Name: raising the mexican tetra astyanax mexicanus for analysis of post-larval phenotypes and whole-mount immunohistochemistry
Uploaded: 2018-12-28T13:00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry at JoVE.com

وأيد هذا العمل منح من "معاهد الصحة الوطنية" [HD089934, DK108495].

عليها الإجراءات الوارد ذكرها في هذا البروتوكول "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) في مدرسة هارفارد الطبية.
1-تربية
ملاحظة: هناك العديد من الطرق المنشورة لتربية15،16،،من1720 التي يمكن أن تستخدم أيضا في هذه الخطوة. قبل تربية، تتم المحافظة على الأسماك الكبار في 10:14 دورة في 23 درجة مئوية وتغذت بيليه الضوء: الظلام (انظر الجدول للمواد) مرة واحدة يوميا. يمكن إكثار الأسماك في نظام مغلق مع الترشيح الميكانيكية وتعقيم الأشعة فوق البنفسجية. يمكن أيضا تحقيق تربية في خزانات ثابتة (غير تعميم)، ولكن الأسماك لا ينبغي أن يترك في خزان ثابت لأكثر من 3 أيام، كما أن نوعية المياه ويتحلل بسرعة.
<ol><li>ملء خزان غال 5 مع المياه جاهزة للأسماك (الكلور المياه تعديلها إلى: درجة الحموضة = 7.1 +/-2، الموصلية = 900 +/--150 المايكروثانيه، درجة الحرارة = 23 درجة مئوية).</li>
	<li>ضع البلاستيك مش (انظر المواد) في الجزء السفلي من الخزان. إذا كانت تربية في خزانات ثابتة، إلصاق سخان مياه إلى جانب الدبابة. إذا تربية في نظام مغلق، وضع سخان مياه في مستنقع النظام. ملاحظة: يمنع مش البلاستيك البالغين من استهلاك البيض.</li>
	<li>مكان واحد الإناث والذكور اثنين ألف مكسيكي الأسماك أكبر من 1 سنة إلى الخزان. السماح للأسماك إلى تأقلم مدة 30 دقيقة.</li>
	<li>تعيين درجة حرارة السخان إلى 24 درجة مئوية (أو 1 درجة مئوية أكثر دفئا من درجة حرارة البدء).</li>
	<li>بعد 24 ساعة، زيادة درجة الحرارة 1 درجة مئوية.</li>
	<li>بعد 24 ساعة، زيادة درجة الحرارة 1 درجة مئوية. التحقق من أن الدبابات يوميا للبيض بالساطع مضيا في الجزء السفلي من الخزان. حجب الأسماك من الأغذية خلال هذه الفترة 3 أيام.</li>
	<li>إذا لم تم فعل التفريخ بعد 3 أيام، إيقاف تشغيل السخان والسماح للمياه للعودة إلى درجة حرارة الغرفة (RT) قبل نقل الأسماك إلى دبابتهم الأصلي.</li>
</ol>2-تفقيس بيض المخصب
<ol><li>حالما يتم تحديد البيض في خزان لتربية، إزالة الكبار ومش البلاستيك، وتقليل الماء على عمق 10 سم باستخدام كوب أو كأس. ملاحظة: لتقدير الوقت للتفريخ، استخدام ماصة نقل لوضع البيض عدة في طبق بتري وعرضها مع ستيريوميكروسكوبي تحديد المرحلة14 وتقدير وقت الإخصاب.</li>
	<li>نقل الدبابات إلى سطح عمل مريحة وإزالة أي البيض مبهمة أو البراز، تاركاً فقط البيض الشفاف والخصبة في الخزان. ملاحظة: يمكن تسجيل عدد البيض الخصبة في هذا الوقت.</li>
	<li>ملء الخزان مع جاهزة للأسماك المياه (راجع الخطوة 1، 1) وإضافة 6-7 قطرات من الميثيلين الأزرق إلى الخزان المياه تملأ. ملاحظة: يكون التركيز النهائي من الميثيلين الأزرق حوالي 1.5 جزء في المليون.</li>
	<li>إضافة سخان وحوض السمك ببلير (متصلة مضخة الهواء، مع منظم) إلى الخزان.</li>
	<li>تعيين السخان إلى 24 درجة مئوية، وضبط منظم نبراس لإنتاج تيار لطيف من الفقاعات.</li>
	<li>ضع غطاء على خزان للمساعدة في الحفاظ على درجة حرارة الماء. ملاحظة: ينبغي أن يبدأ البيض الفقس خلال 24 ساعة وقت التفريخ.</li>
</ol>3. نقل اليرقات مظلل إلى حاويات الحضانة
<ol><li>أضف 20 غ من الملح (انظر المواد) 8 لتر من الأسماك جاهزة للمياه (راجع الخطوة 1، 1) ويحرك حتى يذوب. ملء كل حاوية الحضانة 1.5 لتر (انظر المواد) مع 1 لتر الماء المعدة.</li>
	<li>استخدام ماصة نقل لنقل اليرقات فقست داخل الحاويات المعدة الحضانة في كثافة الأسماك 20 للحاوية الواحدة. ملاحظة: كشافات يمكن أن تكون مفيدة لتحديد موقع ونقل اليرقات مظلل.</li>
	<li>بعد أن أزيلت جميع اليرقات مظلل مرئية، تحرض المياه في الخزان بالتحريك، و/أو تهب الماء المتدفق إلى حواف وزوايا الخزان مع الماصة. ملاحظة: هذا سوف يساعد الكشف عن اليرقات التي ضاعت على التمرير أولاً.</li>
	<li>التخلص من اليرقات غير المستخدمة في هذه المرحلة باستخدام المبادئ التوجيهية لمكتب رعاية مختبر (أولاو). إضافة هيبوكلوريت الصوديوم إلى خزان لتحقيق تركيز نهائي 6.15%. انتظر على الأقل 5 دقائق قبل يصب أسفل الحوض.</li>
	<li>قم بتسمية كل حاوية الحضانة مع تاريخ ووقت الإخصاب. عرض الحاويات الحضانة اليومية والاستمرار في إزالة أي يرقات ميتة.</li>
</ol>4-إعداد الطعام الأسماك المستندة إلى دولابية
<ol><li>انظر الجدول للمواد للحصول على معلومات حول كيفية الحصول على الروتيفر. يتبع البروتوكول المشار إليه إعداد وصيانة، وحصاد الروتيفر22.</li>
	<li>إعداد الأسماك الغذاء بإضافة 3 مل مزيج الطحالب (انظر الجدول للمواد) إلى 1 لتر الروتيفر المقطوع. هذا الخليط سوف تضاف مباشرة إلى حاويات الحضانة إمدادات غذاء.</li>
</ol>5-تغذية الأسماك اليرقات بعد
<ol><li>عند الأسماك 5 أيام بعد الإخصاب (إدارة الشرطة الاتحادية)، إضافة 3 مل من الأسماك الغذاء (أعد في الخطوة 4، 2) لكل حاوية الحضانة. في الكثافة المثلى، ينبغي أن يكون الروتيفر مرئية في مجموعات كثيفة في الزوايا الحاويات الحضانة، وأقل وضوحاً في وسط الحاوية. إضافة خليط دولابية إضافية حتى تم التوصل إلى كثافة مناسبة.</li>
	<li>فحص الحاويات يوميا لوجود الروتيفر وإضافة المزيد إذا كان التركيز يحصل على النضوب. الاستمرار في إزالة أي يرقات ميتة.</li>
	<li>عندما تصل الأسماك إلى 14 إدارة الشرطة الاتحادية، نقلها إلى خزان لتتناسب مع نظام مغلق في كثافة الأسماك 5/لتر من المياه. ملاحظة: يمكن تسجيل العدد من الباقين على قيد الحياة بعد اليرقات السمكية في هذا الوقت.</li>
</ol>6-كل-جبل Immunohistochemistry الأسماك اليرقات بعد
<ol><li>إزالة الأسماك اليرقات بعد انتهاء المرحلة المطلوبة من الغذاء مقابل 24 ساعة بصب الحضانة الحاوية التي تحتوي على الأسماك من خلال نايلون مش مصفاة ووضع في المصفاة في وعاء مع مياه نظيفة جاهزة للأسماك (راجع الخطوة 1، 1). ملاحظة: من الضروري إزالة جميع المواد الغذائية. حتى كميات صغيرة من المواد الغذائية في القناة الهضمية السيارات-الفلورسنت وستؤثر على التصوير.</li>
