Name: assessing stem cell dna integrity for cardiac cell therapy
Uploaded: 2019-01-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Stem Cell DNA Integrity for Cardiac Cell Therapy at JoVE.com

Bu eser kısmen Ulusal Kalp, akciğer ve kan Enstitüsü hibe RO1-HL-99507, tarafından desteklenmiştir HL-114120, HL-131017, HL138023 ve UO1-HL-134764 (için J. Zhang) ve Amerikan Kalp Derneği bilimsel gelişme Grant 17SDG33670677 (için R. Kannappan) tarafından.

1. kuyruklu yıldız tahlil
<ol><li>
Reaktif hazırlık
	<ol>
<li>Düşük erime noktası özel için özel düşük erime 500 mg 100 mL DNA - yer / RNA ücretsiz su. Özel eriyene kadar fırın mikrodalga bir de şişe ısı. İhtiyaç kadar bir 37 ° C su banyosunda şişe yerleştirin. Not: Daha fazla okuma için Azqueta ve ark., özel toplama DNA gevşemek zaman ve birkaç Elektroforez faktörler23etkileri eğitimi görmek.</li>
		<li>SYBR yeşil DNA boya...

<ol>
	<li>Bolli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+stem+cells+in+patients+with+ischaemic+cardiomyopathy+(SCIPIO):+initial+results+of+a+randomised+phase+1+trial.">Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial.</a> The Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).</li><li>Makkar, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracoronary+cardiosphere-derived+cells+for+heart+regeneration+after+myocardial+infarction+(CADUCEUS):+a+prospective,+randomised+phase+1+trial.">Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial.</a> The Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).</li><li>Tomita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+neural+crest+cells+contribute+to+the+dormant+multipotent+stem+cell+in+the+mammalian+heart.">Cardiac neural crest cells contribute to the dormant multipotent stem cell in the mammalian heart.</a> Journal of Cell Biology. 170 (7), 1135-1146 (2005).</li><li>Oyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+side+population+cells+have+a+potential+to+migrate+and+differentiate+into+cardiomyocytes+in+vitro+and+in+vivo.">Cardiac side population cells have a potential to migrate and differentiate into cardiomyocytes in vitro and in vivo.</a> Journal of Cell Biology. 176 (3), 329-341 (2007).</li><li>Fischer, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+myocardial+regeneration+through+genetic+engineering+of+cardiac+progenitor+cells+expressing+Pim-1+kinase.">Enhancement of myocardial regeneration through genetic engineering of cardiac progenitor cells expressing Pim-1 kinase.</a> Circulation. 120 (21), 2077-2087 (2009).</li><li>Cottage, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+progenitor+cell+cycling+stimulated+by+pim-1+kinase.">Cardiac progenitor cell cycling stimulated by pim-1 kinase.</a> Circulation Research. 106 (5), 891-901 (2010).</li><li>Angert, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+the+injured+adult+heart+involves+new+myocytes+potentially+derived+from+resident+cardiac+stem+cells.">Repair of the injured adult heart involves new myocytes potentially derived from resident cardiac stem cells.</a> Circulation Research. 108 (10), 1226-1237 (2011).</li><li>Kannappan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+Modulates+the+Fate+of+Cardiac+Progenitor+Cells+Ex+vivo+and+in+the+Diabetic+Heart+In+vivo.">p53 Modulates the Fate of Cardiac Progenitor Cells Ex vivo and in the Diabetic Heart In vivo.</a> EBioMedicine. 16, 224-237 (2017).</li><li>Hatzistergos, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+stimulate+cardiac+stem+cell+proliferation+and+differentiation.">Bone marrow mesenchymal stem cells stimulate cardiac stem cell proliferation and differentiation.</a> Circulation Research. 107 (7), 913-922 (2010).</li><li>Okita, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells:+opportunities+and+challenges.">Induced pluripotent stem cells: opportunities and challenges.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1575), 2198-2207 (2011).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cardiomyocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+repair+in+a+porcine+model+of+acute+myocardial+infarction+with+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiovascular+cells.">Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells.