Name: primary cell culture of purified gabaergic or glutamatergic neurons established through fluorescence-activated cell sorting
Uploaded: 2019-06-06T13:00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting at JoVE.com

ويود أصحاب البلاغ ان يشكروا الدعم التقني الممتاز الذي قدمته جيني كيرش وانا تييشمولر في المرفق الأساسي لقياس التدفق الخلوي ، وهو المركز ألماني ريكوما-فورشونغزنتروم ، برلين. ونود ان نشكر جي سونغ علي مساعدته في تحليل البقاء علي قيد الحياة. ونود أيضا ان نشكر ريتا لورييرو علي مساعدتها في التقاط صور الفئران الفلورية وكريستيان ابنر للقراءة الناقدة للبروتوكول. وقد ولدت الفئران VGAT-فينوس المحورة وراثيا من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الفسيولوجية ، اوكازاكي ، m. هيباياشي و y. كاواجوتشي في معهد العلوم الفيزيولوجية ، Okazaki ، اليابان ، وذلك باستخدام pCS2 الزهرة التي قدمها الدكتور ا. مياواكي. ساندت هذا عمل كان بالمانيه بحث مجلس ([ديوتسكه] [فورسكهنغجيميندسكهفت], [دغ] [اكسك] 257 إلى [ايف]).

<ol>
	<li>Radcliff, G., Jaroszeski, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basics+of+flow+cytometry.">Basics of flow cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 91, 1-24 (1998).</li><li>Feher, K., Kirsch, J., Radbruch, A., Chang, H. D., Kaiser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+population+identification+using+fluorescence-minus-one+controls+with+a+one-class+classifying+algorithm.">Cell population identification using fluorescence-minus-one controls with a one-class classifying algorithm.</a> Bioinformatics. 30 (23), 3372-3378 (2014).</li><li>Sergent-Tanguy, S., Chagneau, C., Neveu, I., Naveilhan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+activated+cell+sorting+(FACS):+a+rapid+and+reliable+method+to+estimate+the+number+of+neurons+in+a+mixed+population.">Fluorescent activated cell sorting (FACS): a rapid and reliable method to estimate the number of neurons in a mixed population.</a> Journal of Neuroscience Methods. 129 (1), 73-79 (2003).</li><li>Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+basic+principles+and+applications.">Flow cytometry: basic principles and applications.</a> Critical Reviews in Biotechnology. 37 (2), 163-176 (2017).</li><li>Guez-Barber, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+purification+of+immunolabeled+cell+types+from+adult+rat+brain.">FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 203 (1), 10-18 (2012).</li><li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).</li><li>Turko, P., Groberman, K., Browa, F., Cobb, S., Vida, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Dependence+of+GABAergic+and+Glutamatergic+Neurons+on+Glia+for+the+Establishment+of+Synaptic+Transmission.">Differential Dependence of GABAergic and Glutamatergic Neurons on Glia for the Establishment of Synaptic Transmission.</a> Cerebral Cortex. , (2018).</li><li>Uematsu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+chemical+composition+of+cortical+gabaergic+neurons+revealed+in+transgenic+venus-expressing+rats.">Quantitative chemical composition of cortical gabaergic neurons revealed in transgenic venus-expressing rats.</a> Cerebral Cortex. 18, 315-330 (2008).</li><li>Goebbels, S., Bormuth, I., Bode, U., Hermanson, O., Schwab, M. H., Nave, K. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+targeting+of+principal+neurons+in+neocortex+and+hippocampus+of+NEX-Cre+mice.">Genetic targeting of principal neurons in neocortex and hippocampus of NEX-Cre mice.</a> Genesis. 44, 611-621 (2006).</li><li>Banker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trophic+interactions+between+astroglial+cells+and+hippocampal+neurons+in+culture.">Trophic interactions between astroglial cells and hippocampal neurons in culture.</a> Science. 209, 809-810 (1980).</li><li>Lindsay, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+rat+brain+astrocytes+support+survival+of+both+NGF-dependent+and+NGF-insensitive+neurones.">Adult rat brain astrocytes support survival of both NGF-dependent and NGF-insensitive neurones.</a> Nature. 282 (5734), 80-82 (1979).</li><li>Geissler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+hippocampal+neurons,+which+lack+four+crucial+extracellular+matrix+molecules,+display+abnormalities+of+synaptic+structure+and+function+and+severe+deficits+in+perineuronal+net+formation.">Primary hippocampal neurons, which lack four crucial extracellular matrix molecules, display abnormalities of synaptic structure and function and severe deficits in perineuronal net formation.</a> Journal of Neuroscience. 33 (18), 7742-7755 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labeling+of+both+gabaergicand+glycinergic+neurons+in+vesicular+GABA+transporter+(VGAT)-venus+transgenic+mouse.">Fluorescent labeling of both gabaergicand glycinergic neurons in vesicular GABA transporter (VGAT)-venus transgenic mouse.</a> Neuroscience. 164 (3), 1031-1043 (2009).</li><li>H&#246;ltje, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Rho+gtpasein+astrocyte+morphology+and+migratory+response+during+in+vitro+wound+healing.">Role of Rho gtpasein astrocyte morphology and migratory response during in vitro wound healing.</a> Journal of Neurochemistry. 95 (5), 1237-1248 (2005).</li><li>Booker, S. A., Song, J., Vida, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+Patch-clamp+Recordings+from+Morphologically-+and+Neurochemically-identified+Hippocampal+Interneurons.">Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons.</a> Journal of Visualized Experiments. , e51706 (2014).</li><li>Pfrieger, F. W., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+efficacy+enhanced+by+glial+cells+in+vitro.">Synaptic efficacy enhanced by glial cells in vitro.</a> Science. 277 (5332), 1684-1687 (1997).</li><li>Ullian, E. M., Sapperstein, S. K., Christopherson, K. S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+synapse+number+by+glia.">Control of synapse number by glia.</a> Science. 291, 657-661 (2001).</li><li>Christopherson, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombospondins+are+astrocyte-secreted+proteins+that+promote+CNS+synaptogenesis.">Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis.</a> Cell. 120, 421-433 (2005).</li><li>Berghuis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-derived+neurotrophic+factor+controls+functional+differentiation+and+microcircuit+formation+of+selectively+isolated+fast-spiking+gabaergic+interneurons.">Brain-derived neurotrophic factor controls functional differentiation and microcircuit formation of selectively isolated fast-spiking gabaergic interneurons.</a> European Journal of Neuroscience. 20 (5), 1290-1306 (2004).</li><li>Liddelow, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+microglia+induce+neurotoxic+reactive+astrocytes+via+Il-1&#945;,+tnf&#945;,+and+c1q.">Activated microglia induce neurotoxic reactive astrocytes via Il-1&#945;, tnf&#945;, and c1q.</a> Nature. 541, 481-487 (2017).</li><li>Tomlinson, M. J., Tomlinson, S., Yang, X. B., Kirkham, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+separation:+Terminology+and+practical+considerations.">Cell separation: Terminology and practical considerations.</a> Journal of Tissue Engineering. 4, (2013).</li><li>Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+survival+of+hippocampal+neurons+in+B27-supplemented+Neurobasal,+a+new+serum-free+medium+combination.">Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination.</a> Journal of Neuroscience Research. 35 (5), 567-576 (1993).</li></ol>

ويعلن صاحبا البلاغ انهما لا يملكان مصالح مالية متنافسة.