	<li>جمع و euthanize الأسماك. ملاحظة: ينبغي أن يتبع المبادئ التوجيهية أولو البروتوكول القتل الرحيم والموافقة برعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة. وقد لاحظنا أن تريكيني وحدها لا euthanize ما بعد اليرقات السمكية والأسماك تبدأ في التحرك عند نقلها من تريكيني إلى مثبت إذا كانت الأسماك لا تبقى أيضا على الجليد.<ol>
<li>إعداد حل تريكيني في كوب بإضافة ز 0.4 من تريكيني-S و g 0.8 من بيكربونات الصوديوم إلى 1 لتر مياه، ووضعه على الجليد.</li>
		<li>صب الماء التي تحتوي على الأسماك من خلال مصفاة مش نايلون لجمع الأسماك. بلطف تغرق في المصفاة في المثلج تريكيني الحل وترك الأمر على الجليد لمدة 10 دقائق.</li>
	</ol>
</li>
	<li>إصلاح الأسماك euthanized.<ol>
<li>استخدام ماصة نقل مع تلميح قص لنقل الأسماك إلى أنبوب مخروطي.</li>
		<li>إزالة الحل تريكيني مع ماصة نقل واستبدال مع مثبت. احتضان مع هزاز. ملاحظة: يجب تحديد الوقت مثبت والتثبيت استناداً إلى جسم المستخدم. 10% محلول الفورمالين (4% فورمالدهايد، انظر مواد) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية كافية للأجسام المضادة المدرجة في الجدول للمواد. تنبيه: الفورمالين السامة والقابلة للاشتعال. ارتداء معدات الوقاية الشخصية (قفازات ومعطف مختبر، ونظارات دفقة) والتعامل معها في غطاء كيميائية. وينبغي التخلص منها المحاليل المحتوية على الفورمالين كنفايات خطرة.</li>
		<li>استخدام ماصة نقل بعناية إزالة مثبت دون إزعاج الأسماك. أضف 3 مل فوسفات مخزنة المالحة-تريتون الحل [برنامج تلفزيوني مع 0.1% تريتون (ببست)، انظر المواد] واحتضان لمدة 15 دقيقة في الرايت مع هزاز.</li>
		<li>إزالة ببست واستبدال مع ببست الطازجة واحتضانها لتكرار 15 دقيقة هذا "غسل" مرة أخرى. ملاحظة: يمكن تخزين الأسماك في برنامج تلفزيوني يتضمن أزيد الصوديوم 0.02 في المائة عند 4 درجة مئوية لعدة أسابيع.</li>
	</ol>
</li>
	<li>أداء الجامعة-جبل إيمونوستينينج.<ol>
<li>إعداد 50 مل من عرقلة الحل [تريتون PB-0.5% X، 0.2% ألبومين المصل البقري (BSA)، أزيد الصوديوم 0.02% مصل حمار 5%، 1% ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس])]. تنبيه: وأزيد الصوديوم و [دمس] مواد سامة. وينبغي استخدام معدات الوقاية الشخصية (قفازات ومعطف مختبر، ونظارات البداية) عند التعامل. أي حلول ينبغي التخلص منها كنفايات خطرة.</li>
		<li>استخدام ماصة نقل لنقل الأسماك إلى قنينة زجاجية 4 مل مع غطاء رأس المسمار. استخدام ماصة نقل إلى إزالة ببست وإضافة 3 مل عرقلة الحل. احتضانها ح 1 في الرايت مع هزاز.</li>
		<li>استخدام ماصة نقل الحل حظر واضافه جسم الابتدائي المخفف في عرقلة الحل. تبني بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة مع الانفعالات. ملاحظة: على سبيل المثال، إضافة 1: 250 إضعاف مكافحة--هوك/هود الماوس بروتين الخلايا العصبية [مونوكلونل] جسم (انظر الجدول للمواد للحصول على قائمة من الأجسام المضادة التي استخدمت بنجاح في مكسيكي (أ)). مجموعة من الأسماك مع لا جسم الأولية وأضاف ينبغي أن تدرج في هذه الخطوة. يجب أن يكون حجم لجسم ما يكفي لتغطية السمك والسماح للتحريض.</li>
		<li>أغسل السمك 3 مرات مع ببست كما هو موضح في الخطوة 6.3.4. استبدال ببست بجسم الثانوي المخفف في عرقلة الحل واحتضان بين عشية وضحاها في الرايت مع الانفعالات. ملاحظة: أن التركيزات المثلى جسم الابتدائي والثانوي ووقت الحضانة ودرجة حرارة الحضانة ينبغي أن تحدد لكل جسم. وكان بين عشية وضحاها في الرايت فعالة بالنسبة للأجسام المضادة المدرجة في الجدول للمواد.</li>
		<li>أغسل السمك 3 مرات مع ببست، مع كل غسل تدوم 15 دقيقة كما هو موضح في الخطوة 6.3.4.</li>
		<li>نقل الأسماك إلى برنامج تلفزيوني للتخزين القصير الأجل قبل الشروع في تشريح، تركيب، أو تقطيع الأسماك.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Carlson, B. M., Klingler, I. B., Meyer, B. J., Gross, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+reveals+candidate+genes+for+activity+QTL+in+the+blind+Mexican+tetra,+Astyanax+mexicanus.">Genetic analysis reveals candidate genes for activity QTL in the blind Mexican tetra, Astyanax mexicanus.</a> PeerJ. 6, e5189 (2018).</li><li>Chin, J. S. R., Gassant, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergence+on+reduced+stress+behavior+in+the+Mexican+blind+cavefish.">Convergence on reduced stress behavior in the Mexican blind cavefish.</a> Developmental Biology. 441 (2), 319-327 (2018).</li><li>Lloyd, E., Olive, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+shift+towards+lateral+line+dependent+prey+capture+behavior+in+the+blind+Mexican+cavefish.">Evolutionary shift towards lateral line dependent prey capture behavior in the blind Mexican cavefish.</a> Developmental Biology. 441 (2), 328-337 (2018).</li><li>Tabin, J. A., Aspiras, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+preference+of+cave+and+surface+populations+of+Astyanax+mexicanus.">Temperature preference of cave and surface populations of Astyanax mexicanus.</a> Developmental Biology. 441 (2), 338-344 (2018).</li><li>Xiong, S., Krishnan, J., Peu&#223;, R., Rohner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+adipogenesis+contributes+to+excess+fat+accumulation+in+cave+populations+of+Astyanax+mexicanus.">Early adipogenesis contributes to excess fat accumulation in cave populations of Astyanax mexicanus.</a> Developmental Biology. 441 (2), 297-304 (2018).</li><li>Riddle, M. R., Aspiras, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+in+cavefish+as+an+adaptation+to+a+nutrient-limited+environment.">Insulin resistance in cavefish as an adaptation to a nutrient-limited environment.