitetskontroll metod att bedöma cellens lämplighet för transplantation. Här, tillhandahåller vi stegvisa protokoll för bedömning av DNA integritet stamceller före stamcellstransplantation.

Mänskliga inducerade pluripotenta stamceller odlades och de DNA-skadan och svans nu, som användes som ett mått på DNA integritet, analyserades av komet assay. iPS-celler var inbäddade i låg--smältpunkt agaros och placeras på en glasskiva. Cellerna, sedan behandlades med lyseringsbuffert, följt av en alkalisk lösning, att få supercoiled DNA. Nucleoids var electrophoresed och kometer var visualiserat av DNA dye (figur 1A-D). Kometer,...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Stem Cell DNA Integrity for Cardiac Cell Therapy at JoVE.com

Assessing Stem Cell DNA Integrity for Cardiac Cell Therapy

Bedömningen av Stem Cell DNA integritet för hjärt cellterapi

Här, ger vi en detaljerad beskrivning av ett experiment för en analys av bedömning av DNA integritet i stamceller före stamcellstransplantation.

Stem and stem-cell-derived cells have immense potential as a regenerative therapy for various degenerative diseases. DNA is the storehouse of genetic data ...

För neonatal sjukdomar såsom kardiomyopati, regenerativ terapi med hjälp av inducerad pluripotenta stamceller-härledda celler har massiv potential. In vitro-accelererad celltillväxt leder dock till DNA-skador genom ackumulerade metaboliter som reaktiva syrearter. Transplantation av dessa DNA-skadade celler skulle resultera i dålig engraftment och regenerering av organet.Före transplantationen bör cellernas kvalitet bedömas. Här tillhandahåller vi två steg-för-steg-protokoll för att bedöma DNA-skadan i stamceller. Demonstrera förfarandena kommer att Jessica Miller, en forskare, Nikhil Mardhekar, en forskare, och Vasanthi Rajasekaran, en lab tekniker.Till att börja med, placera 500 milligram lågsmältning uppstod i 100 milliliter DNA-RNA fritt vatten. Värm flaskan i en mikrovågsugn tills agarosen löser sig. Placera sedan flaskan i ett 37-graders-Celsius vattenbad tills det behövs.För att förbereda pre-coated komet diabilder, placera några droppar 0,5%agaros på ett glas slide. Omedelbart sprida agaros att bilda ett tunt lager av agaros beläggning med hjälp av en täckskydd. Arbeta under svagt ljus förhållanden för att undvika ultraviolett ljus-inducerad cellskador, blanda 10 mikroliter av cell suspension och 90 mikroliter av agaroslösning i ett rör.Placera röret i en 37-graders-Celsius vattenbad för att förhindra att agaros från stelnar. Blanda lösningen utan att introducera luftbubblor, och pipettera 70 mikroliter per plats på den förlackerade kometsglaset. Med hjälp av en pipettspets, sprida cellen agaros blandningen för att bilda ett tunt lager.Placera bilden på fyra grader Celsius i 15 minuter. I en behållare, helt dränka bilden i kall lysbuffert. Placera behållaren i mörker vid fyra grader Celsius i en timme.Byt ut lysbufferten mot kall alkalisk lösning. Se till att bilderna är helt nedsänkta. Efter att ha lämnat behållaren i mörker vid fyra grader Celsius i ytterligare 30 minuter, placera bilden i en horisontell elektroforestank.Fyll tanken med kall alkalisk elektroforesbuffert tills objektglasen är helt nedsänkta. Applicera spänning vid en volt per centimeter i 15 till 30 minuter. I en behållare, helt dränka bilden i kallt avjoniserat vatten.Efter två minuter, ta bort avjoniserat vatten och tillsätt färsk avjoniserat vatten, och sedan upprepa detta steg en andra gång. Därefter ersätter dejoniserat vatten med kall 70%etanol. Efter fem minuter, ta försiktigt bort bilden utan att luta den och låt den lufttorka.När torkat, tillsätt 100 mikroliter av utspädd DNA-färgämne till varje plats, och vänta 15 minuter vid rumstemperatur. Med hjälp av ett FITC-filter i ett epifluorescensmikroskop tar du bilder på 50 till 100 kometer totalt per prov. Kultur iPS-härledda kardiomyocyter som beskrivs i textprotokollet.För att se iPS-härledda kardiomyocyter i kammarglas, först kasta odlingsmediet från brunnarna, och tvätta cellerna tre gånger med PBS. Tillsätt en milliliter på 0,25%Trypsin per brunn, och inkubera vid 37 grader Celsius i fem minuter. Kontrollera plattan under mikroskop för cellavlossning.Lägg sedan till en milliliter CMM för att stoppa Trypsin. Placera cellupphängningen i ett 15-milliliterrör och centrifug i fem minuter vid fyra grader Celsius och 200 gånger g. Kassera mediet, tillsätt en milliliter CMM och återanvänd cellerna.Räkna cellerna och justera cellen räknas för att få två miljoner celler i 1,6 milliliter AV CMM. Nu utsäde 200 mikroliter av cell suspension per brunn av åtta-brunn kammare slide. Tryck försiktigt på bilden för att sprida cellerna runt brunnen.Inkubera cellerna i 37 grader Celsius. För iPS-härledda kardiomycyt doxorubicin behandling, kassera odlingsmediet från iPS-härledda kardiomyocyte brunnar, och tvätta cellerna med PBS. Behandla cellerna med en-mikromolar doxorubicin i fyra timmar vid 37 grader Celsius.Aspirera mediet, och tvätta cellerna med PBS. För att utföra immunolabeling, tvätta cellerna tre gånger med PBS och tillsätt 200 mikroliter av nyberedda 4%paraformaldehyd till varje brunn. Fixera cellerna i 20 minuter i mörker vid rumstemperatur.Efter tvätt av cellerna med PBS, tillsätt 200 mikroliter av blockerande buffert per brunn, och blockera i 30 minuter i en befuktad kammare vid rumstemperatur. Ta bort den