ونحن هنا وصف الطريقة التي تجمع بين فرز وذبح الخلايا العصبية الاساسيه لتوليد الخلايا العصبية النقية الثقافات. هذا الأسلوب يستغرق حوالي 1 ساعة أطول من بروتوكول ثقافة الخلايا العصبية منفصلة الاساسيه النموذجية حتى الآن يسمح لتوليد مئات من الثقافات النسخ المتماثل التي تحتوي علي أنواع معينه من الخلايا العصبية. الخلايا العصبية المنقية ، والتي يمكن زراعتها في عزله لمده 16 يوما علي الأقل ، وتوسيع محاور و تشعبات ويمكن إطلاق القطارات المتكررة من إمكانات العمل (الشكل 2 والشكل 3). والاهم من ذلك ، ان هذه الخلايا قابله لنفس التحاليل التجريبية مثل الثقافات العصبية الاساسيه المنفصلة ، بما في ذلك التحاليل الكهربية والمورفولوجية والبقاء. ومن الفوائد الرئيسية للعمل مع هذه الثقافات المنقية ان تطوير أنواع معينه من الخلايا يمكن دراسته في عزله. لدعم تطوير الثقافات المنقية ، ونحن نقدم أيضا بروتوكول لمشاركه الخلايا العصبية المنقية مع الخلية المنزلقة. كما هو مبين سابقا ، المشتركة في الخلايا العصبية المنقية مع الكريات الطائرات الشراعية يحسن البقاء علي قيد الحياة ، والنمو ، ويمكن تعزيز تكوين شبكه7 (الشكل 4). التالي ، فاننا نقدم هنا مجموعه من الأساليب التي ينبغي ان تعزز دراسة تفاعلات الخلايا العصبية غير الخلوية ، وقد تكون مفيده لدراسة التنمية والتفاعل بين أنواع الخلية الأخرى من الفائدة.
وقد كشفت الدراسات حول ثقافات الخلايا العصبية جلوتاميرجيك المنقي الرؤى الاساسيه في الطريقة التي تفرزها خليه الدال العوامل التي تعزز تطوير الشبكات العصبية وتكوين المشبك16,17,18 . بشكل عام, وقد تم تطبيق أساليب لتنقيه أنواع الخلايا العصبية محدده بنجاح أكبر لدراسة تطور الخلايا العصبية جلوتاموجيك بدلا من الخلايا العصبية جابايرجيك. وقد ادي ذلك إلى تفاوت في فهمنا لكيفيه تطور هذين النوعين من الخلايا. النظر إلى ان جابايرجيك والخلايا العصبية جلوتاموجيك تختلف بشكل كبير من حيث التشريح, علم وظائف الجسم وأصول النمو, فمن المهم ان ندرس الخلايا العصبية جابايرجيك في حقهم الخاص, لفهم أفضل وظائفهم ووظائفهم. باستخدام البروتوكول المعروض هنا ، وقد حددنا سابقا الاختلافات الهامه في الطريقة جابايرجيك والخلايا العصبية جلوتاموجيك تعتمد علي العوامل التي تفرزها الخلايا التي يفرزها لإنشاء الإرسال متشابك7. من خلال نشر هذا البروتوكول نامل ان الآخرين يمكن ان تجعل المزيد من الرؤى في التفاعلات الهامه بين الخلايا العصبية والكريات الدبقيه.
في هذا البروتوكول ، ونحن وصف تدفق الخلوي علي أساس طريقه فرز الخلايا ، والتي استخدمناها لتنقيه جابايرجيك أو الخلايا العصبية جلوتاموجيك من خطوط القوارض المحورة وراثيا مختلفه. تم فرز الخلايا العصبية الزهرة الايجابيه جابايرجيك من VGAT فينوس الفئران13 أو الفئران8 و tdtomato ايجابيه جلوتاماماتيك الخلايا العصبية تم فرزها من nexcre. Ai9 الفئران (ولدت أصلا من NexCre9 و Ai9 مراسل الخطوط6، انظر توركو وآخرون ، 20187). في السنوات الاخيره ، وبسبب التطورات التكنولوجية ، أصبح جيل الكائنات المحورة وراثيا أسهل بكثير. وعلي هذا النحو ، فان توافر الكائنات التي تعبر عن جزيئات الفلورسنت ، في العديد من أنواع الخلايا المختلفة ، قد نما بسرعة. وقد ادي هذا ، بدوره ، إلى زيادة استخدام وتطبيق فرز الخلايا المنشطة الفلورية. في حين توجد الطرق البديلة لعزل خلايا الفائدة حاليا16،19،20، فانها تعرقل إلى حد ما باعتمادها علي توافر الأجسام المضادة المناسبة للسطح الذي يحدث بشكل طبيعي مستضدات. وهذا يحد من تنوعها بالمقارنة مع طرق فرز الخلايا المستندة إلى الفلورية ، والتي يمكن استخدامها بالفعل لفرز الخلايا من العديد من الخلايا الخاصة بالمراسلات المعدلة وراثيا والمتوفرة بالفعل. ومع ذلك ، عندما الأمثل ، وطرق الفرز المستندة إلى الأجسام المضادة يمكن ان تكون سريعة وعاليه الغلة ، وربما أفضل الحفاظ علي تشريح الخلية ، من خلال السماح تنقيه الخلايا مع محاور والتشعبات سليمه21. ولذلك ينبغي النظر في أساليب فرز الأجسام المضادة عند اتخاذ قرار بشان استراتيجية الفرز. وفي نهاية المطاف ، فان نوع الخلية من الفائدة ، والعمر الذي يتم فيه فرز الخلايا ، وتوافر الكائنات المحورة وراثيا أو المستضدات السطحية وعدد الخلايا اللازمة سيكون العوامل الحاسمة عند اختيار استراتيجية الفرز الأنسب.