</a> Nature. 555 (7698), 647-651 (2018).</li><li>Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eyeless+Mexican+cavefish+save+energy+by+eliminating+the+circadian+rhythm+in+metabolism.">Eyeless Mexican cavefish save energy by eliminating the circadian rhythm in metabolism.</a> PloS One. 9 (9), e107877 (2014).</li><li>Aspiras, A. C., Rohner, N., Martineau, B., Borowsky, R. L., Tabin, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanocortin+4+receptor+mutations+contribute+to+the+adaptation+of+cavefish+to+nutrient-poor+conditions.">Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (31), 9668-9673 (2015).</li><li>Tang, J. L. Y., Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+origin+of+heart+size+and+shape+differences+in+Astyanax+mexicanus+populations.">The developmental origin of heart size and shape differences in Astyanax mexicanus populations.</a> Developmental Biology. 441 (2), 272-284 (2018).</li><li>Riddle, M. R., Boesmans, W., Caballero, O., Kazwiny, Y., Tabin, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+motility+of+the+Astyanax+mexicanus+gastrointestinal+tract.">Morphogenesis and motility of the Astyanax mexicanus gastrointestinal tract.</a> Developmental Biology. 441 (2), 285-296 (2018).</li><li>Gore, A. V., Tomins, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+epigenetic+mechanism+for+cavefish+eye+degeneration.">An epigenetic mechanism for cavefish eye degeneration.</a> Nature Ecology &amp; Evolution. 2 (7), 1155-1160 (2018).</li><li>McGaugh, S. E., Gross, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cavefish+genome+reveals+candidate+genes+for+eye+loss.">The cavefish genome reveals candidate genes for eye loss.</a> Nature Communications. 5, (2014).</li><li>Gross, J. B., Furterer, A., Carlson, B. M., Stahl, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Integrated+Transcriptome-Wide+Analysis+of+Cave+and+Surface+Dwelling+Astyanax+mexicanus.">An Integrated Transcriptome-Wide Analysis of Cave and Surface Dwelling Astyanax mexicanus.</a> PLoS One. 8 (2), e55659 (2013).</li><li>Hinaux, H., Pottin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Developmental+Staging+Table+for+Astyanax+mexicanus+Surface+Fish+and+Pach&#243;n+Cavefish.">A Developmental Staging Table for Astyanax mexicanus Surface Fish and Pach&#243;n Cavefish.</a> Zebrafish. 8 (4), 155-165 (2011).</li><li>Borowsky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breeding+Astyanax+mexicanus+through+natural+spawning.">Breeding Astyanax mexicanus through natural spawning.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 3 (11), (2008).</li><li>Borowsky, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handling+Astyanax+mexicanus+Eggs+and+Fry.">Handling Astyanax mexicanus Eggs and Fry.</a> CSH Protocols. , (2008).</li><li>Stahl, B. A., Gross, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+Transcriptomic+Analysis+of+Development+in+Two+Astyanax+Cavefish+Populations.">A Comparative Transcriptomic Analysis of Development in Two Astyanax Cavefish Populations.</a> Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular and Developmental Evolution. 328 (6), 515-532 (2017).</li><li>Elipot, Y., Legendre, L., P&#232;re, S., Sohm, F., R&#233;taux, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astyanax+Transgenesis+and+Husbandry.">Astyanax Transgenesis and Husbandry.</a> How Cavefish Enters the Laboratory. Zebrafish. 11 (4), 291-299 (2014).</li><li>Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+using+TALENs+in+blind+Mexican+Cavefish,+Astyanax+mexicanus.">Genome editing using TALENs in blind Mexican Cavefish, Astyanax mexicanus.</a> PloS One. 10 (3), e0119370 (2015).</li><li>. Current methods in Astyanax mexicanus research Available from: <a target="_blank" href="https://www.jove.com/methods-collections/16/current-methods-inastyanax-mexicanusresearch">https://www.jove.com/methods-collections/16/current-methods-inastyanax-mexicanusresearch</a> (2018)</li><li>Heanue, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Zebrafish+ret+Heterozygous+Model+of+Hirschsprung+Disease+Identifies+a+Functional+Role+for+mapk10+as+a+Modifier+of+Enteric+Nervous+System+Phenotype+Severity.">A Novel Zebrafish ret Heterozygous Model of Hirschsprung Disease Identifies a Functional Role for mapk10 as a Modifier of Enteric Nervous System Phenotype Severity.</a> PLoS Genetics. 12 (11), (2016).</li><li>Riddle, M. R., Baxter, B. K., Avery, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identification+of+microorganisms+associated+with+the+brine+shrimp+Artemia+franciscana.">Molecular identification of microorganisms associated with the brine shrimp Artemia franciscana.</a> Aquatic Biosystems. 9 (1), (2013).</li><li>Tsang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breeding+Zebrafish:+A+Review+of+Different+Methods+and+a+Discussion+on+Standardization.">Breeding Zebrafish: A Review of Different Methods and a Discussion on Standardization.</a> Zebrafish. 14 (6), 561-573 (2017).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

