Name: raising the mexican tetra astyanax mexicanus for analysis of post-larval phenotypes and whole-mount immunohistochemistry
Uploaded: 2018-12-28T13:00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry at JoVE.com

यह काम स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों [HD089934, DK108495] से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था ।

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	<li>Carlson, B. M., Klingler, I. B., Meyer, B. J., Gross, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+reveals+candidate+genes+for+activity+QTL+in+the+blind+Mexican+tetra,+Astyanax+mexicanus.">Genetic analysis reveals candidate genes for activity QTL in the blind Mexican tetra, Astyanax mexicanus.</a> PeerJ. 6, e5189 (2018).</li><li>Chin, J. S. R., Gassant, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergence+on+reduced+stress+behavior+in+the+Mexican+blind+cavefish.">Convergence on reduced stress behavior in the Mexican blind cavefish.</a> Developmental Biology. 441 (2), 319-327 (2018).</li><li>Lloyd, E., Olive, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+shift+towards+lateral+line+dependent+prey+capture+behavior+in+the+blind+Mexican+cavefish.">Evolutionary shift towards lateral line dependent prey capture behavior in the blind Mexican cavefish.</a> Developmental Biology. 441 (2), 328-337 (2018).</li><li>Tabin, J. A., Aspiras, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+preference+of+cave+and+surface+populations+of+Astyanax+mexicanus.">Temperature preference of cave and surface populations of Astyanax mexicanus.</a> Developmental Biology. 441 (2), 338-344 (2018).</li><li>Xiong, S., Krishnan, J., Peu&#223;, R., Rohner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+adipogenesis+contributes+to+excess+fat+accumulation+in+cave+populations+of+Astyanax+mexicanus.">Early adipogenesis contributes to excess fat accumulation in cave populations of Astyanax mexicanus.</a> Developmental Biology. 441 (2), 297-304 (2018).</li><li>Riddle, M. R., Aspiras, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+in+cavefish+as+an+adaptation+to+a+nutrient-limited+environment.">Insulin resistance in cavefish as an adaptation to a nutrient-limited environment.</a> Nature. 555 (7698), 647-651 (2018).</li><li>Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eyeless+Mexican+cavefish+save+energy+by+eliminating+the+circadian+rhythm+in+metabolism.">Eyeless Mexican cavefish save energy by eliminating the circadian rhythm in metabolism.</a> PloS One. 9 (9), e107877 (2014).</li><li>Aspiras, A. C., Rohner, N., Martineau, B., Borowsky, R. L., Tabin, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanocortin+4+receptor+mutations+contribute+to+the+adaptation+of+cavefish+to+nutrient-poor+conditions.">Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (31), 9668-9673 (2015).</li><li>Tang, J. L. Y., Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+origin+of+heart+size+and+shape+differences+in+Astyanax+mexicanus+populations.">The developmental origin of heart size and shape differences in Astyanax mexicanus populations.</a> Developmental Biology. 441 (2), 272-284 (2018).</li><li>Riddle, M. R., Boesmans, W., Caballero, O., Kazwiny, Y., Tabin, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+motility+of+the+Astyanax+mexicanus+gastrointestinal+tract.">Morphogenesis and motility of the Astyanax mexicanus gastrointestinal tract.</a> Developmental Biology. 441 (2), 285-296 (2018).</li><li>Gore, A. V., Tomins, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+epigenetic+mechanism+for+cavefish+eye+degeneration.">An epigenetic mechanism for cavefish eye degeneration.</a> Nature Ecology &amp; Evolution. 2 (7), 1155-1160 (2018).</li><li>McGaugh, S. E., Gross, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cavefish+genome+reveals+candidate+genes+for+eye+loss.">The cavefish genome reveals candidate genes for eye loss.</a> Nature Communications. 5, (2014).</li><li>Gross, J. B., Furterer, A., Carlson, B. M., Stahl, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Integrated+Transcriptome-Wide+Analysis+of+Cave+and+Surface+Dwelling+Astyanax+mexicanus.">An Integrated Transcriptome-Wide Analysis of Cave and Surface Dwelling Astyanax mexicanus.</a> PLoS One. 8 (2), e55659 (2013).</li><li>Hinaux, H., Pottin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Developmental+Staging+Table+for+Astyanax+mexicanus+Surface+Fish+and+Pach&#243;n+Cavefish.">A Developmental Staging Table for Astyanax mexicanus Surface Fish and Pach&#243;n Cavefish.</a> Zebrafish. 8 (4), 155-165 (2011).</li><li>Borowsky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breeding+Astyanax+mexicanus+through+natural+spawning.">Breeding Astyanax mexicanus through natural spawning.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 3 (11), (2008).</li><li>Borowsky, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handling+Astyanax+mexicanus+Eggs+and+Fry.">Handling Astyanax mexicanus Eggs and Fry.</a> CSH Protocols. , (2008).</li><li>Stahl, B. A., Gross, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+Transcriptomic+Analysis+of+Development+in+Two+Astyanax+Cavefish+Populations.">A Comparative Transcriptomic Analysis of Development in Two Astyanax Cavefish Populations.</a> Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular and Developmental Evolution. 328 (6), 515-532 (2017).</li><li>Elipot, Y., Legendre, L., P&#232;re, S., Sohm, F., R&#233;taux, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astyanax+Transgenesis+and+Husbandry.">Astyanax Transgenesis and Husbandry.</a> How Cavefish Enters the Laboratory. Zebrafish. 11 (4), 291-299 (2014).</li><li>Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+using+TALENs+in+blind+Mexican+Cavefish,+Astyanax+mexicanus.">Genome editing using TALENs in blind Mexican Cavefish, Astyanax mexicanus.</a> PloS One. 10 (3), e0119370 (2015).</li><li>. Current methods in Astyanax mexicanus research Available from: <a target="_blank" href="https://www.jove.com/methods-collections/16/current-methods-inastyanax-mexicanusresearch">https://www.jove.com/methods-collections/16/current-methods-inastyanax-mexicanusresearch</a> (2018)</li><li>Heanue, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Zebrafish+ret+Heterozygous+Model+of+Hirschsprung+Disease+Identifies+a+Functional+Role+for+mapk10+as+a+Modifier+of+Enteric+Nervous+System+Phenotype+Severity.">A Novel Zebrafish ret Heterozygous Model of Hirschsprung Disease Identifies a Functional Role for mapk10 as a Modifier of Enteric Nervous System Phenotype Severity.</a> PLoS Genetics. 12 (11), (2016).</li><li>Riddle, M. R., Baxter, B. K., Avery, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identification+of+microorganisms+associated+with+the+brine+shrimp+Artemia+franciscana.">Molecular identification of microorganisms associated with the brine shrimp Artemia franciscana.</a> Aquatic Biosystems. 9 (1), (2013).</li><li>Tsang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breeding+Zebrafish:+A+Review+of+Different+Methods+and+a+Discussion+on+Standardization.">Breeding Zebrafish: A Review of Different Methods and a Discussion on Standardization.</a> Zebrafish. 14 (6), 561-573 (2017).</li></ol>