blockerande bufferten och lägg till 200 mikroliter av primär antikroppslösning. Efter inkubation i 45 minuter i en mörkfuktad kammare i rumstemperatur, tvätta brunnarna tre gånger med PBS.Ta bort PBS och tillsätt 200 mikroliter av sekundär antikroppsmix. Inkubera i 45 minuter i en mörkfuktad kammare i rumstemperatur. Tvätta sedan brunnarna tre gånger med PBS.Tvätta med avjoniserat vatten innan du monterar rutschbanorna med antifade. Placera ett täckglas, och förvara diabilderna i mörker vid fyra grader Celsius. Med hjälp av ett konfokalmikroskop tar du tre till fem bilder av slumpmässiga fält per prov och fortsätter till bildanalys.För att räkna DNA-skador svar foci, ladda ner och installera CellProfiler. Välj fil, import, pipeline från filen och välj pipeline-filen med namnet puncti gamma-H2AX. Dra och släpp mappen som innehåller de förvärvade bilderna av gamma-H2AX-foci till fillistfönstret i avsnittet med ingående modulers bilder för analys.Följ sedan instruktionerna enligt textprotokollet. Om du vill ställa in parametrarna för bilderna drar du den önskade bilden för analys till fillistan. Välj bilder under indatamoduler.Även i indatamoduler väljer du metadata och väljer sedan namn och typer. För grupper väljer du nej. Arbeta i analysmoduler, välj färg till grå.Välj sedan utjämnat, välj identifiera primära objekt och återigen markera utjämna. Nästa markera förbättra eller undertrycka funktioner och välj sedan identifiera primära objekt. Fortfarande arbetar i analys moduler, välj relatera objekt, sedan klassificera objekt, och slutligen välja exportera till kalkylblad.Klicka på analysera bilder längst ned till vänster panelen för att utföra bildanalys. Vid ett framgångsrikt slutförande av analysen genereras flera bilder. Observera CSV-filen som genereras och sparas på lämplig plats på datorn.Denna fil innehåller de kvantitativa uppgifterna för vidare analys. I kalkylbladet som kallas min experimentbild, kolumn B kommer att ha antalet kärnor som har upp till fem puncti, och kolumn D kommer att ha antalet kärnor som har mer än fem punktspråk. Lägg till kolumnerna B och D för att få det totala antalet kärnor.Upprepa dessa steg för alla bilder, ändra mitt experiment filnamn före varje analys. Representativa mikrografer av kometer från doxo-behandlade och icke-behandlade iPS-celler visas här. En basal mängd DNA-skador hittades i iPS-celler, uttryckt som en bråkdel av DNA-skador och svans ögonblick.Doxo-behandlingen ökade dock DNA-skadan i iPS-celler som förväntat, vilket indikerar att kometanalysen kan användas för att bedöma DNA-integritet i pluripotenta stamceller. Representativa mikrografer av gamma-H2AX immunolabeling visas här, vid lägre förstoring och vid högre förstoring. I kontrollen iPS-härledda kardiomyocyter, hade mer än 90%av cellerna mindre än fem DDR högborgar per atomkärnor.Och totalt mindre än 10%av cellerna hade mer än sex DDR-foci per kärnor. För iPS-härledda kardiomyocyter odlade i sex månader, hade mindre än 90%av cellerna upp till fem DDR högborgar per atomkärnor, och totalt mer än 13%av cellerna hade mer än sex DDR högborgar per kärnor. Medan i doxo-behandlade iPS-härledda kardiomyocyter, mindre än 80%av cellerna hade upp till fem DDR högborgar per kärnor.Och totalt cirka 24%av cellerna hade mer än sex DDR foci per kärnor. Dessa data indikerar att långvarig iPS-härledda kardiomyocyte cell kultur och doxo behandling inducerad betydande DNA-skador, vilket gör dem olämpliga för cell transplantation. Det är mycket viktigt att undvika variabler medan blandning av cellfjädringen, eftersom detta kan påverka elektrofores.Efter denna procedur kan du utföra kometanalyserna och de immunolabeling förfaranden med celler av olika typer. Dessa tekniker kommer att göra det möjligt för celler av olika slag att bedömas för DNA-skador innan de används i celltransplantation studier.

Research

JoVE Journal

Genetics

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

Engineering Artificiella Faktorer att specifikt Manipulera alternativ splitsning i humana celler

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Kartläggning av RNA-RNA-interaktioner globalt med användning av biotinylerad psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Med hjälp av en fluorescerande PCR-kapillärgelelektrofores Technique att genotypa CRISPR / Cas9-medierad Knockout mutanter i en hög kapacitet Format

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

Ett universellt protokoll för storskaliga gärna biblioteket produktion från någon DNA-källa

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Halvkvantitativ detektion av RNA-beroende RNA-polymeras aktivitet av mänskliga telomeras omvänt transkriptas Protein

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profilering DNA Replication Timing med zebrafiskar som ett In Vivo -modellsystem

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Högeffektiva gen störningar av murina och mänskliga hematopoetiska stamceller av CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

En kombinatorisk Single-cell strategi att karaktärisera molekylära och Immunophenotypic heterogenitet av mänskliga stamceller och stamceller populationer

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Isolering, karakterisering och mikroRNA-baserad genetisk modifiering av mänskliga dentala follikeln stamceller

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...