</a> Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+high+engraftment+of+patient-specific+cardiomyocyte+sheet+using+induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+adult+cardiac+fibroblast.">Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast.</a> Circulation: Heart Failure. 8 (1), 156-166 (2015).</li><li>Hirakawa, K., Midorikawa, K., Oikawa, S., Kawanishi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carcinogenic+semicarbazide+induces+sequence-specific+DNA+damage+through+the+generation+of+reactive+oxygen+species+and+the+derived+organic+radicals.">Carcinogenic semicarbazide induces sequence-specific DNA damage through the generation of reactive oxygen species and the derived organic radicals.</a> Mutation Research. 536 (1-2), 91-101 (2003).</li><li>Martinez, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+and+alkylating+damage+in+DNA.">Oxidative and alkylating damage in DNA.</a> Mutation Research. 544 (2-3), 115-127 (2003).</li><li>Valko, M., Rhodes, C. J., Moncol, J., Izakovic, M., Mazur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+radicals,+metals+and+antioxidants+in+oxidative+stress-induced+cancer.">Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer.</a> Chemico-Biological Interactions. 160 (1), 1-40 (2006).</li><li>Wiseman, H., Halliwell, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Damage+to+DNA+by+reactive+oxygen+and+nitrogen+species:+role+in+inflammatory+disease+and+progression+to+cancer.">Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species: role in inflammatory disease and progression to cancer.</a> Biochemical Journal. 313 (Pt 1), 17-29 (1996).</li><li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelectrophoretic+study+of+radiation-induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells.">Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 123 (1), 291-298 (1984).</li><li>Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells.">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.</a> Experimental Cell Research. 175 (1), 184-191 (1988).</li><li>Goichberg, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-associated+defects+in+EphA2+signaling+impair+the+migration+of+human+cardiac+progenitor+cells.">Age-associated defects in EphA2 signaling impair the migration of human cardiac progenitor cells.</a> Circulation. 128 (20), 2211-2223 (2013).</li><li>Kannappan, R., Mattapally, S., Wagle, P. A., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivation+domain+of+p53+regulates+DNA+repair+and+integrity+in+human+iPS+cells.">Transactivation domain of p53 regulates DNA repair and integrity in human iPS cells.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. , (2018).</li><li>Al-Baker, E. A., Oshin, M., Hutchison, C. J., Kill, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+UV-induced+damage+and+repair+in+young+and+senescent+human+dermal+fibroblasts+using+the+comet+assay.">Analysis of UV-induced damage and repair in young and senescent human dermal fibroblasts using the comet assay.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 126 (6-7), 664-672 (2005).</li><li>Azqueta, A., Gutzkow, K. B., Brunborg, G., Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+more+reliable+comet+assay:+optimising+agarose+concentration,+unwinding+time+and+electrophoresis+conditions.">Towards a more reliable comet assay: optimising agarose concentration, unwinding time and electrophoresis conditions.</a> Mutation Research. 724 (1-2), 41-45 (2011).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7 (10), R100 (2006).</li><li>Paradis, A. N., Gay, M. S., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binucleation+of+cardiomyocytes:+the+transition+from+a+proliferative+to+a+terminally+differentiated+state.">Binucleation of cardiomyocytes: the transition from a proliferative to a terminally differentiated state.</a> Drug Discovery Today. 19 (5), 602-609 (2014).</li></ol>

DNA bütünlük hücre bütünlük canlandırıyor. Hücreler hasarlı DNA ile sık sık stres vardır ve sonunda kendi bütünlüğünü kaybetmek. Kök ve nakli amacıyla yayılır kök hücre kaynaklı hücreler hücreleri onların istenen işlevi gerçekleştirmek asıl dürüstlüktür. Hasarlı DNA içeren hücrelerin nakli bir zavallı engraftment hızı ve performansı cep8,20neden olacaktır. Bu nedenle, hücre transplantasyonu önce DNA bütünlük ince...