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

सतह और गुफा ए mexicanus के बीच जीन गतिविधि की तुलना सावधानी से नियंत्रित पर्यावरणीय मापदंडों और विधियों कि प्रयोगशालाओं में दोहराया जा सकता है की आवश्यकता है । mexicanus स्थापना के लिए हमारे प्रोटोकॉल के बाद लार्वा विकास के दौरान लगातार पोषण सामग्री प्रदान करता है । इस खिला शासन के बाद, जीन समारोह आत्मविश्वास से आबादी के बीच की तुलना में मजबूत immunohistochemistry प्रोटोकॉल हम वर्तमान का उपयोग कर सकते हैं । यहां हम इस विधि के महत्व के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अपनी सीमाओं और भविष्य के अनुप्रयोगों पर चर्चा।
घनत्व मिलान वृद्धि प्राप्त करने के लिए, हमने पाया है कि पोस्ट-लार्वा मछली rotifers के एक आहार पर १.५ एल कंटेनरों में दो सप्ताह के लिए पानी के बिना परिसंचारी उठाया जा सकता है । यह प्रोटोकॉल भी एक परिसंचारी प्रणाली पर मछली उठाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है; हालांकि, rotifers टैंक बहिर्वाह के माध्यम से खो उन लोगों के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए दैनिक जोड़ा जाना चाहिए । नव रचा Artemia nauplii सामांयतः जलीय कृषि में एक खाद्य स्रोत के रूप में उपयोग किया जाता है, लेकिन हमने पाया है कि rotifers का उपयोग काफी फायदे हैं, सहित: कम कीमत, बेहतर सुरक्षा, लगातार पोषण, और पानी की गुणवत्ता में सुधार (नीचे देखें) ।
सबसे पहले, उपभोग्य सामग्रियों में साप्ताहिक लागत rotifers के लिए 4 डॉलर है, Artemiaके लिए 14 डॉलर की तुलना में । जैविक सुरक्षा के बारे में, rotifers प्रयोगशाला में नियंत्रित परिस्थितियों में उठाया जाता है, जबकि Artemia जंगली से एकत्र कर रहे हैं और माइक्रोबियल या रोगज़नक़ सामग्री23में प्राकृतिक भिन्नता के अधीन । इसके अतिरिक्त, Artemia nauplii के पोषक तत्वों की संरचना पर्यावरण की दृष्टि से निर्धारित कर रहे है और इसलिए असंगत । Nauplii सेने के बाद अपने स्वयं के ऊर्जा भंडार पर पनपे; वे जल्दी से पोषण मूल्य ढीला के रूप में वे विकसित और इष्टतम कई घंटे के भीतर मछली को खिलाया जाना चाहिए । Artemia 12 घर के बाद सेने में खिला शुरू, पहली बार है कि वे पोषण समृद्ध हो सकता है का प्रतिनिधित्व; हालांकि, इस स्तर पर वे 5 dpf मछली के लिए बहुत बड़े हो गए है भस्म । इसकी तुलना में rotifers लगातार उच्च पोषक तत्व सामग्री में जिसके परिणामस्वरूप समुद्री सूक्ष्म शैवाल पर फ़ीड की परवाह किए बिना जब rotifers काटा जाता है । Rotifers Artmeia nauplii (१६० बनाम ४०० माइक्रोन) की तुलना में बहुत छोटे हैं, उन्हें आसानी से मछली पकड़ने और निगलने के लिए बना । पोस्ट-लार्वा सतह मछली और cavefish समान मात्रा में rotifers का उपभोग करने के लिए वरीयता या rotifers10पर कब्जा करने की क्षमता में कोई अंतर नहीं का सुझाव ।
अंत में, Artemia nauplii शुरू होने के बाद कई घंटे ताजे पानी में मरने लगते हैं । खाया nauplii क्षय होगा, तेजी से पानी की गुणवत्ता कम अगर वे मैंयुअल रूप से नहीं हटा रहे हैं । मृत Artemia को हटाना समय लेने वाली और पोस्ट-लार्वा मछली है कि Artemia से ज्यादा बड़ा नहीं कर रहे है और गलती से हटा दिया या घायल हो सकता है के लिए खतरनाक है । Rotifers नर्सरी कंटेनरों में अनिश्चित काल तक रह सकते है और पानी की गुणवत्ता को काफी प्रभावित किए बिना हर समय मछली को भोजन प्रदान करते हैं ।
जबकि एक खाद्य स्रोत के रूप में rotifers का उपयोग काफी लाभ है, rotifer शेयर बनाए रखने के लिए, शैवाल संस्कृति प्रणाली के लिए दैनिक जोड़ा जाना चाहिए । यह एक स्वचालित फीडर है कि rotifer संस्कृति कंटेनर में तरल शैवाल तिरस्कृत ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ प्राप्त किया जा सकता है । Rotifers भी संस्कृति के स्वास्थ्य को बनाए रखने के लिए हर 24-48 घंटे इस सेट से काटा जाना चाहिए । शोधकर्ताओं कि नस्ल मछली बहुत अक्सर (एक बार एक साल, उदाहरण के लिए) और के बाद में आबादी के बीच तुलना बनाने के साथ संबंध नहीं है लार्वा चरणों एक खाद्य स्रोत के रूप में Artemia पसंद कर सकते हैं, के बाद से encysted भ्रूण किसी भी समय रचा जा सकता है ।