علي الرغم من ان الفرز الخلوي القائم علي الفلورية هو طريقه بسيطه وقابله للتكرار لتنقيه الخلايا ، ينبغي توخي الحذر اثناء خطوات معينه من البروتوكول للحفاظ علي جوده الخلية. علي سبيل المثال ، بعد كل خطوه طرده ، من المهم التاكد من أعاده تعليق الخلية بيليه بأسرع وقت ممكن وان الخلايا قد تم استردادها بنجاح. في بعض الأحيان ، يمكن ان يزعج بيليه الخلية عند أزاله supernatant. ولذلك ينصح ، بين الخطوات الطردة ، للتحقق من وجود خلايا تحت المجهر لاستبعاد اي فقدان الخلايا واسعه النطاق. بعد طلاء الخلايا ، يجب السماح للخلايا بالتصاق ب 1 ساعة علي الأقل قبل الرضاعة. إذا تم تغذيه الخلايا في وقت مبكر جدا ، قد تصبح بعض الخلايا طردت من الشفة ، التالي الحد من كثافة الثقافة. بعد 1 ح في الثقافة ، فمن الحكمة لتقييم صحة الخلية. إذا كانت الخلايا لا تظهر بصحة جيده (يظهر مثال للخلايا السليمة في الشكل 2 ا) ، أو ان هناك موتا كبيرا للخلايا ، فقد يكون هذا مؤشرا علي وجود مشكله اثناء اجراء التفكك أو الفرز. وهناك اعتبار آخر مهم ، عند زراعه اي نوع من الخلايا ، هو ان تاخذ الرعاية عند أداره وسائل الاعلام الثقافة الخلية. الدوري الأميركي للمحترفين وسائل الاعلام يحتوي علي الفينول الأحمر ، الذي يعمل كمؤشر الأس الهيدروجيني22. إذا أصبحت الوسائط صفراء جدا في اللون ، فهذا يشير إلى ان درجه الحموضة حمضيه جدا. إذا أصبحت الوسائط ورديه جدا ، فهذا يشير إلى ان الحل قلوي جدا. حلول الأسهم مفتوحة لفترات طويلة ، وخاصه وسائل الاعلام المنقولة إلى أنابيب مخروطيه ، تميل إلى ان تصبح أكثر قلوية مع مرور الوقت. ولذلك فمن المستحسن ان تشكل وسائل الاعلام الجديدة كامله الدوري الأميركي للمحترفين كل أسبوع ووسائل الاعلام كامله كل أسبوعين (المخازن المؤقتة المتوسطة في ظروف الغلاف الجوي ، وينبغي بالتالي ان تكون أكثر استقرارا). أخذ هذه النقاط في الاعتبار انه ينبغي ان يكون من الممكن إنشاء الخلايا المنقية الثقافات في اي مختبر مع الوصول إلى فرز الخلايا ومعدات ثقافة الخلية.
في معظم تجاربنا أنتجنا الثقافات النقية من الحيوانية واحده. ومع ذلك ، عند تنقيه الخلايا للتحليلات البيوكيميائية ، قد يكون من الضروري تجميع العديد من الكائنات معا للفرز. لقد نجحنا في فرز ما يصل إلى 8 فئران جنينيه (اليوم الجنيني 13 الحيوانية) باستخدام البروتوكول المذكور أعلاه (البيانات غير معروضه). ومع ذلك ، إذا كان من المقرر فرز المزيد من الماشية ، فقد يكون من الضروري زيادة حجم كل من الحلول الورقية والصربية (الموصوفة في الخطوات 2-1-1-2-1-4) لاستيعاب الزيادة في كميه الانسجه. بالاضافه إلى ذلك ، إذا تم طلاء المزيد من الخلايا في الثقافة ، ثم قد يكون هناك حاجه إلى جدول التغذية أكثر تواترا. كنقطه انطلاق ، يمكن تغذيه الخلايا كل 7 أيام عن طريق أزاله 100 μL من وسائل الاعلام المكيفة وأضافه 200 μL من وسائل الاعلام الجديدة كامله الدوري الأميركي للمحترفين. من أجل بقاء الخلايا العصبية ، وإذا فرز المزيد من الماشية ، وينبغي إعطاء الفكر للتقليل من وقت الفرز قدر الإمكان. وهذا يتطلب في كثير من الأحيان الأمثل الدقيق للتحليلات المصب للاستخدام الفعال للخلايا المنقية. لقد قمنا بفرز بشكل روتيني الخلايا العصبية الماوس بمعدلات 600 الاحداث/s ، ما يصل إلى 500000-800000 خليه لكل الحيوانية (يوم بعد الولادة 0-2). ومع ذلك ، كان هذا دون الأمثل شامله لسرعه الفرز والظروف. ولذلك ، ينبغي ان يكون من الممكن إدخال مزيد من التحسينات علي سرعه الفرز والغلة.
تتطلب الخلايا العصبية المنقية وسائل الاعلام المكيفة لبقاءها. وقد ثبت هذا من قبل من قبل الخلايا العصبية والكريات الطائرات الشراعية بشكل منفصل ، وقبل علاج العصبونات مع وسائل الاعلام المكيفة المنزلقة10. في تجاربنا ، اخترنا لدعم الخلايا العصبية المنقية عن طريق القيام بالزراعات الخلوية السطحية علي ادراج الخلية شبه نفاذيه ، والتي يتم وضعها داخل لوحه ثقافة الخلية. وقد تم تطبيق هذه الطريقة بنجاح لدراسة البروتينات المشتقة من الخلايا غير الخلوية وتفاعلها مع الخلايا العصبية12. عدم الاتصال ، ولكن الدعم المستمر المقدمة من هذا الأسلوب لديه عدد من المزايا بالمقارنة مع ثقافة منفصلة من الخلايا. وعلي الأخص ، فان الثقافة المشتركة للخلايا الددميه مع الخلايا العصبية تسمح للتنظيم المستمر وتكييف وسائل الاعلام الثقافة الخلية ، والتي تشبه بشكل وثيق في حاله الجسم الحي. الاضافه إلى ذلك ، فان الثقافة المشتركة المستمرة للخلايا تسمح بإشارات التغذية المرتدة المحتملة بين الخلايا العصبية والبقية ، وهو أمر غير ممكن في الثقافات المنفصلة. في البروتوكول الخاص بنا ، إذا لزم الأمر ، يمكن بسهوله حذف طريقه الثقافة المشتركة المستمرة ويمكن اجراء العلاج الكلاسيكي من الخلايا العصبية مع وسائل الاعلام المكيفة.
وباختصار ، يهدف البروتوكول المعروض هنا إلى تزويد القارئ بأساس متين يمكنه من خلاله تاسيس تجاربه الخاصة الخاصة بثقافة الخلايا المنقية. ونتوقع ان يستمر توافر الكائنات المحورة وراثيا والتركيبات الفيروسية في الزيادة في المستقبل المنظور. ولذلك ، فان تقنيات فرز الخلايا استنادا إلى الفلورية من المرجح ان تصبح أكثر استخداما وقيمه.