Deneysel ve klinik kanıt hücre transplantasyonu orta hearts1,2,3,4,5 başarısız sol ventrikül contractile performansı artırabilir gösterir ,6,7,8,9. Son gelişmeler daha da çekici kardiyovasküler rejenerasyon için fırsatlar açtı; Bunlar somatik hücre Nanog teşvik ve bu indüklenmiş pluripotent kök hücreler (IPSC) farklı kalp soy, önemlisi cardiomyocyte (CM)10, ayırt etmek için programlama faktörlerin zorla ifade dahil 11 , 12 , 13. DNA yapay olarak oluşturulan iPSCs ve IPSC kaynaklı CM (IPS-CM), dahil olmak üzere her hücredeki kalıtsal malzemedir. DNA içinde depolanan genetik yönergeleri belirler büyüme, gelişme ve işlevi hücreler, dokular, organlar ve organizmalar. DNA etkisiz değil; metabolitleri, reaktif oksijen, karbonil ve azot türleri, gibi hücre ve alkilleyici neden DNA tüp bebek ve içinde vivo14,15,16,17zarar verebilir. Önemlisi, DNA hasarı sezgisel olarak önemli bir frekans ile her hücre oluşur. Bu zararlar düzeltilmez ise, bu DNA mutasyon, hücresel yaşlanma, DNA ve hücre bütünlüğü ve muhtemelen, hastalıklar, yaşamı tehdit eden kanser de dahil olmak üzere kaybına yol açacaktır. Bu nedenle, DNA bütünlüğünü koruyarak herhangi bir hücreye, özellikle klinikte çok büyük potansiyele sahip iPSCs, esastır.
Miktar ve izole genomik DNA bütünlüğünü değerlendirmek için pahalı aletler piyasada mevcuttur. Ancak, hücreleri izole olmadan hücrelerdeki DNA bütünlüğünü değerlendirmek için hiçbir basit ve maliyet-etkin yöntem vardır. Ayrıca, Kullanıcı kaynaklı DNA yıkımı sırasında DNA izolasyon Bu yöntemler kullanarak büyük dezavantaj biridir. Tek hücreli jel elektroforez (kuyruklu yıldız tahlil olarak da bilinir)18,19 ve γH2A.X immunolabeling8 araştırma laboratuarları ve DNA hasarı değerlendirmek için temel yaklaşımlar tekniklerdir. Bu iki yöntem pahalı ekipman veya DNA bütünlük8,20,21analiz etmek izole genomik DNA gerektirmez. Beri bu teknikleri içeren bütün hücreleri gerçekleştirilmiş; Kullanıcı kaynaklı DNA/RNA/protein yıkımı numune hazırlama sırasında bu iletişim kuralları etkilemez. Burada, DNA hasarı ve DNA hasarı yanıt kök ve kök hücre kaynaklı hücreler olarak değerlendirmek için kuyruklu yıldız tahlil ve γH2A.X immunolabeling gerçekleştirmek için adım adım protokolleri sağlamak. Ayrıca, bu iki yaklaşım birleştirerek, biz nakli için hücrenin uygunluğu değerlendirmek için kullanılan bir saf değerlendirme öneriyorum.
Kuyruklu yıldız tahlil veya tek hücre Elektroforez jel, hücrelerdeki DNA sonları ölçer. Düşük erime özel katıştırılmış hücreleri supercoiled DNA içeren formu nucleoids lysed. Bozulmamış DNA, onların büyük boyutu ve onların konjugasyon matris protein nedeniyle kısıtlı bir geçiş olacak ise Elektroforez özel gözenekler parçalanmış DNA ve kırık DNA iplikçikleri küçük parçalar geçirin. Bir floresan mikroskop altında lekeli DNA modeli taklit eden bir kuyruklu yıldız. Kuyruklu yıldız baş bozulmamış DNA içerir ve kuyruk parçaları oluşur ve kırık DNA dizilerini. DNA hasarı kısmını hasarlı DNA (kuyruklu yıldız kuyruk) Floresan yoğunluğu tarafından bozulmamış DNA (kuyruklu yıldız başı) yoğunluk göreli olarak ölçülebilir. Parametre kuyruk an Şekil 1' de gösterildiği gibi hesaplanabilir.
DNA hasarı fosforilasyon histon H2A nın neden olmaktadır. X (γH2A.X) Ser139 ATM, ATR ve DNA-PK kinazlar tarafından. Fosforilasyon ve H2A alımı. DNA kırılmalara X DNA hasarı yanıt (DDR) denir ve DNA hasar sonra hızla olur. Bu işlem, denetim noktası-aracılı hücre döngüsü tutuklama ve DNA onarım işlemleri başlatılır. DNA onarım başarıyla tamamlayan γH2A.X dephosphorylated ve fosfatazlar tarafından inaktive olur. Uzun süreli ve DNA ' γH2A.X foci birikimi için birden fazla DNA kırılmalara yol. Bu hücrenin DNA hasarı ve DNA bütünlüğü kaybı onarmak yetersizlik gösterir. DNA'daki bu γH2A.X foci belirlenebilir ve DDR foci sayısı 2 bölümünde iletişim kuralını kullanarak sayılabilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slide</td>
			<td>Millicell</td>
			<td>PEZGS0816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td>Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure 
			Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson Immuno 
			Research Laboratories</td>
			<td>711-545-152 
			(RRID: AB_2313584)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson Immuno 
			Research Laboratories</td>
			<td>711-165-152 
			(RRID:AB_2307443)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco B-27 Supplement, Serum Free,</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel growth factor reduced</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhalloidinA488</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2577 (RRID: AB_2118010)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR&#160;Green I nucleic acid gel stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Low melting Point Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Antifade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing stem cell dna integrity for cardiac cell therapy