हम हैच और जीवित लार्वा की संख्या पर नज़र रखने के लिए सेने और विकास की सफलता पर नजर रखने की सलाह देते हैं । अगर ज्यादातर भ्रूण या लार्वा मर जाते हैं, तो यह जीवाणु या फंगल प्रदूषित होने के कारण हो सकता है । यह मछली के पानी की गुणवत्ता के लिए तैयार पानी की निगरानी और ७०% इथेनॉल के साथ किसी भी उपकरण को निष्फल करने की सिफारिश की है । नर्सरी कंटेनरों फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है के बाद वे साफ कर रहे है और निष्फल । रोग के जोखिम को कम करने के लिए, यह भी नर्सरी कंटेनरों से किसी भी मृत मछली को हटाने और 5 dpf से पहले rotifers नहीं जोड़ने के लिए महत्वपूर्ण है, जब मछली खाने के लिए शुरू ।
ए mexicanus लगभग एक वर्ष की उंर में यौन परिपक्व हैं । यह ढाणियो rerio (zebrafish) है कि 10-12 सप्ताह24में नस्ल कर रहे है की तुलना में ट्रांसजेनिक a. mexicanus पैदा करने के लिए एक सीमा है । Immunohistochemistry (आइएचसी) जीन अभिव्यक्ति और प्रोटीन स्थानीयकरण की जांच करने के लिए एक वैकल्पिक तरीका है । यहां वर्णित प्रोटोकॉल हर कदम पर अनुकूलित किया जा सकता है और ब्याज की किसी भी ऊतक में एंटीजन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया । यह नोट करने के लिए महत्वपूर्ण है, तथापि, कि कुछ ऊतकों को और अधिक हो सकता है की सतह मछली रंजकता के कारण में कल्पना मुश्किल (एक बाधा है कि विवर्णीय cavefish में मौजूद नहीं है), जो तुलनात्मक अध्ययन की व्याख्या को प्रभावित कर सकते हैं । इस संभावित समस्या का पता करने के लिए, सतह मछली वर्णक 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड का उपयोग कर निर्धारण के बाद ब्लीच किया जा सकता है ।
आइएचसी सफल ऊतक निर्धारण, अवरुद्ध, और एंटीबॉडी पैठ की आवश्यकता है । प्रत्येक के लिए तरीके ऊतक और ब्याज के प्रोटीन के आधार पर बदलती हैं । निर्धारण और निर्धारण समय प्रतिजन epitope बनाए रखते हुए सेल वास्तुकला की रक्षा करना चाहिए । इस प्रोटोकॉल के लिए, हम क्रॉस-लिंक करने वाले निर्धारण (paraformaldehyde) का उपयोग करते है और denaturing निर्धारण (जैसे मेथनॉल या एसीटोन) को छोड़ देते हैं । हमने पाया है कि एसीटोन में मशीन न्यूरॉन और अग्नाशय मार्करों के लिए एंटीबॉडी संकेत कम. अवरुद्ध कदम ऊतक में गैर लक्ष्य प्रोटीन के लिए बाध्यकारी से एंटीबॉडी को रोकने के लिए आवश्यक है । इस विधि का एक संयोजन का उपयोग करता है सामांय सीरम (5%) और BSA (०.२%) ब्लॉकिंग समाधान में । अवरुद्ध समाधान एंटीबॉडी और प्रोटीन है कि ऊतक में प्रोटीन पर प्रतिक्रियाशील साइटों के लिए बाध्य होते हैं, कम गैर प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के विशिष्ट बंधन ।
एंटीबॉडी प्रवेश प्राप्त करने के लिए, ऊतक permeabilized होना चाहिए । यह डिटर्जेंट या denaturing सॉल्वैंट्स के साथ प्राप्त किया जा सकता है लेकिन प्रतिजन epitope संरक्षित करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए । हमारे प्रोटोकॉल ट्राइटन और dimethyl sulfoxide (DMSO) के संयोजन का उपयोग करता है । ट्राइटन और DMSO ०.५% और 1%, क्रमशः की सांद्रता पर अवरुद्ध और एंटीबॉडी गर्मी कदम के दौरान शामिल हैं । इस एकाग्रता का उपयोग करना, हम मस्तिष्क में दाग देखा है, अग्ंयाशय, आंत, और मांसपेशी, सुझाव है कि यह सभी ऊतकों के प्रवेश के लिए प्रभावी होने की संभावना है । मछली का आकार भी पैठ को प्रभावित कर सकते हैं । इस प्रोटोकॉल है कि 14 दिनों से अधिक पुराने है मछली पर परीक्षण नहीं किया गया है (लगभग 7 मिमी लंबाई में) । धुंधला होने का निवारण करने के लिए, यह निर्धारण, अवरुद्ध, और एंटीबॉडी प्रवेश कदम को बदलने के लिए सिफारिश की है । यह भी महत्वपूर्ण है कि immunogen के mexicanus प्रोटीन के साथ के अनुक्रम संरक्षण की जांच करने के लिए उपलब्ध जीनोम25का उपयोग कर ब्याज की । 
ए mexicanus एक उत्कृष्ट एक ही प्रजाति है कि नाटकीय रूप से अलग वातावरण में विकसित किया है की आबादी के रूप में विकास की जांच मॉडल है सीधे प्रयोगशाला में तुलना में किया जा सकता है । मानक पशुपालन प्रोटोकॉल, दोनों के भीतर और प्रयोगशालाओं के बीच, सतह मछली और cavefish के बीच जैविक मतभेदों को समझने के लिए आवश्यक हैं । हमारे लेख के बाद लार्वा में विकास और जीन गतिविधि की जांच करने के लिए एक विधि प्रदान करता है लगातार विकास के मापदंडों को उजागर मछली ।