فرز الخلايا هو أداه قويه لعزل الخلايا الحية من الفائدة من خليط غير متجانس من الخلايا. يمكن فرز الخلايا استنادا إلى معايير الحجم والشكل ، فضلا عن التعبير عن علامات الفلورسنت1،2. في كثير من الأحيان ، تستخدم الأجسام المضادة المترافقة بالفلور لتسميه أنواع الخلايا المتميزة عن طريق استهداف مستضدات السطح الخاصة بالخلايا3،4. وبدلا من ذلك ، تم تصميم الكائنات المحورة وراثيا أو منظومات الإيصال الفيروسية للتعبير عن الفلوبوريس ببموجب المروجين الخاصين بالخلايا5،6. تاريخيا ، كان تطوير الاداات المحورة وراثيا والحيوانية مكلفه ومضيعه للوقت. وفي الاونه الاخيره ، ادي تناقص التكاليف وقله الصعوبات التقنية إلى زيادة هائله في عدد خطوط المراسلين المتاحة. وبما ان توافر الاداات المحورة وراثيا والحيوانية المراسلة لا يزال ينمو ، فانه ينبغي أيضا فائده وامكانيه تطبيق أساليب فرز الخلايا القائمة علي الفلورية.
وقد أثبتنا مؤخرا ان فرز الخلايا من الكائنات المحورة وراثيا يمكن تطبيقه بشكل روتيني لتنقيه الخلايا العصبية الاوليه استعدادا لثقافة الخلية7. عن طريق فرز الخلايا من الفئران أو الفئران, كنا قادرين علي عزل والثقافة الخلايا العصبية الفلورسنت, التي تعبر عن البروتينات الفلورية مراسل علي وجه التحديد في اما جابايرجيك أو الخلايا العصبية جلوتامريجيك6,8,9. من خلال دراسة هذه الثقافات العصبية المنقية, كنا قادرين علي تحديد فرق مهم في الطريقة جابايرجيك والخلايا العصبية جلوتاموجيك تعتمد علي العوامل التي تفرزها الخلايا التي يفرزها لإنشاء الإرسال متشابك7. بالاضافه إلى ذلك ، من خلال المشاركة في الخلايا الددميه مع العصبية المنقية ، تمكنا من تمديد الملاحظات السابقة التي تثبت الدور الحاسم الذي تلعبه الخلايا الددميه في نمو وبقاء العصبونات10،11. وهكذا ، من خلال مزيج من خليه الفرز وثقافة الخلية ، تمكنا من دراسة ليس فقط تطوير أنواع معينه من الخلايا العصبية في عزله ، ولكن كانت قادره علي التحقيق في تاثير الكريات الدبقيه علي وظيفتها.
نحن نقدم هنا بروتوكولا لتنقيه وثقافة الخلايا العصبية جابايرجيك و جلوتاميرجيك من القشرة والحصين من الفئران المحورة وراثيا أو الفئران. ونحن نقدم أيضا طريقه لعدم الاتصال الثقافة المشتركة للخلايا العصبية المنقية والخلايا الدليج ، وتكييفها من جيسسلر وآخرون12. من أجل توليد الثقافات جابايرجيك المنقية ، قمنا بفرز الخلايا العصبية الفلورية من VGAT-فينوس-والفئران Wistar8 أو vgat-فينوس الفئران13، والتي تعبر بشكل انتقائي عن تعزيز البديل البروتين الفلوري الأصفر (فينوس) في > 95 ٪ من الخلايا العصبية جابايرجيك القشرية. لتوليد الثقافات جلوتاميرجيك المنقية ، قمنا بفرز الخلايا العصبية الفلورية من NexCre. Ai9 الفئران6،9، والتي تعبر عن tdtomato في الخلايا العصبية القشرية جلوتاميرجيك. يمكن اجراء الفرز والثقافة بأكملها في غضون 3-4 h ويمكن استخدامها لتوليد مئات من الثقافات تكرار مناسبه للتحليل الكهربي ، المورفولوجية وبقاء الخلية. طريقه بسيطه وقابله للتكرار ويمكن ان تنتج الثقافات العصبية المنقية التي هي أكبر من 97 ٪ نقيه لنوع الخلية من الفائدة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Neural Basal A media (NBA)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10888022</td>
			<td>Cell Culture Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17504001</td>
			<td>Culture supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>35050-038</td>
			<td>Culture supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P1399</td>
			<td>Coverslip coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P4762-1G</td>
			<td>Enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A3294-100G</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hibernate A low fluorescence media</td>
			<td>Brain Bits Ltd</td>
			<td>HALF</td>
			<td>Cell Transport media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM)</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>F0435</td>
			<td>Glial Culture Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>S0115</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin / EDTA</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L2163</td>
			<td>Enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Tip Pasteur Pipette</td>
			<td>Neo Labs</td>
			<td>-</td>
			<td>Used for trituration of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>BD</td>
			<td>353047</td>
			<td>Culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>352070</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>352096</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips: 12 mm round</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P231.1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353001</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 &#181;m CellTrics Cell Sieve</td>
			<td>sysmex</td>
			<td>04-004-2326</td>
			<td>To remove cell clumps before cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottom polystyrene tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>352054</td>
			<td>Transport tube for sorted cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottom polypropylyne tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>352063</td>
			<td>Collection tube for sorted cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture inserts &#8211; 0.4 &#181;m transparent PET</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353 095</td>
			<td>For the co-culture of neurons and glia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra fine Bonn Scissors</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>14084-08</td>
			<td>To remove overlying skin and bone of mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra narrow Scissors</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>14088-10</td>
			<td>To remove overlying skin and bone of rats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>11242-40</td>
			<td>To hold the head in place</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula (130 mm long / 5 mm tip width)</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>3006.1</td>
			<td>To remove the brain to filter paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blades</td>
			<td>Swan-Morton</td>
			<td>#0308</td>
			<td>To mechanically dissociate neural tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemocytometer (Neubauer Imroved)</td>
			<td>Optik Labor</td>
			<td>-</td>
			<td>To cell count dissociated cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Miners Goggles (excitation light)</td>
			<td>Biological Laboratory Equipment 
			Maintenance and Servce Ltd (BLS)</td>
			<td>FHS/LS-1G</td>
			<td>To excite TdTomato</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Miners Goggles (emission filter)</td>
			<td>Biological Laboratory Equipment 
			Maintenance and Servce Ltd (BLS)</td>
			<td>FHS/EF-4R2</td>
			<td>Td Tomato compatible emission filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Miners Goggles (excitation light)</td>
			<td>Biological Laboratory Equipment 
			Maintenance and Servce Ltd (BLS)</td>
			<td>FS/ULS-02B2</td>
			<td>To excite Venus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Miners Goggles (emission filter)</td>
			<td>Biological Laboratory Equipment 
			Maintenance and Servce Ltd (BLS)</td>
			<td>FS/TEF-3GY1</td>
			<td>Venus compatible emission filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse-Anti-GFP primary antibodies</td>
			<td>UC Davis</td>
			<td>75-132</td>
			<td>To enhance Venus signal following fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse-Anti-GFAP primary antibodies</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G-3893</td>
			<td>The identification of reactive astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit-Anti-CD11b primary antibodies</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>1561-15</td>
			<td>The identification of microglial cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit-Anti-MBP primary antibodies</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB980</td>
			<td>The identification of oligodendrocyes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary cell culture of purified gabaergic or glutamatergic neurons established through fluorescence-activated cell sorting