مقارنة نشاط الجينات بين المياه السطحية وكهف مكسيكي (أ) يتطلب البارامترات البيئية التي تسيطر عليها بعناية، والأساليب التي يمكن أن يتم نسخ عبر المختبرات. لدينا بروتوكول لرفع مكسيكي (أ) يوفر المحتوى التغذوي متسقة خلال التنمية ما بعد اليرقات. وعقب هذا نظام التغذية، يمكن مقارنة وظيفة الجينات ثقة بين السكان استخدام بروتوكول immunohistochemistry قوية نقدم. هنا نناقش أهمية هذا الأسلوب، فضلا عن القيود والتطبيقات المستقبلية.
لتحقيق نمو الكثافة المطابقة، وجدنا أن الأسماك اليرقات بعد يمكن أن ترفع دون تعميم الماء لمدة أسبوعين في الحاويات 1.5 لتر على اتباع نظام غذائي والروتيفرا. يمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول لجمع الأسماك في نظام مغلق؛ ومع ذلك، يجب إضافة الروتيفر يوميا للتعويض عن تلك التي فقدت من خلال التدفق دبابة. فقست حديثا الارتيميا النوبليوس تستخدم عادة كمصدر لغذاء في تربية الأحياء المائية، ولكن وجدنا أن استخدام الروتيفر له مزايا كبيرة، بما في ذلك: تخفيض الأسعار وتحسين الأمن البيولوجي والتغذية تتفق وأفضل نوعية المياه (انظر أدناه).
أولاً، تكلفة أسبوعية في المواد الاستهلاكية 4 دولار الروتيفر، مقابل 14 دولاراً الارتيميا. فيما يتعلق بالسلامة البيولوجية، يتم رفع الروتيفر في المختبر تحت ظروف خاضعة للرقابة، بينما يتم جمع الارتيميا من البرية وتخضع للتغيير الطبيعي في العوامل الجرثومية أو الممرض محتويات23. بالإضافة إلى ذلك، يتم تكوين المغذيات الارتيميا النوبليوس مصممة بيئياً وغير متناسقة لذلك. النوبليوس تزدهر في مخازن الطاقة الخاصة بهم بعد الفقس؛ أنها تفقد بسرعة القيمة الغذائية وتطور ينبغي أن يتغذى على النحو الأمثل للأسماك ضمن عدة ساعات. تبدأ الارتيميا التغذية في البيت 12 بعد الفقس، ويمثل المرة الأولى التي يمكن أن يكون إثراء الناحية التغذوية؛ ومع ذلك، في هذه المرحلة فقد أصبحت كبيرة جداً بالنسبة 5 إدارة الشرطة الاتحادية الأسماك تستهلك. وبالمقارنة، والروتيفرا باستمرار تتغذى على الطحالب البحرية أدى إلى ارتفاع محتوى المغذيات بغض النظر عن عندما يتم حصادها والروتيفرا. الروتيفر أصغر بكثير من أرتمييا النوبليوس (160 مقابل 400 ميكرون)، يجعلها أسهل للأسماك التقاط وابتلاع. الأسماك السطحية ما بعد اليرقات و cavefish تستهلك الروتيفر في كميات مماثلة مما يوحي بأي فرق في تفضيل أو القدرة على التقاط الروتيفر10.
وأخيراً، تبدأ الارتيميا النوبليوس الموت عدة ساعات بعد أن أدخلت في المياه العذبة. وسوف تسوس النوبليوس المأكولة، يتناقص بسرعة نوعية المياه إذا لم تتم إزالتها يدوياً. إزالة الميت الارتيميا مضيعة للوقت وخطيرة بالنسبة للأسماك بعد اليرقات التي ليست أكبر بكثير من الارتيميا وقد تكون الصدفة إزالتها أو أصيب بجروح. الروتيفر يمكن العيش إلى أجل غير مسمى في حاويات الحضانة، وتوفير الغذاء للأسماك في جميع الأوقات دون التأثير إلى حد كبير على نوعية المياه.
وفي حين استخدام الروتيفر كمصدر لغذاء فوائد جمة، للحفاظ على الطحالب دولابية الأسهم، يجب إضافة إلى نظام الثقافة يوميا. وهذا يمكن أن يتحقق مع علبة تغذية تلقائية بأن يوزع الطحالب السائلة في وعاء الثقافة دولابية (انظر الجدول للمواد). الروتيفر ويجب أيضا أن تحصد من هذا التشكيل كل 24-48 ساعة للحفاظ على صحة الثقافة. قد تفضل الباحثين أن تربية الأسماك إلا نادراً جداً (مرة واحدة في سنة، على سبيل المثال)، وهي لا تهتم بإجراء مقارنات بين السكان في مراحل ما بعد اليرقات الارتيميا كمصدر لغذاء، إذ يمكن أن تكون دبرت الأجنة انسيستيد في أي وقت.
نحن نوصي بتعقب عدد اليرقات مظلل والباقين على قيد الحياة لرصد نجاح التفقيس والنمو. إذا كانت معظم الأجنة أو اليرقات يموت، قد يكون سبب التلوث البكتيرية أو الفطرية. من المستحسن لرصد نوعية المياه من المياه جاهزة للأسماك وتعقيم المعدات أي مع الإيثانول 70%. يمكن إعادة استخدام الحاويات الحضانة بعد تنظيفها وتعقيمها. للتقليل من خطر الإصابة بالمرض، كما أنها حاسمة لإزالة السمك الميت أي من حاويات الحضانة وعدم إضافة الروتيفر قبل 5 إدارة الشرطة الاتحادية، عندما تبدأ الأسماك لتناول الطعام.
ألف-مكسيكي ناضجة جنسياً في سنة واحدة تقريبا. هذا هو حد لتوليد المعدلة وراثيا مكسيكي (أ) مقارنة مع دانيو rerio (الزرد) التي تستطيع أن تولد في الأسابيع 10-1224. إيمونوهيستوتشيميستري (المدينة) أسلوب بديل للتحقيق في التعبير الجيني والتعريب البروتين. يمكن تكييفها في كل خطوة والمستخدمة للكشف عن المستضدات في أي أنسجة لمصلحة البروتوكول هو موضح هنا. من المهم أن نلاحظ، مع ذلك، أن بعض الأنسجة قد يكون أكثر صعوبة لتصور في الأسماك السطحية بسبب التصبغ (حاجز غير موجود في كافيفيش أونبيجمينتيد)، التي قد تؤثر على تفسير الدراسات المقارنة. ولمعالجة هذه المشكلة المحتملة، يمكن المبيضة الصباغ الأسماك السطحية بعد التثبيت باستخدام بيروكسيد الهيدروجين 3%.
المدينة يتطلب التثبيت الناجح الأنسجة، ومنع، واختراق الأجسام المضادة. طرق لكل تختلف باختلاف الأنسجة والبروتين من الفائدة. يجب أن نحافظ على الوقت مثبت والتثبيت العمارة خلية مع الحفاظ على حانمه مستضد. لهذا البروتوكول، استخدم مثبت كروسلينكينج (بارافورمالدهيد)، وحذف مثبت يشوه (مثل الميثانول أو الأسيتون). ووجدنا أن الحضانة في الأسيتون تضاءل إشارة الأجسام المضادة لعلامات العصبية والبنكرياس. خطوة حظر أمر ضروري لمنع الأجسام المضادة من الملزمة للبروتينات غير المستهدفة في الأنسجة. هذا الأسلوب يستخدم مزيجاً من المصل العادي (5 في المائة) وجيش صرب البوسنة (0.2 ٪) في عرقلة الحل. عرقلة الحل يحتوي على الأجسام المضادة، والبروتينات التي تربط مواقع رد الفعل على البروتينات في الأنسجة، تناقص غير محددة ملزمة للأجسام المضادة الأولية والثانوية.
لتحقيق اختراق الأجسام المضادة، ويجب أن تكون بيرميبيليزيد الأنسجة. وهذا يمكن أن يتحقق مع المنظفات أو المذيبات يشوه ولكن يجب أن يكون الأمثل للحفاظ على حانمه مستضد. لدينا بروتوكول يستخدم مزيجاً من تريتون وثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]). تريتون و [دمس] مدرجة خلال الخطوات الحضانة تسد وجسم في تركيزات 0.5% و 1%، على التوالي. باستخدام هذا التركيز، لاحظنا تلطيخ في المخ والبنكرياس، والأمعاء، والعضلات، مما يوحي بأنه من المحتمل فعالة للاختراق من جميع الأنسجة. حجم الأسماك قد تؤثر أيضا على الاختراق. لم يتم اختباره هذا البروتوكول على الأسماك التي يزيد عمرها على 14 يوما (حوالي 7 مم في الطول). لاستكشاف تلوين, من المستحسن تغيير الخطوات اختراق التثبيت، ومنع، والأجسام المضادة. من المهم أيضا لدراسة حفظ التسلسل إيمونوجين مع البروتين مكسيكي (أ) أهمية استخدام الجينوم المتاحة25.
ألف مكسيكي هو نموذج ممتاز للتحقيق في تطور بالمقارنة مع السكان من نفس الأنواع التي نشأت في بيئات مختلفة إلى حد كبير يمكن أن تكون مباشرة في المختبر. بروتوكولات تربية قياسية، على حد سواء داخل وفيما بين المختبرات، ضرورية لفهم الاختلافات البيولوجية بين الأسماك السطحية وكافيفيش. وتنص المادة لدينا أسلوب لدراسة النشاط الجيني في ما بعد اليرقات الأسماك المعرضة لمعلمات النمو المطرد والتنمية.