मैक्सिकन टेट्रा, Astyanax mexicanus, मछली की एक प्रजाति है कि नदी के रूप में मौजूद है आबादी (सतह मछली) और गुफा के एक नंबर आवास आबादी (cavefish) गुफाओं वे निवास के लिए नाम (यानी, Tinaja, Molino, Pachón) । शोधकर्ताओं की बढ़ती संख्या का उपयोग कर रहे हैं एक. mexicanus व्यवहार के आनुवंशिक और विकास के ठिकानों की जांच करने के लिए1,2,3,4, चयापचय5,6 ,7, 8, और रूपात्मक विकास9,10,11। a. mexicanus की पढ़ाई के लिए उपलब्ध संसाधन एक अनुक्रम और व्याख्या जीनोम12शामिल हैं; transcriptome13; विकास स्टैगिंग तालिका14; और15,16,17प्रजनन के लिए तरीके,18transgenics बनाने, और संपादन जीन19। अतिरिक्त उपकरणों के प्रसार और अद्यतन मानक प्रोटोकॉल cavefish अनुसंधान समुदाय के विकास में तेजी लाने (इस तरीके संग्रह20देखें) होगा ।
हमारा लक्ष्य प्रयोगशालाओं के बीच तुलनीय तरीके से, पोस्ट-लार्वा a. mexicanusमें सीटू में जीन गतिविधि का आकलन करने के लिए एक सुदृढ़ विधि प्रदान करके उपकरणों की मौजूदा प्रदर्शनियों को जोड़ने का है. इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए दो चुनौतियाँ हैं. पहले, वहां के लिए मानकीकृत सरकारों के लिए एक की जरूरत है सेने और प्रयोगशालाओं के बीच मछली स्थापना, जैसे कि भोजन और घनत्व को प्रभावित विकास और परिपक्वता के रूप में मानकों में अंतर है, जिससे जीन गतिविधि प्रभावित । दूसरा, वहां के बाद लार्वा मछली में जीन गतिविधि के पैटर्न की जांच के लिए एक मानकीकृत अभी तक अनुकूलनीय विधि के लिए एक की जरूरत है । हम इन मुद्दों पर यहां पता, के बाद लार्वा चरणों के लिए मछली स्थापना के लिए मानक प्रथाओं की स्थापना और एक मजबूत पूरे-माउंट immunohistochemistry (आइएचसी) एक. mexicanusमें जीन अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए प्रोटोकॉल का परिचय ।
हम पहले प्रदर्शित कैसे प्राकृतिक के माध्यम से मछली नस्ल को पैदा करने और निषेचित अंडे की पहचान । अगले वर्णित है कैसे निषेचित अंडे (लार्वा) हैच और उंहें नर्सरी कंटेनरों, जहां वे दो सप्ताह के लिए कंटेनर प्रति 20 मछली के एक घनत्व पर recirculat या पानी बदलने के बिना बनाए रखा जाता है हस्तांतरण के लिए । 5 दिनों के बाद निषेचन, मछली के बाद लार्वा चरणों (अब एक जर्दी की आपूर्ति होने) विकसित किया है और शैवाल खिलाया Brachionus plicatilis (rotifers) एक पोषक तत्व युक्त खाद्य स्रोत है कि दैनिक भरपाई की आवश्यकता नहीं के रूप में प्रदान की जाती हैं । इस विधि लार्वा और पोस्ट-लार्वा विकास के लिए लगातार वृद्धि मापदंडों प्रदान करता है ।
जीन समारोह का आकलन करने के लिए, हम प्रदर्शन कैसे नर्सरी कंटेनरों से मछली निकालने के लिए और पूरे माउंट आइएचसी प्रदर्शन । आइएचसी विधि प्रस्तुत ढाणियो rerio21 के साथ प्रयोग के लिए विकसित प्रोटोकॉल से अनुकूलित है और सभी A. mexicanus ऊतकों परीक्षण में एंटीजन की जांच के लिए प्रभावी है, मस्तिष्क सहित, आंत, और अग्ंयाशय. आइएचसी जीन अभिव्यक्ति और प्रोटीन स्थानीयकरण की परीक्षा के लिए ट्रांसजेनिक पशुओं पैदा करने के लिए एक तेजी से विकल्प है । यह प्रोटोकॉल ए. mexicanus उगाने के उद्देश्य से अध्ययनों के लिए उपयोगी होगा और पश् लार्वा चरणों में सतह मछली और cavefish के phenotypes की तुलना करना ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>methylene blue</td>
			<td>Kordon</td>
			<td>B016CBHZUS</td>
			<td>antifungal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heater</td>
			<td>Finnex</td>
			<td>4711457836017</td>
			<td>100W Digital Control Heater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>airstone</td>
			<td>Lee&#39;s Aquarium &#38; Pet Products</td>
			<td>10838125202</td>
			<td>disposable air stone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>salt</td>
			<td>Instant Ocean</td>
			<td>51378014021</td>
			<td>Sea Salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nursery container</td>
			<td>IPC</td>
			<td>21545-002</td>
			<td>40 oz or 1.5 L clear containers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transfer pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-002</td>
			<td>plastic bulb pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>compact culture system(CCS) starter kit with Brachionus plicatilis (L-type) rotifers</td>
			<td>Reed Mariculture</td>
			<td>na</td>
			<td>fish food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RGcomplete</td>
			<td>APBreed</td>
			<td>817656016572</td>
			<td>32 oz bottle of rotifer food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Programmable Auto Dosing Pump DP-4</td>
			<td>Jebao</td>
			<td>DP-4</td>
			<td>automatic feeder for rotifers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricane-S</td>
			<td>Western Chemical</td>
			<td>MS 222</td>
			<td>fish anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761-500G</td>
			<td>for tricane solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nylon mesh strainer</td>
			<td>HIC (Harold Import Co.)</td>
			<td>735343476235</td>
			<td>3-inch diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128-4L</td>
			<td>fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9625</td>
			<td>buffer, dilute to 1X using distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-x 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td>detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002-25G</td>
			<td>anti-bacterial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9647-100G</td>
			<td>blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass vial with screw-top cap 4mL</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>224742</td>
			<td>staining vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic mesh screen for breeding tank</td>
			<td>Pentair</td>
			<td>N1670</td>
			<td>Cut into a rectangle 6mm larger on all edges than the dimensions of the bottom of the breeding tank. Cut a 6mm square from each corner of the rectangle. Bend the edges of the screen down along all four edges.Place a pair of 6mm vinyl-coated disk magnets on either side (top and bottom) of the mesh on each corner. The screen should be as snug as possible to the sides of the tank. The screen can be removed from the tank with a metal fish net.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vinyl-coated disk magnets</td>
			<td>Kjmagnets</td>
			<td>D84PC-AST</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Life Spectrum Thera-A pellet fish food</td>
			<td>New Life International</td>
			<td>na</td>
			<td>Adult fish food. A list of retailers for this product is available on the company website</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>insulin antibody from guinea pig</td>
			<td>Dako</td>
			<td>A0564</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucagon antibody from sheep</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab36215</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetylated tubulin antibody from mouse</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6793</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HuD/HuC antibody from mouse</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21271</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nitric oxide synthase (nNOS) antibody from rabbit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab106417</td>
			<td>5&#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>choline acetyltransferase (ChAT) from rabbit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab178850</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>seratonin (5HT) from rabbit</td>
			<td>Immunostar</td>
			<td>20080</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