الهدف العام لهذا البروتوكول هو توليد الثقافات العصبية المنقية المستمدة من الخلايا العصبية جابايرجيك أو جلوتاموجيك. يمكن ان تكون مثقف الخلايا العصبية المنقية في وسائل الاعلام المحددة لمده 16 يوما في المختبر وقابله لأي تحليلات تجري عاده علي الثقافات المنفصلة ، بما في ذلك التحاليل الفسيولوجية والمورفولوجية والبقاء علي قيد الحياة. والميزة الرئيسية لهذه الثقافات هي ان أنواعا معينه من الخلايا يمكن دراستها بشكل انتقائي في غياب التاثيرات الخارجية المعقدة ، مثل تلك الناشئة عن الخلايا الدبقيه أو أنواع عصبيه أخرى. عند التخطيط للتجارب مع الخلايا المنقية ، ومع ذلك ، من المهم ان نلاحظ ان الخلايا العصبية تعتمد بقوة علي وسائل الاعلام المكيفة لنموها والبقاء علي قيد الحياة. الاضافه إلى ذلك ، تعتمد الخلايا العصبية الجلوتاماليه علي العوامل التي تفرزها الخلايا غير المشبعة لإنشاء ناقل الحركة المتشابك. ولذلك ، فاننا نقوم أيضا بوصف طريقه لمشاركه الخلايا العصبية والكريات الداليه في ترتيب عدم الاتصال. باستخدام هذه الطرق ، وقد حددنا الاختلافات الرئيسية بين تطوير الشبكات العصبية جابايرجيك والخلايا الجلوتاموجيك. التالي ، دراسة ثقافات الخلايا العصبية المنقية لديها إمكانات كبيره لتعزيز فهمنا لكيفيه تطور الجهاز العصبي ووظائفه. وعلاوة علي ذلك ، قد تكون الثقافات المنقية مفيده للتحقيق في العمل المباشر للعوامل الدوائية ، وعوامل النمو أو لاستكشاف عواقب التلاعب الجيني علي أنواع معينه من الخلايا. بما ان المزيد والمزيد من الكائنات المحورة وراثيا تصبح متاحه ، ووصف أنواع اضافيه من الخلايا المحددة من الفائدة ، ونحن نتوقع ان البروتوكولات الموصوفة هنا سوف تنمو في تطبيقها وإمكاناتها.