تترا المكسيكية، أستياناكس مكسيكي، هو نوع واحد من الأسماك موجود كالسكان تعيش في نهر (الأسماك السطحية) وعدد من السكان تعيش في كهف (cavefish) المسمى للكهوف التي تسكنها (أي تنجا، مولينو، Pachón). تستخدم عددا متزايداً من الباحثين مكسيكي (أ) التحقيق في الأسس الوراثية والتنمية السلوكية1،2،،من34، الأيضية5،6 ،،من78، وتطور مورفولوجية9،،من1011. الموارد المتاحة لإجراء دراسات مكسيكي (أ) تشمل جينوم متسلسلة والمشروح12؛ الترنسكربيتوم13؛ الإنمائية التدريج الجدول14؛ والأساليب لتربية15،،من1617، خلق الوراثي18، وتحرير الجينات19. نشر أدوات إضافية وتحديث البروتوكولات القياسية سيسرع نمو مجتمع البحوث كافيفيش (انظر هذا أساليب جمع20).
أن هدفنا إضافة مرجع القائمة أدوات بتوفير وسيلة قوية لتقييم الجينات النشاط في الموقع في فترة ما بعد اليرقات مكسيكي (أ)، بطريقة قابلة لمقارنة بين المختبرات. هناك اثنين من التحديات لتحقيق هذا الهدف. أولاً، هناك حاجة لنظم موحدة لتفريخ وتربية الأسماك بين المختبرات، تؤثر الاختلافات في معلمات مثل التغذية وكثافة النمو والنضج، وبالتالي تؤثر على نشاط الجينات. وثانيا، هناك حاجة لطريقة موحدة غير قابلة للتكيف لدراسة أنماط النشاط الجيني في الأسماك اليرقات بعد. علينا أن نعالج هذه المسائل هنا، إرساء ممارسات قياسية لتربية الأسماك في مراحل ما بعد اليرقات وإدخال بروتوكول قوية الجامعة-جبل إيمونوهيستوتشيميستري (المدينة) لتقييم التعبير الجيني في ألف مكسيكي.
ونحن أولاً لشرح كيفية تربية الأسماك عن طريق التفريخ الطبيعي والتعرف على البيض المخصب. وصف القادم كيفية يفقس البيض المخصب (اليرقات) ونقلها إلى حاويات الحضانة، حيث أنها تمسك في كثافة الأسماك 20 للحاوية الواحدة لمدة أسبوعين دون تعميم أو تغيير الماء. 5-يوما بعد الإخصاب، الأسماك تطورت إلى مراحل ما بعد اليرقات (لم يعد وجود إمدادات صفار) وتقدم تغذية الطحالب Brachionus بليكاتيليس (الروتيفر) كمصدر لغذاء الغنية بالمغذيات التي لا تتطلب التجديد اليومي. يوفر هذا الأسلوب معلمات النمو المطرد للتنمية اليرقات وما بعد اليرقات.
لتقييم وظيفة الجينات، نحن لشرح كيفية إزالة الأسماك من الحاويات الحضانة وأداء الجامعة-جبل المدينة. الأسلوب المدينة قدم هو مقتبس من البروتوكولات التي وضعت للاستخدام مع دانيو rerio21 وفعالة لفحص مولدات المضادات في جميع الأنسجة مكسيكي (أ) اختبار، بما في ذلك في الدماغ والأمعاء والبنكرياس. المدينة بديل أسرع لتوليد الحيوانات المحورة وراثيا لدراسة التعبير الجيني والتعريب البروتين. هذا البروتوكول سيكون مفيداً للدراسات الرامية إلى زراعة ألف مكسيكي ومقارنة تعمل من الأسماك السطحية وكافيفيش في مراحل ما بعد اليرقات.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>methylene blue</td>
			<td>Kordon</td>
			<td>B016CBHZUS</td>
			<td>antifungal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heater</td>
			<td>Finnex</td>
			<td>4711457836017</td>
			<td>100W Digital Control Heater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>airstone</td>
			<td>Lee&#39;s Aquarium &#38; Pet Products</td>
			<td>10838125202</td>
			<td>disposable air stone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>salt</td>
			<td>Instant Ocean</td>
			<td>51378014021</td>
			<td>Sea Salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nursery container</td>
			<td>IPC</td>
			<td>21545-002</td>
			<td>40 oz or 1.5 L clear containers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transfer pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-002</td>
			<td>plastic bulb pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>compact culture system(CCS) starter kit with Brachionus plicatilis (L-type) rotifers</td>
			<td>Reed Mariculture</td>
			<td>na</td>
			<td>fish food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RGcomplete</td>
			<td>APBreed</td>
			<td>817656016572</td>
			<td>32 oz bottle of rotifer food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Programmable Auto Dosing Pump DP-4</td>
			<td>Jebao</td>
			<td>DP-4</td>
			<td>automatic feeder for rotifers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricane-S</td>
			<td>Western Chemical</td>
			<td>MS 222</td>
			<td>fish anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761-500G</td>
			<td>for tricane solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nylon mesh strainer</td>
			<td>HIC (Harold Import Co.)</td>
			<td>735343476235</td>
			<td>3-inch diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128-4L</td>
			<td>fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9625</td>
			<td>buffer, dilute to 1X using distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-x 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td>detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002-25G</td>
			<td>anti-bacterial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9647-100G</td>
			<td>blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass vial with screw-top cap 4mL</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>224742</td>
			<td>staining vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic mesh screen for breeding tank</td>
			<td>Pentair</td>
			<td>N1670</td>
			<td>Cut into a rectangle 6mm larger on all edges than the dimensions of the bottom of the breeding tank. Cut a 6mm square from each corner of the rectangle. Bend the edges of the screen down along all four edges.Place a pair of 6mm vinyl-coated disk magnets on either side (top and bottom) of the mesh on each corner. The screen should be as snug as possible to the sides of the tank. The screen can be removed from the tank with a metal fish net.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vinyl-coated disk magnets</td>
			<td>Kjmagnets</td>
			<td>D84PC-AST</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Life Spectrum Thera-A pellet fish food</td>
			<td>New Life International</td>
			<td>na</td>
			<td>Adult fish food. A list of retailers for this product is available on the company website</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>insulin antibody from guinea pig</td>
			<td>Dako</td>
			<td>A0564</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucagon antibody from sheep</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab36215</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetylated tubulin antibody from mouse</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6793</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HuD/HuC antibody from mouse</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21271</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nitric oxide synthase (nNOS) antibody from rabbit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab106417</td>
			<td>5&#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>choline acetyltransferase (ChAT) from rabbit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab178850</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>seratonin (5HT) from rabbit</td>
			<td>Immunostar</td>
			<td>20080</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