raising the mexican tetra astyanax mexicanus for analysis of post-larval phenotypes and whole-mount immunohistochemistry

Astyanax mexicanus के नदी और गुफा-अनुकूलित आबादी आकृति विज्ञान, फिजियोलॉजी, और व्यवहार में अंतर दिखाएँ । वयस्क रूपों की तुलना पर ध्यान केंद्रित अनुसंधान इन मतभेदों में से कुछ के आनुवंशिक आधार से पता चला है । कम के बारे में जाना जाता है कि आबादी के बाद लार्वा चरणों में अलग (खिलाने की शुरुआत में) । इस तरह के अध्ययनों में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते है कैसे cavefish अपने प्राकृतिक वातावरण में वयस्कता के माध्यम से जीवित रहते हैं । प्रयोगशाला में लार्वा विकास के बाद की तुलना के लिए तरीके मानकीकृत जलीय कृषि और खिला शासन की आवश्यकता है । यहां हम वर्णन कैसे पोषक तत्वों की एक आहार पर मछली बढ़ाने के लिए गैर में-परिसंचारी पानी के लिए दो हफ्तों के बाद निषेचन के लिए जल rotifers । हम इस नर्सरी प्रणाली से पोस्ट-लार्वा मछली इकट्ठा करने और पूरे माउंट immunostaining प्रदर्शन करने के लिए कैसे प्रदर्शन करते हैं । Immunostaining एक mexicanusमें विकास और जीन समारोह की जांच के लिए transgene अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए एक आकर्षक विकल्प है । नर्सरी विधि भी वयस्कों में विकास के लिए घनत्व मिलान आबादी की स्थापना के लिए एक मानक प्रोटोकॉल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