Kök ve kök hücre kaynaklı hücreler çeşitli dejeneratif hastalıklar için yenileyici bir terapi olarak büyük potansiyele sahip. DNA'sı, kök hücre de dahil olmak üzere tüm hücrelerdeki genetik veri depo ve bütünlüğünü rejeneratif kabiliyetini temelini oluşturur. Kök hücre nakli için gerekli numaraları elde laboratuvarlarında hızlı yayılma tabi. Hızlandırılmış hücre büyümesini reaktif oksijen, karbonil ve alkilleyici gibi birikmiş metabolitleri tarafından DNA bütünlük kaybına yol açar. Bu hücrelerin nakli zavallı engraftment ve rejenerasyon bozulan organ neden olur. Ayrıca, DNA zarar görmüş hücreleri yol açan mutasyonlar, DNA istikrarsızlık, hücresel yaşlanma dikim ve muhtemelen, hayatı tehdit edici hastalıkları kanser gibi. Bu nedenle, hücrenin uygunluğu nakli için değerlendirmek bir kalite kontrol yöntemi acilen ihtiyaç vardır. Burada, kök hücre hücre transplantasyonu önce DNA bütünlüğünü değerlendirilmesi için adım adım iletişim kuralları sağlar.

İnsan indüklenmiş pluripotent kök hücreler kültürlü ve DNA bütünlüğü bir ölçüsü olarak kullanılan, DNA hasarı ve kuyruk an, kuyruklu yıldız tahlil tarafından analiz edildi. IPS hücreleri düşük erime noktası özel içinde gömülü ve bir cam slayt üzerinde yerleştirilir. Hücreleri sonra supercoiled DNA elde etmek için alkali bir çözüm tarafından takip lizis arabellek ile tedavi edildi. Nucleoids electrophoresed ve kuyruklu yıldızlar DNA boya (<strong c...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Stem Cell DNA Integrity for Cardiac Cell Therapy at JoVE.com

Assessing Stem Cell DNA Integrity for Cardiac Cell Therapy

Kardiyak hücre tedavisi için kök hücre DNA bütünlük değerlendirilmesi

Burada, bir analiz DNA bütünlük içinde kök hücre hücre transplantasyonu önce değerlendirme için deneysel bir kurulumuna ilişkin ayrıntılı bir açıklama sağlamak.

Stem and stem-cell-derived cells have immense potential as a regenerative therapy for various degenerative diseases. DNA is the storehouse of genetic data ...