raising the mexican tetra astyanax mexicanus for analysis of post-larval phenotypes and whole-mount immunohistochemistry

النهر والسكان تكييف كهف مكسيكي أستياناكس إظهار الاختلافات في مورفولوجيا وفسيولوجيا وسلوك. وقد كشفت الأبحاث التي ركزت على المقارنة بين أشكال الكبار الأساس الوراثي لبعض هذه الاختلافات. يعرف عن كيفية اختلاف السكان في مراحل ما بعد اليرقات (في بداية التغذية). مثل هذه الدراسات قد توفر نظرة ثاقبة كيف cavefish البقاء على قيد الحياة من خلال مرحلة البلوغ في بيئتهم الطبيعية. طرق مقارنة التنمية ما بعد اليرقات في المختبر تتطلب الموحد تربية الأحياء المائية ونظم التغذية. هنا ونحن تصف كيفية رفع الأسماك على اتباع نظام غذائي الروتيفر الغنية بالمغذيات في المياه غير تعميم لتصل إلى أسبوعين بعد الإخصاب. ونحن لشرح كيفية جمع الأسماك اليرقات بعد من هذا النظام الحضانة وأداء الجامعة-جبل إيمونوستينينج. إيمونوستينينج بديل جذاب لتحليل التعبير التحوير لتحقق التنمية ووظيفة الجينات في ألف مكسيكي. يمكن أيضا استخدام الأسلوب الحضانة كبروتوكول قياسي لإقامة السكان كثافة مطابقة للنمو في البالغين.