1 तालिका प्रजनन सतह मछली और Tinaja, Molino, और स्थैतिक प्रजनन टैंक में Pachón cavefish के एक वर्ष के दौरान सफलता से पता चलता है । सतह और Pachón निषेचित भ्रूण के साथ अंडे हमेशा रची लार्वा का उत्पादन किया, जबकि Molino और Tinaja समय के कुछ असफल रहे थे (2/6 और 2/18 अंडे की घटनाओं रचा लार्वा का उत्पादन नहीं था, क्रमशः) । वहां क्लच आकार में भिंनता है कि जनक मछली की उंर के लिए जिंमेदार नहीं दिखाई देता है । 2 तालिका अंडे की घटनाओं में से कुछ के परिणामस्वरूप रचा लार्वा की कुल संख्या से पता चलता है, और माता पिता के मछली की उंर । सामांय में, हमने पाया है कि सतह मछली अंडे प्रति लार्वा की सबसे बड़ी संख्या का उत्पादन (औसत १,५५० ± ८९४, n = 5), Pachón द्वारा पीछा किया (औसत ८७९ ± ६८०, n = 6), Tinaja (औसत ५७० ± ३७३, एन = 11), और Molino (औसत ३८६ ± २७६, एन = 3) । आम तौर पर उत्पादित लार्वा की संख्या प्रति प्रयोग या वयस्कों में वृद्धि के लिए आवश्यक है । हम आम तौर पर 6-18 नर्सरी कंटेनरों (120-360 लार्वा) की स्थापना और शेष मछली euthanize ।
नर्सरी प्रोटोकॉल की सफलता को मापने के लिए हम रची लार्वा की संख्या दर्ज की और सफल बनाने की घटनाओं से पोस्ट-लार्वा मछली जीवित । 3 तालिका पुनर्संचारी टैंक में प्रजनन के 1 महीने से डेटा दिखाता है और नर्सरी कंटेनरों कि 14 dpf के लिए बच के लिए स्थानांतरित लार्वा की संख्या भी शामिल है । इस महीने के दौरान, जीवित रहने की दर 41-81 प्रतिशत से लेकर, प्रयोगों या वयस्कों में वृद्धि के लिए जनसंख्या प्रति उपलब्ध 65-293 मछली में जिसके परिणामस्वरूप ।
अगर पूरे माउंट immunostaining सफल होता है निर्धारित करने के लिए, हम माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ ही गर्मी उन लोगों के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ मशीन के नमूनों की प्रतिदीप्ति की तुलना में । फ्लोरोसेंट संकेत केवल प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ मशीन मछली में दिखाई दे रहा है । हम इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है सफलतापूर्वक ंयूरॉंस लेबल करने के लिए10 (चित्रा 1) और अग्नाशय कोशिकाओं6 चरणों में १२.५ dpf तक दोनों सतह और गुफा morphotypes में ।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58972/58972fig1.jpg"> चित्रा 1: न्यूरॉन लेबलिंग. पूरे-माउंट immunostaining of A. mexicanus. १२.५ dpf सतह मछली की छवि (क) और Pachón cavefish (ख) । मध्य शरीर क्षेत्र की छवि [रची पीली रूपरेखा में दिखाया (a) और (b)] सतह मछली की (c) और Pachón cavefish (d) दाग पैन के साथ-न्यूरॉनी एंटीबॉडी (हू). (ङ) सतह मछली आंत के एक क्षेत्र की फोकल छवि दर्जी न्यूरॉन्स दिखा (हू) और उनके अनुमानों (acetylated tubulin). इस छवि के लिए, आंत बाहर निकाल दिया गया था और नाभिक के दाग के लिए DAPI युक्त मध्यम में घुड़सवार । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58972/58972fig1large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>जनसंख्या</td>
			<td>प्रयास</td>
			<td>घटनाओं अंडे</td>
			<td>चंगुल</td>
		</tr>
<tr>
<td>सतह</td>
			<td>९४</td>
			<td>23</td>
			<td>23</td>
		</tr>
<tr>
<td>Molino</td>
			<td>११०</td>
			<td>6</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pachón</td>
			<td>१६७</td>
			<td>13</td>
			<td>13</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tinaja</td>
			<td>२४२</td>
			<td>18</td>
			<td>16</td>
		</tr>
</tbody></table>तालिका 1: प्रजनन के एक वर्ष से डेटा का सारांश A. स्थैतिक टैंक में mexicanus । प्रजनन प्रयासों की संख्या, जिसके परिणामस्वरूप अंडे की घटनाएँ होती हैं, और रची गई लार्वा का उत्पादन करने वाली घटनाओं की संख्या ।
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>जनसंख्या</td>
			<td>पैरेंट आयु</td>
			<td>ने रचा लार्वा</td>
		</tr>
<tr>
<td>सतह</td>
			<td>1 वर्ष</td>
			<td>९८९</td>
		</tr>
<tr>
<td>सतह</td>
			<td>1 वर्ष</td>
			<td>१०५०</td>
		</tr>
<tr>
<td>सतह</td>
			<td>3 साल</td>
			<td>२२१४</td>
		</tr>
<tr>
<td>सतह</td>
			<td>3 साल</td>
			<td>४३२</td>
		</tr>
<tr>
<td>सतह</td>
			<td>3 साल</td>
			<td>१७६८</td>
		</tr>
<tr>
<td>सतह</td>
			<td>4 साल</td>
			<td>२८५२</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pachón</td>
			<td>1 वर्ष</td>
			<td>११९४</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pachón</td>
			<td>1 वर्ष</td>
			<td>१९३३</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pachón</td>
			<td>१.५ साल</td>
			<td>३७१</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pachón</td>
			<td>3 साल</td>
			<td>४८०</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pachón</td>
			<td>4 साल</td>
			<td>११९०</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pachón</td>
			<td>4 साल</td>
			<td>११०</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tinaja</td>
			<td>9 महीने</td>
			<td>२५९</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tinaja</td>
			<td>9 महीने</td>
			<td>२५३</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tinaja</td>
			<td>10 महीने</td>
			<td>११००</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tinaja</td>
			<td>11 महीने</td>
			<td>८५७</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tinaja</td>
			<td>1 वर्ष</td>
			<td>७१३</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tinaja</td>
			<td>1 वर्ष</td>
			<td>८५३</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tinaja</td>
			<td>1 वर्ष</td>
			<td>५४२</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tinaja</td>
			<td>१.५ साल</td>
			<td>३६०</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tinaja</td>
			<td>१.५ साल</td>
			<td>५८</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tinaja</td>
			<td>१.५ साल</td>
			<td>११००</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tinaja</td>
			<td>4 साल</td>
			<td>१८५</td>
		</tr>
<tr>
<td>Molino</td>
			<td>२.५ साल</td>
			<td>४६०</td>
		</tr>
<tr>
<td>Molino</td>
			<td>२.५ साल</td>
			<td>६१९</td>
		</tr>
<tr>
<td>Molino</td>
			<td>3 साल</td>
			<td>८१</td>
		</tr>
</tbody></table>तालिका 2: अनुमानित महिला उंर और व्यक्ति के संकेत की आबादी से अंडे की घटनाओं से रची लार्वा की संख्या अ. mexicanus.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>जनसंख्या</td>
			<td>प्रयास</td>
			<td>घटनाओं अंडे</td>
			<td>चंगुल</td>
			<td>क्लच आकार</td>
			<td>नर्सरी कप में लार्वा स्थानांतरित</td>
			<td>पोस्ट-14dpf में लार्वा मछली</td>
			<td>अस्तित्व (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>सतह</td>
			<td>4</td>
			<td>3</td>
			<td>2</td>
			<td>५७६ & १७२८</td>
			<td>३६०</td>
			<td>१७४</td>
			<td>४८</td>
		</tr>
<tr>
<td>Molino</td>
			<td>4</td>
			<td>2</td>
			<td>1</td>
			<td>२२८</td>
			<td>१५९</td>
			<td>६५</td>
			<td>४१</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tinaja</td>
			<td>4</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>१९५२</td>
			<td>१७५</td>
			<td>९३</td>
			<td>५३</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pachón</td>
			<td>4</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>१६९६</td>
			<td>३६०</td>
			<td>२९३</td>
			<td>८१</td>
		</tr>
</tbody></table>तालिका 3: एक पुनर्संचारित प्रणाली में प्रजनन a. mexicanus के एक महीने से डेटा का सारांश और लार्वा जुटाने । प्रजनन प्रयासों की संख्या, परिणामस्वरूप अंडे की घटनाओं, चंगुल कि रची लार्वा का उत्पादन, प्रति क्लच लार्वा की औसत संख्या, लार्वा नर्सरी कंटेनरों में स्थानांतरित, और नर्सरी कंटेनरों में लार्वा मछली के बाद 14 दिनों के बाद मौजूद ।