ويمكن اجراء التفكك وفرز الخلايا من الخلايا العصبية الفلورية من الماوس المحورة وراثيا أو الفئران cortico-هيبوكامبال الانسجه في ما يقرب من 3-4 ح. والنتيجة هي السكان من الخلايا العصبية الفلورية النقية للغاية ، والتي يمكن زراعتها في الثقافة لمده 16 يوما.
لتوليد الثقافات النقية ، تم تحديد الحيوانية المحورة وراثيا لأول مره باستخدام مصباح الفلورسنت مع مجموعات مرشح المناسبة (أمثله من النيون الوليد VGAT فينوس و NexCre ؛ وتظهر الجراء Ai9 الفار في الشكل 1A). بعد التعرف علي الكائنات المحورة وراثيا ، تم فصل الانسجه التي تم تشريحها ، وتم فرز الخلايا العصبية الفلورية الأكثر قوه لإنتاج الخلايا المنقية. مثال كثافة القطع الفلورية لنقطه NexCre ؛ يتم عرض Ai9 و VGAT فينوس الخلايا العصبية الماوس ، التي تم الحصول عليها خلال FACS ، في الشكل 1B. عندما الأمثل ، فمن الممكن لحصاد بين 500,000 و 800,000 الخلايا من القشرة والحصين من P0 NexCre الفردية ؛ Ai9 أو VGAT فينوس الفئران. يمكن فرز الخلايا بسرعة اعلي من 600 احداث/ق. وأجريت تقديرات لنقاء الخلايا باستخدام DAPI كعلامة نوويه (الشكل 1 ج). عن طريق فرز الخلايا الايجابيه بقوة ، ويمكن تحقيق نقاء أكثر من 97 ٪ بشكل روتيني7.
بعد الفرز الناجح ، يجب ان تظهر الخلايا العصبية مطلي الجولة في الشكل ، لديها غشاء أملس ، وينبغي ان ينظر إلى تنبت العصب بعد حوالي 1 ح في المختبر (الشكل 2A، B). وبحلول 7 أيام في المختبر ، علي الرغم من ان بعض موت الخلايا قد يكون ظاهرا ، ينبغي ان تكون الخلايا القابلة للحياة موجودة في جميع الظروف الثقافية (الشكل 2 ج، د). في 12-16 يوما في المختبر ، وذلك باستخدام كامل خليه التصحيح المشبك التسجيلات والبيتا-ملء15، فمن الممكن للتحقيق في التطوير المورفولوجية والكهربية من الخلايا العصبية المنقية (الشكل 3). تحليل الثقافات المنقية يكشف ان كلا من الخلايا العصبية جلوتاموجيك وجابايرجيك كانت قادره علي توسيع محاور و تشعبات من أجسادهم الخلية (الشكل 3a، B) والاحتفاظ بالقدرة علي توليد إمكانات العمل استجابه الحقن بالاستقطاب الحالي (الشكل 3 ج، د). ومن الجدير بالذكر, ومع ذلك, بعد تنقيه, فقط تلقت الخلايا العصبية جابايرجيك كميات كبيره من ناقل الحركة التلقائي متشابك, والخلايا العصبية جلوتاموجيك تلقي القليل جدا من انتقال متشابك في غياب الخلية الداليه (الشكل 3E ، واو) 7-
كما ذكرنا سابقا ، الخلايا في الثقافات المنقية تميل إلى البقاء علي قيد الحياة أكثر سوءا من تلك التي في الثقافات التي لم يتم فرزها ولها تشعبات أصغر بكثير و محاور7. للتغلب علي هذه العجز ، قمنا بتكييف وتطبيق أساليب لدعم تطوير الثقافات المنقية مع الخلايا الدالي12،14. يظهر التكوين الخلوي لثقافات الدعم الخاصة بنا (DIV7) في الشكل 4A. هذه الثقافات التي تحتوي غالبا علي البروتين الحمضي الليفي الليليطي (gfap) الايجابيه astrocytes ، ولكن أيضا تحتوي علي بعض مجموعه من جزيء التمايز (CD11b) الايجابيه ميكروليا والبروتين الأساسي المايلين (mbp) الايجابيه oligodendrocytes. بعد DIV 7 ، يمكن ان تكون هذه الخلايا العبور إلى ادراج ثقافة الخلية لتوفير دعم عدم الاتصال من الخلايا العصبية المنقية (الشكل 4B، C). ويكشف تحليل الثقافات المشتركة بين الخلايا العصبية غير العضوية ان ما يقرب من 40,000ا كانت كافيه لتحسين البقاء والنمو علي المدى الطويل للخلايا العصبية المنقية والعصبية جابايرجيك (الشكل 4D, E)7. وعلاوة علي ذلك ، يكشف التحليل الكهربي الفسيولوجي ان الخلايا العصبية جلوتاميرجيك ، شارك في الاستزراع مع الكريات الداليه ، كانت نشطه للغاية وزادت بقوة نشاط الشبكة (النسبة المئوية من الخلايا العصبية المدعومة بالرصاص التي تطلق رشقات ناريه من العمل الإمكانات: 62 في المائة ؛ ن = 28 ؛ الشكل 4 واو ، زاي). دعم glial ولذلك مهم ليس فقط لتعزيز نمو الخلايا العصبية والبقاء علي قيد الحياة, ولكن أيضا لتعزيز انتقال متشابك وإنشاء نشاط الشبكة في الثقافات جلوتاماماتجيك.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58974/58974fig1.jpg"> الشكل 1: تنقيه الخلايا العصبية جلوتاموجيك وجابايرجيك. (ا) الصور التي تظهر اشاره الفلورسنت من التعبير عبر الجينات من TdTomato في NexCre ؛ Ai9 الفئران (اعلي) والزهرة في الفئران VGAT فينوس (أسفل). قضبان المقياس = 5 مم. (ب) القطع المبعثرة الكثيفة لخلايا الطماطم الصغيرة والزهرة الفلورية للخلايا الهيبوكامباله المنفصلة من NexCre ؛ Ai9 الفئران (اعلي) و VGAT فينوس الفئران (أسفل). بقوة الفلورسنت TdTomato أو الخلايا العصبية فينوس تم اختيارها للفرز (المشار اليها من قبل صناديق النابضة). (ج، يسار) الصور المنسقة لل TdTomato فرزها (اعلي) والزهرة (أسفل) الخلايا العصبية الايجابيه. (ج، يمين) صوره مدمجه تظهر الخلايا المشتركة ملطخه DAPI (في الأزرق الزائف). TdTomato مضان هو الذاتية ويبقي قويا علي الرغم من التثبيت (في شبه اللون الأرجواني). ويتعزز التعبير فينوس باستخدام مزيج من الأجسام المضادة الاوليه الموجهة ضد GFP والأجسام المضادة الثانوية 488-المترافقة اليكسا (في شبه اللون الأخضر). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58974/58974fig1large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58974/58974fig2.jpg"> الشكل 2: ثقافة خليه من الخلايا العصبية المنقية جلوتاموجيك أو جابايرجيك. (ا) الاشعه تحت الحمراء مجتمعه (حقل مشرق) الصور والإشارات الفلورية المتراكبه من TdTomato (اليسار) والزهرة (الحق) الخلايا العصبية الايجابيه مثقف ل 1 ح في المختبر. تشير الأسهم البيضاء إلى موقع العصب المتزايد. (ب) الصور المنسقة للخلايا العصبية (اليسار) والزهرة (اليمني) الايجابيه المثقفة لمده 1 ساعة في المختبر. (جيم ، دال) حقل مشرق (اعلي) والجمع بين حقل مشرق والصور الفلورية (أسفل) من TdTomato (C) والخلايا العصبية الايجابيه فينوس (D) مثقف لمده 7 أيام في المختبر (DIV). تظهر الأسهم البيضاء موقع النوى المكثفة من الخلايا الميتة. السهام الملونة تحديد فلوريسسينتلي المسمي الخلايا العصبية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58974/58974fig2large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58974/58974fig3.jpg"> الشكل 3: خصائص مورفولوجية ، الكتروفيزيولوجيه ومتشابكة من الخلايا العصبية المنقية. (الف ، باء) الصور المحورية لل TdTomato (A) والخلايا العصبية الايجابيه فينوس (B) في DIV 13 و DIV 14 ، علي التوالي. يتم عرض الخلايا باللون الأسود باستخدام جدول البحث المقلوب للمساعدة في التصور العصبي. تظهر insets اشاره الفلورسنت التي عبر عنها الخلايا العصبية المحددة. (جيم ، دال) استجابه الجهد من TdTomato (C) والزهرة العصبية الايجابيه (د) إلى فرط الاستقطاب (200 إلى-20 باسكال ، في 20 خطوه باسكال) والاستقطاب (200 pA) النبضات الحالية ، التي تم الحصول عليها من قبل خليه كامله التصحيح المشبك التسجيلات. تظهر insets الخلايا العصبية المسجلة المقابلة. يتم الاشاره إلى امكانيه الغشاء اليستريح لكل خليه إلى يسار تتبع التسجيل. (هاء ، واو) ممثل الجهد المشبك التسجيلات (10 ق) الحصول عليها من TdTomato (E) والخلايا العصبية الزهرة الايجابيه (F). وسجلت الاحداث العفوية بعد متشابك (EPSCs) من الخلايا العصبية الايجابيه TdTomato, الحفاظ علي امكانيه عقد من 50 mV. الاحداث المثبطة التي تحدث تلقائيا (IPSCs) تم تسجيلها من الخلايا العصبية الايجابيه فينوس الحفاظ علي امكانيه عقد من 0 mV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58974/58974fig3large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58974/58974fig4.jpg"> الشكل 4: دعم تطوير الخلايا العصبية مع الثقافة المشتركة. (ا) الصور البؤرية للثقافات الداليه المناعية للبروتين الحمضي الليفي الجليطي (gfap ، اليسار) ، ومجموعه من جزيئات التمايز (CD11b ، والوسط) ، والبروتين الأساسي الميلين (mbp ، اليمين). وقد تم استزراع الخلايا الدليج ل DIV 7. (ب) صور لادراج الثقافة الخلوية المستخدمة في الاستزراع المشترك للخلايا المنزلقة مع الخلايا العصبية المنقية في ترتيب عدم الاتصال. (ج) تخطيطي للترتيب المكاني المستخدم في الاستزراع العصبي المشترك والخلايا الدبقيه. (دال ، هاء) الصور المحورية من TdTomato (D) والخلايا العصبية الايجابيه فينوس (E) ، نمت لمده 14 يوما ، في غياب (اليسار) أو وجود (يمين) من الدعم الدالي. (واو ، زاي) الحالية-المشبك التسجيلات (60 s) من TdTomato (F) والخلايا العصبية الايجابيه فينوس (ز) مثقف لمده 14 يوما في غياب (اعلي) أو وجود (أسفل) من الدعم الدالي. وسجلت الخلايا العصبية في إمكاناتها الغشاء يستريح (قدم إلى اليسار من كل تتبع التسجيل). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58974/58974fig4large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting at JoVE.com