ويبين الجدول 1 النجاح خلال سنة واحدة لتربية الأسماك السطحية و cavefish تنجا، مولينو، و Pachón في خزانات تربية ثابتة. السطح ويولد Pachón مع أجنة مخصبة أنتجت دائماً دبرت اليرقات، بينما مولينو وتنجا باءت بالفشل بعض الوقت (2/6 و 2/18 تفريخ الأحداث لا تنتج اليرقات مظلل، على التوالي). وهناك تباين في حجم مخلب التي تظهر لا يجب أن ينسب إلى عمر الأسماك الأصل. ويبين الجدول 2 مجموع مظلل اليرقات الناتجة عن بعض الأحداث التفريخ، وعمر الأسماك الأصل. بشكل عام، وجدنا أن إنتاج الأسماك السطحية أكبر عدد من اليرقات كل تفرخ (المتوسط ± 1,550 894، ن = 5)، تليها Pachón (المتوسط ± 879 680، ن = 6)، تنجا (المتوسط ± 570 373، ن = 11)، ومولينو (المتوسط ± 386 276، n = 3). عدد اليرقات المنتجة عادة أكثر مما بحاجة لكل تجربة أو للنمو في البالغين. ونحن عادة إعداد 6-18 حضانة الحاويات (يرقات 120-360) و euthanize الأسماك المتبقية.
لقياس مدى نجاح البروتوكول الحضانة سجلنا عدد اليرقات مظلل والأسماك اليرقات بعد الباقين على قيد الحياة من أحداث التفريخ الناجح. الجدول 3 يوضح البيانات من شهر 1 للتربية في تعميم الدبابات ويشمل عدد اليرقات نقلها إلى حاويات الحضانة التي نجت إلى 14 إدارة الشرطة الاتحادية. خلال هذا الشهر، تراوح معدل البقاء على قيد الحياة 41-81 في المئة، أدى إلى 65-293 الأسماك المتاحة لكل السكان للتجارب أو النمو في البالغين.
لتحديد ما إذا كانت الجامعة-جبل إيمونوستينينج بنجاح، قارنا الأسفار عينات المحتضنة مع جسم الأولية لتلك المحتضنة مع الجسم المضاد الثانوي فقط. إشارة الفلورسنت مرئياً فقط في الأسماك المحتضنة مع جسم الأولية. وقد استخدمنا هذا البروتوكول بنجاح قم بتسمية الخلايا العصبية10 (الشكل 1) وخلايا البنكرياس6 مراحل تصل إلى 12.5 إدارة الشرطة الاتحادية في كل سطح، وكهف مورفوتيبيس.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58972/58972fig1.jpg"> رقم 1: العلامات العصبية. الجامعة-جبل إيمونوستاينينج من مكسيكي أ. صورة 12.5 إدارة الشرطة الاتحادية سطح الأسماك () و Pachón كافيفيش (ب). صورة لمنطقة منتصف الجسم [مخطط أصفر مظلل يظهر في (أ) و (ب)] من الأسماك السطحية (ج) و Pachón كافيفيش (د) ملطخة بجسم الخلايا العصبية القومية (هو جين تاو). (ﻫ) كونفوكال الصورة من منطقة الخلايا العصبية المعوية تظهر الأمعاء الأسماك السطحية (هو جين تاو) وإسقاطاتها (أسيتيلاتيد توبولين). لهذه الصورة، تم تشريح خارج الأمعاء وشنت في المتوسط تحتوي على DAPI وصمة عار الأنوية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58972/58972fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>السكان</td>
			<td>محاولات</td>
			<td>التفريخ الأحداث</td>
			<td>براثن</td>
		</tr>
<tr>
<td>سطح</td>
			<td>94</td>
			<td>23</td>
			<td>23</td>
		</tr>
<tr>
<td>مولينو</td>
			<td>110</td>
			<td>6</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pachón</td>
			<td>167</td>
			<td>13</td>
			<td>13</td>
		</tr>
<tr>
<td>تنجا</td>
			<td>242</td>
			<td>18</td>
			<td>16</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1: موجز للبيانات من سنة واحدة لتربية ألف-مكسيكي في خزانات ثابتة. عدد من تكاثر محاولات، نتيجة التفريخ الأحداث، وعدد الأحداث التي أنتجت التفريخ فقست اليرقات.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>السكان</td>
			<td>سن الأم</td>
			<td>يرقات مظلل</td>
		</tr>
<tr>
<td>سطح</td>
			<td>السنة 1</td>
			<td>989</td>
		</tr>
<tr>
<td>سطح</td>
			<td>السنة 1</td>
			<td>1050</td>
		</tr>
<tr>
<td>سطح</td>
			<td>3 سنوات</td>
			<td>2214</td>
		</tr>
<tr>
<td>سطح</td>
			<td>3 سنوات</td>
			<td>432</td>
		</tr>
<tr>
<td>سطح</td>
			<td>3 سنوات</td>
			<td>1768</td>
		</tr>
<tr>
<td>سطح</td>
			<td>4 سنوات</td>
			<td>2852</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pachón</td>
			<td>السنة 1</td>
			<td>1194</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pachón</td>
			<td>السنة 1</td>
			<td>عام 1933</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pachón</td>
			<td>1.5 سنة</td>
			<td>371</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pachón</td>
			<td>3 سنوات</td>
			<td>480</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pachón</td>
			<td>4 سنوات</td>
			<td>1190</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pachón</td>
			<td>4 سنوات</td>
			<td>110</td>
		</tr>
<tr>
<td>تنجا</td>
			<td>9 أشهر</td>
			<td>259</td>
		</tr>
<tr>
<td>تيناجا</td>
			<td>9 أشهر</td>
			<td>253</td>
		</tr>
<tr>
<td>تنجا</td>
			<td>10 أشهر</td>
			<td>1100</td>
		</tr>
<tr>
<td>تنجا</td>
			<td>11 شهرا</td>
			<td>857</td>
		</tr>
<tr>
<td>تنجا</td>
			<td>السنة 1</td>
			<td>713</td>
		</tr>
<tr>
<td>تنجا</td>
			<td>السنة 1</td>
			<td>853</td>
		</tr>
<tr>
<td>تنجا</td>
			<td>السنة 1</td>
			<td>542</td>
		</tr>
<tr>
<td>تنجا</td>
			<td>1.5 سنة</td>
			<td>360</td>
		</tr>
<tr>
<td>تنجا</td>
			<td>1.5 سنة</td>
			<td>58</td>
		</tr>
<tr>
<td>تنجا</td>
			<td>1.5 سنة</td>
			<td>1100</td>
		</tr>
<tr>
<td>تنجا</td>
			<td>4 سنوات</td>
			<td>185</td>
		</tr>
<tr>
<td>مولينو</td>
			<td>2.5 سنة</td>
			<td>460</td>
		</tr>
<tr>
<td>مولينو</td>
			<td>2.5 سنة</td>
			<td>619</td>
		</tr>
<tr>
<td>مولينو</td>
			<td>3 سنوات</td>
			<td>81</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 2: تقريب سن الإناث وعدد اليرقات فقست من أحداث التناسل فردية من السكان المشار إليها في مكسيكي أ.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>السكان</td>
			<td>محاولات</td>
			<td>التفريخ الأحداث</td>
			<td>براثن</td>
			<td>حجم مخلب</td>
			<td>نقل اليرقات إلى الكؤوس الحضانة</td>
			<td>الأسماك اليرقات بعد في 14dpf</td>
			<td>البقاء على قيد الحياة (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>سطح</td>
			<td>4</td>
			<td>3</td>
			<td>2</td>
			<td>576 و 1728</td>
			<td>360</td>
			<td>174</td>
			<td>48</td>
		</tr>
<tr>
<td>مولينو</td>
			<td>4</td>
			<td>2</td>
			<td>1</td>
			<td>228</td>
			<td>159</td>
			<td>65</td>
			<td>41</td>
		</tr>
<tr>
<td>تنجا</td>
			<td>4</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1952</td>
			<td>175</td>
			<td>93</td>
			<td>53</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pachón</td>
			<td>4</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1696</td>
			<td>360</td>
			<td>293</td>
			<td>81</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 3: موجز للبيانات من شهر واحد من تربية ألف مكسيكي في تعميم نظام وتربية اليرقات. عدد محاولات، نتيجة تربية تفريخ الأحداث، براثن التي أنتجت مظلل اليرقات، متوسط عدد اليرقات في مخلب، اليرقات نقلها إلى حاويات الحضانة، وما بعد اليرقات السمكية موجودة في حاويات الحضانة بعد 14 يوما.

Watch this Scientific Journal Video about Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry at JoVE.com

Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry

رفع "تترا المكسيكي" مكسيكي أستياناكس لتحليل تعمل بوستلارفال والجامعة-جبل إيمونوهيستوتشيميستري

في هذا البروتوكول، لشرح كيفية تولد مكسيكي أستياناكس الكبار، ورفع اليرقات، وأداء الجامعة-جبل immunohistochemistry على الأسماك اليرقات بعد مقارنة تعمل سطح، وكهف مورفوتيبيس.

River and cave-adapted populations of Astyanax mexicanus show differences in morphology, physiology, and behavior. Research focused on comparing adult ...