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Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry

पोस्ट-लार्वा Phenotypes और पूरे-माउंट Immunohistochemistry के विश्लेषण के लिए मैक्सिकन टेट्रा Astyanax mexicanus स्थापना

इस प्रोटोकॉल में, हम प्रदर्शन कैसे Astyanax mexicanus वयस्कों नस्ल, लार्वा जुटाने के लिए, और पोस्ट-लार्वा मछली पर पूरे माउंट immunohistochemistry प्रदर्शन करने के लिए सतह और गुफा phenotypes की morphotypes तुलना करें ।

River and cave-adapted populations of Astyanax mexicanus show differences in morphology, physiology, and behavior. Research focused on comparing adult ...

यहां हम प्रदर्शित करते हैं कि मैक्सिकन टेट्रा अस्टायनेक्स मेक्सिकनस को कैसे नस्ल दिया जाए, लार्वा बढ़ाएं, और नदी और गुफा अनुकूलित मछली के फेनोटाइप की तुलना करने के लिए पोस्ट लार्वा मछली पर पूरे माउंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का प्रदर्शन करें। हम रोटीफर्स के पोषक तत्वों से भरपूर आहार पर मछली को एक ही घनत्व पर उठाते हैं। यह तकनीक लगातार विकास सुनिश्चित करती है और लागत, जैव सुरक्षा और पानी की गुणवत्ता में लाभ प्रदान करती है।शुरू करने के लिए, एक पांच गैलन टैंक के नीचे में एक प्लास्टिक की जाली रखें। इसके बाद टैंक को फिश रेडी पानी से भर दें। टैंक के किनारे एक वॉटर हीटर चिपकाएं।एक मादा और दो पुरुष Astyanax मैक्सिकन मछली जोड़ें जो टैंक में एक वर्ष से अधिक पुराने हैं। वाटर हीटर का तापमान 24 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें। 24 घंटे के बाद तापमान में एक डिग्री सेल्सियस की बढ़ोतरी करें।अंडे की जांच करने के लिए हर रोज टैंक के नीचे एक टॉर्च चमकें। एक बार प्रजनन टैंक में अंडे की पहचान हो जाने के बाद, वयस्क मछली और प्लास्टिक की जाली को हटा दें। पानी की गहराई को 10 सेमी तक कम करने के लिए बीकर का उपयोग करें।निषेचन के समय का अनुमान लगाने के लिए, एक स्थानांतरण पिपेट का उपयोग एक पेट्री डिश में कई अंडे रखने के लिए और उन्हें उनके चरण का निर्धारण करने के लिए स्टीरियो माइक्रोस्कोप के साथ देखें। अपारदर्शी अंडे या मल निकालें। इसके बाद टैंक को मछली के तैयार पानी से भरें और पानी में मेथिलीन ब्लू की सात बूंदें डालें।इसके बाद टैंक में हीटर और एक्वेरियम बबलर डालें। हीटर को 24 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें और बुलबुले की एक सौम्य धारा का उत्पादन करने के लिए एयरस्ट्रीम नियामक को समायोजित करें। फिर पानी का तापमान बनाए रखने के लिए टैंक को कवर करें।आठ लीटर मछली तैयार पानी में 20 ग्राम नमक डालें और इसे तब तक हिलाएं जब तक कि यह घुल न जाए। फिर प्रत्येक नर्सरी कंटेनर में तैयार पानी का एक लीटर जोड़ें। अगले प्रत्येक नर्सरी कंटेनर के लिए रची लार्वा के 20 स्थानांतरित करने के लिए एक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग करें।बड़े टैंक में पानी को हटकर करेंगे ताकि सभी लार्वा को हटाया जा सके। मछली के भोजन को तैयार करने के लिए, एक लीटर काटा रोटिफर्स में तीन मिलीलीटर शैवाल मिश्रण जोड़ें। निषेचन के पांच दिन बाद प्रत्येक नर्सरी कंटेनर में मछली के भोजन के तीन मिलीलीटर जोड़ें।रोटिसर्स को कंटेनरों के कोने पर घने समूहों में दिखाई देना चाहिए जब तक कि केंद्र के पास दिखाई न दें। हर रोज रोटिस्फर्स के लिए कंटेनर की जांच करें और एकाग्रता समाप्त होने पर अधिक भोजन जोड़ें। किसी भी मृत लार्वा को हटा दें।सबसे पहले, खाद्य सामग्री के गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट को साफ करने के लिए, नर्सरी कंटेनर को नायलॉन जाल छलनी के माध्यम से वांछित उम्र की मछली के साथ डालें। छलनी को साफ मछली तैयार पानी के साथ एक कंटेनर में रखें और 24 घंटे के लिए भोजन रोक दें। मछली को इच्छामृत्यु के बाद, संस्थागत दिशा-निर्देशों के अनुसार, मछली को शंकु नली में स्थानांतरित करने के लिए स्थानांतरण पिपेट का उपयोग करें।इच्छामृत्यु समाधान को स्थिर से बदलें। और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर कमाल के साथ ट्यूब इनक्यूबेट । इसके बाद फिक्सेटिव को हटाकर पीबीएएसटी से बदल दें।कमाल के साथ एक और 15 मिनट के लिए ट्यूब इनक्यूबेट। और वॉश प्रक्रिया को एक बार और दोहराएं। इसके बाद, एक स्क्रू टॉप कैप के साथ मछली को चार मिलीलीटर ग्लास शीशी में ले जाने के लिए ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करें।