Kardiyomiyopati gibi yenidoğan hastalıklarında, indüklenen pluripotent kök hücre kaynaklı hücreler kullanılarak rejeneratif tedavi nin büyük bir potansiyeli vardır. Ancak, in vitro hızlandırılmış hücre büyümesi reaktif oksijen türleri gibi birikmiş metabolitleri tarafından DNA hasarına yol açar. Bu DNA hasarlı hücrelerin nakli organın kötü engraftment ve rejenerasyon neden olur.Transplantasyon dan önce hücrelerin kalitesi değerlendirilmelidir. Burada kök hücrelerdeki DNA hasarını değerlendirmek için adım adım iki protokol salıyoruz. Prosedürleri gösteren Jessica Miller, bir araştırmacı, Nikhil Mardhekar, bir araştırmacı ve Vasanthi Rajasekaran, bir laboratuvar teknisyeni olacaktır.Başlamak için, DNA-RNA serbest su 100 mililitre düşük eriyen agarose 500 miligram yerleştirin. Agarose eriyene kadar bir mikrodalga fırında şişe ısıtın. Daha sonra, şişeyi 37 derecelik bir su banyosuna, ihtiyacı olana kadar yerleştirin.Önceden kaplanmış kuyruklu yıldız slaytları hazırlamak için, cam bir slayt üzerine % 0.5 agarose birkaç damla yerleştirin. Hemen bir coverslip kullanarak agarose kaplama ince bir tabaka oluşturmak için agarose yayıldı. Ultraviyole ışık kaynaklı hücre hasarını önlemek için düşük ışık koşullarında çalışarak, 10 mikrolitre hücre süspansiyonu ve 90 mikrolitre agarose çözeltisini bir tüpte karıştırın.Agarose'un katılaşmasını önlemek için tüpü 37 derecelik bir su banyosuna yerleştirin. Önceden kaplanmış kuyruklu yıldız kaydırağına hava kabarcıkları ve nokta başına 70 mikrolitre pipet vermeden çözeltiyi karıştırın. Bir pipet ucu kullanarak, ince bir tabaka oluşturmak için hücre agarose karışımı yayıldı.15 dakika boyunca dört derece santigrat slayt yerleştirin. Bir kapta, tamamen soğuk lysis tampon slayt batırın. Bir saat için dört derece santigrat de karanlıkta konteyner yerleştirin.Lysis tamponu soğuk alkali çözeltisi ile değiştirin. Slaytların tamamen batırılmış olduğundan emin olun. Konteyneri karanlıkta dört derece daha 30 dakika daha bıraktıktan sonra, kaydırağı yatay bir elektroforez tankına yerleştirin.Kaydıralar tamamen batırılıncaya kadar tankı soğuk alkali elektroforez tamponuyla doldurun. Voltajı 15-30 dakika santimetre cinsinden uygulayın. Bir kapta, tamamen soğuk deiyonize su slayt batırın.İki dakika sonra, deiyonize su çıkarın ve taze deiyonize su ekleyin ve sonra ikinci kez bu adımı tekrarlayın. Daha sonra, soğuk% 70 etanol ile deiyonize su değiştirin. Beş dakika sonra, yavaşça yatırmadan slayt çıkarın ve kuru hava sağlar.Kuruduktan sonra, her noktaya seyreltilmiş DNA boyası 100 mikrolitre ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika bekleyin. Epifloresan mikroskobunda FITC filtresi kullanarak, numune başına toplam 50 ila 100 kuyruklu yıldızın görüntülerini alın. Kültür iPS kaynaklı kardiyomiyositler metin protokolünde açıklandığı gibi.Oda slaytlarında iPS kaynaklı kardiyomiyositleri görmek için, önce kültür ortamını kuyulardan atın ve hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. Kuyu başına 0.25% Trypsin bir mililitre ekleyin ve beş dakika boyunca 37 derece santigrat de kuluçka. Hücre kopması için mikroskop altında plakayı kontrol edin.Sonra Trypsin durdurmak için CMM bir mililitre ekleyin. Hücre süspansiyonuna 15 mililitrelik bir tüp ve santrifüjü dört santigrat derecede beş dakika ve 200 kez yerleştirin. Orta atın, CMM bir mililitre ekleyin ve hücreleri yeniden askıya.Hücreleri sayın ve cmm 1.6 mililitre iki milyon hücre elde etmek için hücre sayımları ayarlayın. Şimdi tohum sekiz kuyulu oda slayt kuyu başına hücre süspansiyon 200 mikrolitre. Hücreleri kuyunun etrafına yaymak için slayta hafifçe dokunun.Hücreleri 37 derecede kuluçkaya yatırın. iPS kaynaklı kardiyomiyosit doksorubisin tedavisi için, iPS kaynaklı kardiyomiyosit kuyularından kültür ortamını atın ve hücreleri PBS ile yıkayın. Hücreleri tek mikromolar doksorubisin ile 37 santigrat derecede dört saat tedavi edin.Ortamı aspire edin ve hücreleri PBS ile yıkayın. İmmünoetiketleme yapmak için hücreleri PBS ile üç kez yıkayın ve her kuyuya 200 mikrolitre taze hazırlanmış %4 paraformaldehit ekleyin. Oda sıcaklığında karanlıkta 20 dakika boyunca hücreleri düzeltin.PBS ile