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

يصف هذا البروتوكول طريقه فرز الخلايا القائمة علي تنقيه وثقافة الخلايا العصبية الفلورية جابايرجيك أو جلوتاميرجيك من نيوكورتكس والحصين من الفئران بعد الولادة أو الفئران.

الخلايا الاساسيه الثقافة المنقية جابايرجيك أو الخلايا العصبية جلوتاميجيك أنشئت من خلال الفرز الخلية المنشطة الفلورية

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...

يصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة وقابلة للاستنساخ لتنقية واستزراع أنواع محددة من الخلايا العصبية الأولية. هذه الثقافات هي مناسبة للتحليل الكهربائي الفيزيولوجي والتشكلي والبقاء على قيد الحياة. يمكن استخدام ثقافات الخلايا العصبية النقية لدراسة أساسيات علم وظائف الأعضاء العصبية ، وتشكيل نقاط الاشتباك العصبي وكذلك كيفية تطوير الشبكات العصبية.بينما نحن نركز على الخلايا الرئيسية الغلوتاماترجية القشرية وجابارجيورونس, هذا الإجراء يمكن تعديلها بسهولة لدراسة أي خطوط الخلايا العصبية التي تعبر عن البروتينات الفلورية. لإعداد أغطية الزجاج، أولا ذوبان aliquot خمسة ملليلتر من 200 ميكروغرام لكل مليلتر حل PLL. تخفيف هذا المحلل المخزون إلى 20 ميكروغرام لكل ملليلتر عن طريق إضافة 45 ملليلتر من حقن نقية الصف المياه.ثم تصفية تعقيم الحل في أنبوب جديد مخروطي 50 ملليلتر وتسمية هذا الأنبوب كما PLL معقم. المقبل، مكان 100 معقمة جولة 12 ملليمتر الزجاج أغطية في حل PLL العقيمة. تهيج الأنبوب كل خمس إلى 10 دقائق لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق لضمان حتى الطلاء.بعد 40 دقيقة من طلاء PLL ، خذ قطعتين من ورق الأنسجة ووضعها مسطحة في خزانة التدفق. تعقيم الورق باستخدام 70٪ الإيثانول ثم تسطيح لإزالة التجاعيد وتترك لتجف. بعد طلاء الزجاج يغطي لمدة ساعة واحدة مع PLL، وإزالة فائض محلول PLL وإضافة حقن معقمة حقن المياه الصف.يهيج برفق الأغطية لمدة ثانيتين إلى ثلاث ثوان لإزالة PLL الزائدة. كرر هذه الخطوة الشطف مرتين أكثر من ذلك. إزالة المياه الزائدة ومن ثم نقل الأغطية إلى ورق الأنسجة العقيمة.مرة واحدة الجافة، ونقل الأغطية إلى لوحة ثقافة 24 جيدا. لإعداد حلول ثقافة الخلية، قياس 12 ملليلتر من الخلية العازلة لثقافة إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر وتسمية كـ BSA. قياس من أصل خمسة ملليلتر من الخلية العازلة ثقافة مختلفة 15 ملليلتر أنبوب وتسمية papain.في وقت لاحق، احتضان كلا الأنابيب لمدة 15 دقيقة في 37 درجة مئوية. إضافة 120 ملليغرام من BSA إلى أنبوب المسمى BSA. ثم عكس أنبوب للمساعدة في حل الحل.ثم إضافة سبعة ملليغرام من papain إلى أنبوب المسمى papain. أعيدي كلا الأنابيب إلى حمام الماء لمدة 15 دقيقة. تصفية تعقيم حل BSA في أنبوب مخروطية جديدة.تقسيم محلول BSA العقيمة إلى ثلاثة أنابيب وتسمية كل أنبوب كما BSA العقيمة وإما واحد أو اثنين أو ثلاثة. تصفية الآن تعقيم أنبوب papain وتسمية الأنبوب كما papain معقمة. عودة جميع الأنابيب مرة أخرى إلى حمام الماء والاستمرار في احتضان في 37 درجة مئوية حتى الاستخدام.للتحضير لتشريح الأنسجة ، وضع المشرط والمقص والملقط والملعقة اللازمة لتشريح قرن آمون والقشرة. ضع طبقين من 35 ملليمترًا من الأطباق بيترية وطبق بيتري عيار 100 ملليمتر يحتوي على ورق فلتر معقمة في خزانة التدفق. جمع NexCre المعدلة وراثيا؛ Ai9 أو الفينة GABA الناقل فينوس الجراء الماوس التي سيتم تشريحها باستخدام مصباح الفلورسنت مع الإثارة المناسبة ومرشحات الانبعاثات التمييز الجراء الفلورسنت من أنواع البرية لتر الاصحاب.مباشرة قبل تشريح الحيوانات، وملء في كل طبق بيتري مع المبردة العازلة خلية عقيمة الثقافة. بعد تشريح، نقل بعناية الدماغ الجرو المعدلة وراثيا إلى ورقة مرشح العقيمة. أولاً، تشريح المخيخ وفصل نصفي الكرة الأرضية.ثم فصل بعناية الحصين والقشرة من كل نصف الكرة الأرضية. نقل الأنسجة تشريح إلى 35 ملليمتر طبق بيتري التي تحتوي على خلية المبردة العازلة الثقافة. ثم نقل قرن آمون تشريح والقشرة إلى غطاء آخر 35 ملليمتر بتري طبق.باستخدام الحافة المسطحة من شفرة مشرط، ختم بعناية الأنسجة في حركة متقاطع حتى تبقى قطع صغيرة فقط. بعد ذلك، نقل الأنسجة المفرومة مع كمية صغيرة من محلول البابين من غطاء طبق بيتري إلى أنبوب باباين العقيمة. احتضان الأنسجة في 37 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة.بعد حضانة باباين، نقل أنبوب باباين العقيمة وأنبوب BSA العقيمة إلى مجلس الوزراء تدفق. ثم استخدام ماصة باستور ملليلتر واحد لنقل فقط أنسجة كورتيكوهيبابوكامبال من أنبوب باباين في أنبوب BSA واحد. من أجل تفريق أي كتل كبيرة من الأنسجة، triturate الأنسجة عدة مرات باستخدام ماصات باستور ملليلتر واحد.بعد هذا، triturate الأنسجة سبع مرات باستخدام غرامة تلميح الماص باستور. بعد 30 ثانية، نقل ملليلتر واحد من المحلل السفلي والأنسجة من أنبوب BSA واحد إلى أنبوب BSA اثنين. Triturate الأنسجة في أنبوب BSA مرتين عدة مرات باستخدام غرامة تلميح الماص باستور.بعد التثغر، نقل ملليلتر واحد من الأنسجة السفلية والحل من أنبوب BSA واحد إلى أنبوب BSA ثلاثة. اِثُل الأنسجة في أنبوب BSA ثلاث مرات. بعد التثفير، نقل جميع الحل والأنسجة من أنابيب اثنين وثلاثة إلى أنبوب BSA واحد.Triturate مرتين إلى ثلاث مرات أخرى والطرد المركزي في 3،000 مرات ز لمدة ثلاث دقائق. بعد الطرد المركزي، وإزالة بعناية سوبرنات من الأنسجة بيليه وإعادة تعليق الخلايا باستخدام ماصة P1000 في مليلتر اثنين من السبات كاملة متوسطة الفلورانس منخفضة. ثم triturate الأنسجة 20 مرات لضمان إعادة ينسر كاملة من حل الأنسجة.في وقت لاحق، filer تعليق الخلية من خلال منخل خلية 30 ميكرومتر في أنبوب عينة البوليسترين. إعداد أنابيب جمع فرز الخلايا عن طريق pipetting 300 microliters من السبات كاملة وسائط إلى العدد المطلوب من أنابيب البولي بروبلين. لكل نوع خلية فلورية ليتم فرزها، اختر الإثارة المناسبة ومرشحات الانبعاثات.اثير بروتين الزهرة باستخدام 488 نانومتر الموجة الكشف عن الضوء المنبعث من خلال 530/40 مرشح الانبعاثات مجموعة. اثير بروتين TdTomato باستخدام 531 نانومتر الموجة والكشف عن الضوء المنبعث من خلال 575/30 مجموعة مرشح الانبعاثات. للحصول على نقاء عالي، قم بفرز الخلايا الفلورية ذات التسمية الزاهية.بعد فرز الخلايا، نقل الخلايا التي تم جمعها إلى اثنين ملليلتر جولة أنابيب الطرد المركزي القاع. ثم الطرد المركزي الخلايا في 3،000 مرات ز لمدة ثلاث دقائق لتشكيل بيليه الخلية. Resuspend بيليه الخلية في المبلغ المطلوب من ما قبل الدافئة كاملة الدوري الاميركي للمحترفين المتوسطة لتحقيق كثافة الخلية من 1، 000 خلية لكل ميكرولتر.لتأكيد وجود خلايا منفصلة، تحقق من محلول الخلية تحت المجهر باستخدام 4X أو عدسة هدف 10X. قبل طلاء الخلايا، دوامة بسرعة متوسطة لمدة 2-3 ثوان لضمان تعليق الخلية حتى. بعد دوامة، الماصات بسرعة 10 ميكرولترات من تعليق الخلية إلى مركز كل غطاء.بعد ساعة واحدة، تغذية الخلايا مع 500 ميكرولترات من ما قبل الدافئة كاملة الدوري الاميركي للمحترفين المتوسطة والعودة إلى الحاضنة في 37 درجة مئوية. للمشاركة في زراعة الخلايا العصبية النقية والخلايا الدبقية، مرور الخلايا الدبقية إلى العدد المطلوب من الخلايا ثقافة إدراج. ويتم ذلك عن طريق طلاء 40، 000 الخلايا الدبقية في 500 ميكرولتر قطرات من المتوسط الدوري الاميركي للمحترفين كاملة.بعد ساعة واحدة، نقل تدرج ثقافة الخلية الدبقية إلى الخلايا العصبية النقية. إزالة وسائل الإعلام الزائدة من إدراج الثقافة وإعادة لوحات إلى الحاضنة لاستزراع. بعد الفرز الناجح، يجب أن تظهر الخلايا العصبية مطلي جولة في الشكل مع غشاء أملس وينبغي أن ينظر إليها لتجنيب ما يصل neuroids بعد ما يقرب من ساعة واحدة في المختبر.سبعة أيام في المختبر، على الرغم من أن بعض الموت الخلية قد تكون واضحة، ينبغي أن تكون خلايا قابلة للحياة موجودة في جميع ظروف الثقافة. تحليل الثقافات النقية يكشف أن كلا من الجلوتاطة والخلايا العصبية GABAergic كانت قادرة على تمديد محاور المحاور والتشعبات من أجسامها الخلية والاحتفاظ بالقدرة على توليد إمكانات العمل استجابة لعتبة فائقة الحقن الحالية. لا سيما بعد تنقية, تلقى فقط الخلايا العصبية GABAergic كمية كبيرة من انتقال متشابك عفوية والخلايا العصبية الجلوتاطة الغلوتامية تلقى القليل جدا من انتقال متشابك في غياب الخلايا الدبقية.الأهم من ذلك, زراعة الخلايا العصبية النقية مع الخلايا الدبقية يحسن نمو الخلايا العصبية والبقاء على قيد الحياة، فضلا عن تعزيز انتقال متشابك في الثقافات الجلوتاتية. يكفي طلاء الاستقطاب من الأغطية والحفاظ على pH الفسيولوجية من وسائل الإعلام الثقافة في جميع أنحاء الإجراء هي المفتاح لضمان ثقافات الخلايا ذات نوعية جيدة. بعد هذا البروتوكول، ينبغي أن يكون من الممكن إجراء تسلسل الحمض النووي الريبي ومطياف كتلة البروتين على الثقافات النقية مما يسمح لعمليات الترجمة والنسخي أن يتم التحقيق في أنواع خلايا عصبية محددة.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