शीशी से पीबीएएसटी निकालें और तीन मिलीलीटर ब्लॉकिंग समाधान जोड़ें। कमाल के साथ एक घंटे के लिए कमरे के तापमान पर शीशी इनक्यूबेट। इसके बाद, अवरुद्ध समाधान को हटाने के लिए एक स्थानांतरण पिपेट का उपयोग करें और इसे ब्लॉकिंग समाधान में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ बदलें।आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर रात भर शीशी को इनक्यूबेट करें। इसके बाद, मछली को तीन बार पीबीएएसटी से धोएं, जैसा कि पहले वर्णित है। समाधान को अवरुद्ध करने में पतला माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ पीबीएएसटी को बदलें।और आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर रात भर शीशी इनक्यूबेट । अंत में, मछली को पीबीएएसटी के साथ 15 मिनट के लिए तीन बार धोएं। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, सतह मछली टीनाजा, मोलिनो और पाचन गुफा मछली स्थिर प्रजनन टैंकों में पैदा हुई थीं।सतह और पाचन अंडे, निषेचित भ्रूण के साथ, हमेशा रची लार्वा का उत्पादन किया । जबकि मोलिनो और टीनाजा कुछ समय असफल रहे। सामान्य तौर पर, सतह मछली ने प्रति अंडे लार्वा की सबसे बड़ी संख्या का उत्पादन किया, जिसके बाद क्रमशः पाचोन, तिनेजा और मोलिनो थे।पूरे माउंट इम्यूनोदाता तकनीक सफलतापूर्वक निषेचन के बाद १२.५ दिनों तक चरणों में न्यूरॉन्स और अग्नाशय की कोशिकाओं लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । किसी भी मृत मछली को हटाना महत्वपूर्ण है क्योंकि आप लार्वा उठाते हैं और जीवित मछली की संख्या रिकॉर्ड करते हैं। यदि कई मछलियों की मृत्यु हो जाती है तो यह बैक्टीरियल या फंगल संदूषण के कारण हो सकता है।उपयोग से पहले टैंकों को 70% इथेनॉल के साथ निष्फल किया जाना चाहिए। इम्यूनोदात तकनीक हमने वर्णित सामग्री तालिका में सूचीबद्ध एंटीबॉडी के लिए सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है। इम्यूनोदाता के बाद, मछली को ब्याज के किसी भी ऊतक को देखने के लिए पूरी तरह से घुड़सवार या अनुभागित किया जा सकता है।संयोजन में, प्रजनन, हैचिंग और इम्यूनोस्टेपिंग प्रक्रिया प्रयोगशालाओं के बीच तुलनीय तरीके से जीन गतिविधि NC2 का आकलन करने के लिए एक मजबूत तरीका प्रदान करती है।

Research

JoVE Journal

Genetics

Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry

The Use of Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

The Use of Induced Somatic Sector Analysis ISSA for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

जीन और प्रमोटरों लकड़ी संरचना और माध्यमिक स्टेम विकास में शामिल अध्ययन के लिए प्रेरित दैहिक क्षेत्र के विश्लेषण (आईएसएसए) का प्रयोग करें

Secondary stem growth in trees and associated wood formation are significant both from biological and commercial perspectives. However, relatively little ...

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

बैक्टीरियल संयुग्मन में शामिल स्थानांतरण प्रोटीन के अनुक्रम विशिष्ट विश्लेषण के लिए संयुग्मी संभोग Assays

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

परिवेश पार्टिकुलेट मैटर प्रेरित गुणसूत्र aberrations के विश्लेषण से एक का उपयोग<em&gt; इन विट्रो</em&gt; सिस्टम

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes

क्रोमेटिन को संशोधित करने के थोक क्रोमेटिन बाइंडिंग गुणों के विश्लेषण के लिए अनुक्रमिक नमक निकालने के परिसरों

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous ...

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

क्रोमैटिन इम्युनोपर्रेबिज़ का उपयोग करने वाली सी-केट लिगेंड प्रमोटर का विश्लेषण

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Nucleosome घनत्व विश्लेषण के लिए देशी क्रोमेटिन Immunoprecipitation अनुक्रमण पुस्तकालयों की पीढ़ी

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

डीएनए संशोधनों के लिए Immunostaining: फोकल छवियों की गणना विश्लेषण

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

क्रोमेटिन के लिए माउस Oocyte प्रगति के विश्लेषण के लिए प्रसार की तैयारी Metaphase द्वितीय के लिए चरण से

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

वास्तविक समय प्रतिलेखन कारक बंधन, प्रतिलेखन, अनुवाद, और कारोबार सेलुलर सक्रियण के दौरान वैश्विक घटनाओं को प्रदर्शित करने के लिए विश्लेषण

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...