hücreleri yıkadıktan sonra, kuyu başına engelleme tampon 200 mikrolitre ekleyin ve oda sıcaklığında nemlendirilmiş bir odada 30 dakika boyunca blok. Engelleme tamponu çıkarın ve birincil antikor çözeltisi 200 mikrolitre ekleyin. Oda sıcaklığında koyu nemli bir odada 45 dakika kuluçkaya yattıktan sonra kuyuları PBS ile üç kez yıkayın.PBS çıkarın ve ikincil antikor karışımı 200 mikrolitre ekleyin. Oda sıcaklığında koyu nemli bir odada 45 dakika kuluçka. Daha sonra pbs ile kuyuları üç kez yıkayın.Antifade ile slaytlar montaj önce deiyonize su ile yıkayın. Bir kapak camı yerleştirin ve slaytları karanlıkta dört santigrat derecede saklayın. Konfokal mikroskop kullanarak, örnek başına rastgele alanların üç ila beş görüntüsünü alın ve görüntü analizine devam edin.DNA hasar yanıt foci saymak için, indirin ve CellProfiler yükleyin. Dosyayı seçin, içe aktarın, dosyadan ardışık kaynak aktarın ve puncti gamma-H2AX adlı ardışık işlem dosyasını seçin. Gama-H2AX foci'nin edinilmiş görüntülerini içeren klasörü, analiz için giriş modülleri görüntüler bölümündeki dosya listesi penceresine sürükleyin ve bırakın.Ardından metin protokolünde gösterildiği gibi yönergeleri izleyin. Görüntülerin parametrelerini ayarlamak için, analiz için istenen görüntüyü dosya listesine sürükleyin. Giriş modülleri altında görüntüleri seçin.Ayrıca giriş modüllerinde, meta verileri seçin ve ardından adları ve türleri seçin. Gruplar için hayır'ı seçin. Analiz modüllerinde çalışırken, griden griye rengi seçin.Ardından düzgün'ün, birincil nesneleri tanımlay'ı seçin ve yine düzgün'ün seçilmesini seçin. Sonraki özelliği geliştir veya bastır ve ardından birincil nesneleri tanımlay'ı seçin. Çözümleme modüllerinde çalışmaya devam ediyor, ilgili nesneleri seçin, ardından nesneleri sınıflandırın ve son olarak elektronik tabloya dışa aktarmayı seçin.Görüntü analizi gerçekleştirmek için sol alt paneldeki görüntüleri analiz et'i tıklatın. Analizin başarıyla tamamlanmasıyla, çeşitli görüntüler oluşturulur. Bilgisayarda oluşturulan ve kaydedilmiş CSV dosyasına dikkat edin.Bu dosya daha fazla analiz için nicel verileri içerir. Deneme resmim olarak adlandırılan elektronik tabloda, B sütununda beş puncti'ye kadar olan çekirdek sayısı, D sütunu ise beşten fazla puncti olan çekirdek sayısına sahip olacaktır. Toplam çekirdek sayısını elde etmek için B ve D sütunlarını ekleyin.Tüm görüntüler için bu adımları yineleyin, her analizden önce deneme dosya adımı değiştirin. Burada dokso ile tedavi edilen ve tedavi edilmeyen iPS hücrelerinden kuyruklu yıldızların temsili mikrografları gösterilmiştir. DNA hasarı ve kuyruk momentinin bir kısmı olarak ifade edilen iPS hücrelerinde bazal miktarda DNA hasarı bulundu.Ancak, dokso tedavisi beklendiği gibi iPS hücrelerinde DNA hasarı arttı, kuyruklu yıldız testi pluripotent kök hücrelerde DNA bütünlüğünü değerlendirmek için kullanılabilir gösteren. Gamma-H2AX immünetiketlemenin temsili mikrografları burada, daha düşük büyütmede ve daha yüksek büyütmede gösterilmiştir. Kontrol iPS kaynaklı kardiyomiyositlerde, hücrelerin %90'ından fazlasının çekirdekbaşına beş DDR foci'den daha az olduğu görülür.Ve hücrelerin %10'undan azında çekirdek başına altıdan fazla DDR foci vardı. Altı ay boyunca kültüre sahip iPS kaynaklı kardiyomiyositler için, hücrelerin %90'ından azında çekirdek başına beş DDR foci ve toplam da %13'ten fazla çekirdek başına altı DDR foci vardı. Dokso-tedavi edilen iPS kaynaklı kardiyomiyositlerde ise, hücrelerin %80'inden azında çekirdek başına beş DDR foci vardı.Ve hücrelerin yaklaşık %24'ünde çekirdek başına altıdan fazla DDR foci vardı. Bu veriler, uzun süreli iPS kaynaklı kardiyomiyosit hücre kültürü ve dokso tedavisinin önemli DNA hasarına yol açarak hücre nakli için uygun olmadığını göstermektedir. Bu elektroforez etkileyebilir gibi hücre süspansiyon karıştırırken değişkenleri önlemek için çok önemlidir.Bu prosedürü takiben, kuyruklu yıldız tahlilleri ve çeşitli hücreler ile immünetiketleme prosedürleri gerçekleştirebilirsiniz. Bu teknikler, hücre nakli çalışmalarında kullanılmadan önce çeşitli türdeki hücrelerin DNA hasarı açısından değerlendirilmesine olanak sağlayacaktır.