وهو الإجراء الأمثل لالإسفار تنشيط عزل الخلية (نظام مراقبة الأصول الميدانية) فرز الأسلاف العصبية الاستقلال الذاتي من الجهاز التنفسي والهضمي من الفئران الجنينية

During development neural crest (NC)-derived neuronal progenitors migrate away from the neural tube to form autonomic ganglia in visceral organs like the ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

مواصفات من الخلايا العصبية الجلوتاميرجي الدماغ الانتهائي من خلايا الجذعية المحفزة

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

الكالسيوم فوسفات ترنسفكأيشن من الخلايا العصبية الحصين الابتدائية

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

الثقافة الابتدائية من الخلايا العصبية الدوبامين ماوس

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

باستخدام الإسفار خلية المنشط الفرز لفحص الخلية من نوع محدد التعبير الجيني في الأنسجة دماغ الفئران

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS) وجين تحليل التعبير عن فوس، معربا عن الخلايا العصبية من الطازجة والمجمدة الأنسجة دماغ الفئران

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

الثقافة الاساسيه للخلايا العصبية معزولة عن المخيخ الفئران الجنينية

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

الهجرة، والجذب الكيميائي، ومقالات الثقافة المشتركة للخلايا الأنبوسلية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية والخلايا العصبية GABAergic

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

وضع العلامات البالستية للخلايا العصبية الهرمية في شرائح الدماغ وفي ثقافة الخلايا الأولية

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...