هنا نُوضح كيفية تربية المكسيكي تترا Astyanax المكسيكي، ورفع اليرقات، وتنفيذ الكيمياء المناعية على اليرقات في مرحلة ما بعد لمقارنة الأنماط الظاهرية للأسماك المتكيفة مع الأنهار والكهوف. نحن نربي الأسماك بنفس الكثافة على نظام غذائي غني بالمغذيات من الروتيفر. هذه التقنية تضمن نموًا ثابتًا وتوفر مزايا في التكلفة والأمن البيولوجي وجودة المياه.للبدء، ضع شبكة بلاستيكية في الجزء السفلي من خزان خمسة غالون. ثم ملء الخزان مع الأسماك الجاهزة المياه. الصق سخان المياه على جانب الخزان.إضافة أنثى واحدة واثنين من الذكور Astyanax الأسماك المكسيكية التي هي أكثر من سنة واحدة من العمر إلى الخزان. تعيين درجة حرارة سخان المياه إلى 24 درجة مئوية. بعد 24 ساعة، وزيادة درجة الحرارة بمقدار درجة مئوية واحدة.تألق مصباح يدوي في الجزء السفلي من الخزان كل يوم للتحقق من وجود البيض. مرة واحدة يتم تحديد البيض في خزان التربية، وإزالة الأسماك الكبار وشبكة بلاستيكية. استخدمي القارص لتقليل عمق الماء إلى 10 سم.لتقدير وقت الإخصاب، استخدم ماصة نقل لوضع عدة بيضات في طبق بتري وعرضها بمجهر ستيريو لتحديد مرحلتها. إزالة البيض أو البراز غير شفاف. ثم ملء الخزان مع المياه الجاهزة الأسماك وإضافة سبع قطرات من الميثيلين الأزرق إلى الماء.بعد هذا، إضافة سخان وحوض فقاعات الحوض إلى الخزان. تعيين سخان إلى 24 درجة مئوية وضبط منظم تيار الهواء لإنتاج تيار لطيف من فقاعات. ثم تغطية الخزان للحفاظ على درجة حرارة المياه.إضافة 20 غراما من الملح إلى ثمانية لترات من الأسماك الماء الجاهز ويحركها حتى يتم حلها. ثم يضاف لتر واحد من المياه المعدة لكل حاوية حضانة. بعد ذلك استخدام ماصة نقل لنقل 20 من اليرقات مفقست إلى كل حاوية الحضانة.تهيج المياه في خزان أكبر لضمان أن جميع اليرقات قد أزيلت. لتحضير طعام السمك، أضف ثلاثة مل من خليط الطحالب إلى لتر واحد من الروتيفر المحصّن. خمسة أيام بعد الإخصاب إضافة ثلاثة مل من الغذاء الأسماك إلى كل حاوية الحضانة.يجب أن تكون الروتيفر مرئية في مجموعات كثيفة عند زاوية الحاويات ما لم تكن مرئية بالقرب من المركز. تحقق من الحاوية ل rotifers كل يوم وإضافة المزيد من المواد الغذائية إذا تم استنفاد التركيز. إزالة أي يرقات ميتة.أولا، لمسح الجهاز الهضمي من محتويات الطعام، صب حاوية الحضانة مع الأسماك في السن المطلوب من خلال مصفاة شبكة النايلون. ضع المصفاة في حاوية مع مياه نظيفة جاهزة للأسماك وحجب الطعام لمدة 24 ساعة. بعد القتل الرحيم الأسماك، وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية، واستخدام ماصة نقل لنقل الأسماك إلى أنبوب مخروطي.استبدل حل القتل الرحيم بالثبت. واحتضان أنبوب مع هزاز بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. بعد ذلك، قم بإزالة المثبت واستبدالها بـ PBST.احتضان الأنبوب لمدة 15 دقيقة أخرى مع هزاز. وكرر عملية الغسيل مرة أخرى. بعد ذلك، استخدم ماصة نقل لنقل الأسماك إلى قارورة زجاجية أربعة مل مع غطاء أعلى المسمار.إزالة PBST من القارورة وإضافة ثلاثة مل من حل حظر. احتضان القارورة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة مع هزاز. بعد ذلك، استخدم ماصة نقل لإزالة حل الحجب واستبداله بالأجسام المضادة الأولية المخففة في محلول الحجب.احتضان القارورة بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة مع الانفعالات. بعد ذلك ، قم بغسل الأسماك مع PBST ثلاث مرات ، كما هو موضح سابقًا. استبدال PBST مع الأجسام المضادة الثانوية المخففة في حل حظر.واحتضان القارورة بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة مع الانفعالات. وأخيرا، يغسل الأسماك ثلاث مرات لمدة 15 دقيقة مع PBST. باستخدام هذا البروتوكول، ولدت الأسماك السطحية تيناجا، مولينو وباكون كهوف الأسماك في خزانات تربية ثابتة.السطح و Pachon يولد، مع الأجنة المخصبة، تنتج دائما يرقات مفقمة. في حين أن مولينو وتيناجا لم تنجح بعض الوقت. بشكل عام، أنتجت الأسماك السطحية أكبر عدد من اليرقات لكل تفرخ، تليها باشون، تيناجا، ومولينو على التوالي.تم استخدام تقنية المناعة كاملة التركيب بنجاح لتسمية الخلايا العصبية وخلايا البنكرياس في مراحل تصل إلى 12.5 يوم بعد الإخصاب. من المهم إزالة أي أسماك نافقة وأنت ترفع اليرقات وتسجل عدد الأسماك الباقية. إذا كان العديد من الأسماك تموت قد يكون ذلك بسبب التلوث البكتيري أو الفطري.يجب تعقيم الخزانات بنسبة 70٪ من الإيثانول قبل الاستخدام. تم استخدام تقنية الكبت المناعي التي وصفناها بنجاح للأجسام المضادة المدرجة في جدول المواد. بعد المناعة، يمكن أن تكون الأسماك كاملة شنت أو مقطعة لعرض أي نسيج من الاهتمام.وفي الجمع بين ذلك، يوفر إجراء التربية والتفقيس وكبت المناعة طريقة قوية لتقييم النشاط الجيني NC2 بطريقة قابلة للمقارنة بين المختبرات.

Research

JoVE Journal

Genetics

Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry

The Use of Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

The Use of Induced Somatic Sector Analysis ISSA for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

استخدام المستحثة الجسدية التحليل القطاعي (ISSA) لدراسة الجينات والمروجين المشاركة في تشكيل الخشب والتنمية الجذعية الثانوية

Secondary stem growth in trees and associated wood formation are significant both from biological and commercial perspectives. However, relatively little ...

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

اقترانية التزاوج فحوصات لتحليل تسلسل محدد من البروتينات نقل تشارك في الإقتران البكتيرية

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

تحليل الكروموسومات الزيغ الناجم عن المواد-المحيط الجسيمات باستخدام<em&gt; في المختبر</em&gt; النظام

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes

عمليات الاستخراج الملح متسلسلة لتحليل الكروماتين الأكبر ربط خصائص لتعديل مجمعات الكروماتين

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous ...

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

تحليل ج- كيت يجند المروج باستخدام الكروماتين مناعي

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

جيل من الكروماتين الأصلية إيمونوبريسيبيتيشن تسلسل المكتبات لتحليل كثافة نوكليوسومي

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

إيمونوستينينج لإدخال تعديلات على الحمض النووي: التحليل الحسابي للصور [كنفوكل]

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

الكروماتين انتشار الأعمال التحضيرية لتحليل تطور البويضات الماوس من الطور الأول الطورية الثاني

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

تحليل في الوقت الحقيقي النسخ عامل ملزم، النسخ والترجمة، ودوران لعرض الأحداث العالمية خلال التنشيط الهاتف الخلوي

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...