Research

JoVE Journal

Genetics

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

Yapay Faktörler Mühendislik Özellikle İnsan Hücreleri alternatif bağlantı işleyin için

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

RNA-RNA Etkileşmelerini Biyotinlenmiş Psooren Kullanarak Küresel Olarak Haritalama

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

CRISPR genotipine bir Floresan PCR kılcal jel elektroforezi Tekniği / yüksek verimli bir Format Nakavt Mutants Cas9 aracılı

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

Büyük ölçekli gRNA Kütüphane üretim herhangi bir DNA kaynaktan için evrensel bir iletişim kuralı

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

İnsan revers transkriptaz protein RNA'ya bağımlı RNA polimeraz aktivitesinin yarı kantitatif algılama

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Zebra balığı bir Vivo içinde Model sistemi olarak kullanarak DNA çoğaltma zamanlaması profil oluşturma

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Fare ve insan hematopoetik progenitör hücre tarafından CRISPR/Cas9 yüksek verimli Gene bozulma

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

Bir moleküler karakterize etmek için Kombinatorik tek hücreli yaklaşım ve insan kök ve yaratıcı nüfus Immunophenotypic heterojen

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Yalıtım, karakterizasyonu ve insan diş kökü kök hücrelerin genetik değişiklik mikroRNA tabanlı

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...