Name: primary cell culture of purified gabaergic or glutamatergic neurons established through fluorescence-activated cell sorting
Uploaded: 2019-06-06T13:00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting at JoVE.com

המחברים רוצים להודות לתמיכה טכנית מעולה שסופקו על ידי ג'ני קירש ואנה טאיצ'יולר בזרם CyDeutsches Try ליבה מתקן, Rheuma-Forschtok, ברלין. אנחנו רוצים להודות לג'אי סונג. על עזרתו בניתוח הישרדות כמו כן, אנו רוצים להודות לריטה לוברו על עזרתה בלכידת התמונות של עכברי פלורסנט וכריסטיאן אבנר לקריאה קריטית של הפרוטוקול. החולדות הטרנסגניות של VGAT-ונוס הופקו על ידי ד"ר י. יאנגאווה, מ. היגיאייאשי וכואגוצ'י במכון הלאומי למדעי הפיזיולוגיה, וקאזאקי, יפן, באמצעות pCS2-ונוס שסיפק ד ר א. מיאקי. עבודה זו נתמכת על ידי מועצת המחקר הגרמנית (דויטשה פורשונגססמייםהגבורהאחייסהאחג, DFG EXC 257 עד IV).

<ol>
	<li>Radcliff, G., Jaroszeski, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basics+of+flow+cytometry.">Basics of flow cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 91, 1-24 (1998).</li><li>Feher, K., Kirsch, J., Radbruch, A., Chang, H. D., Kaiser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+population+identification+using+fluorescence-minus-one+controls+with+a+one-class+classifying+algorithm.">Cell population identification using fluorescence-minus-one controls with a one-class classifying algorithm.</a> Bioinformatics. 30 (23), 3372-3378 (2014).</li><li>Sergent-Tanguy, S., Chagneau, C., Neveu, I., Naveilhan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+activated+cell+sorting+(FACS):+a+rapid+and+reliable+method+to+estimate+the+number+of+neurons+in+a+mixed+population.">Fluorescent activated cell sorting (FACS): a rapid and reliable method to estimate the number of neurons in a mixed population.</a> Journal of Neuroscience Methods. 129 (1), 73-79 (2003).</li><li>Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+basic+principles+and+applications.">Flow cytometry: basic principles and applications.</a> Critical Reviews in Biotechnology. 37 (2), 163-176 (2017).</li><li>Guez-Barber, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+purification+of+immunolabeled+cell+types+from+adult+rat+brain.">FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 203 (1), 10-18 (2012).</li><li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).</li><li>Turko, P., Groberman, K., Browa, F., Cobb, S., Vida, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Dependence+of+GABAergic+and+Glutamatergic+Neurons+on+Glia+for+the+Establishment+of+Synaptic+Transmission.">Differential Dependence of GABAergic and Glutamatergic Neurons on Glia for the Establishment of Synaptic Transmission.</a> Cerebral Cortex. , (2018).</li><li>Uematsu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+chemical+composition+of+cortical+gabaergic+neurons+revealed+in+transgenic+venus-expressing+rats.">Quantitative chemical composition of cortical gabaergic neurons revealed in transgenic venus-expressing rats.</a> Cerebral Cortex. 18, 315-330 (2008).</li><li>Goebbels, S., Bormuth, I., Bode, U., Hermanson, O., Schwab, M. H., Nave, K. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+targeting+of+principal+neurons+in+neocortex+and+hippocampus+of+NEX-Cre+mice.">Genetic targeting of principal neurons in neocortex and hippocampus of NEX-Cre mice.</a> Genesis. 44, 611-621 (2006).</li><li>Banker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trophic+interactions+between+astroglial+cells+and+hippocampal+neurons+in+culture.">Trophic interactions between astroglial cells and hippocampal neurons in culture.</a> Science. 209, 809-810 (1980).</li><li>Lindsay, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+rat+brain+astrocytes+support+survival+of+both+NGF-dependent+and+NGF-insensitive+neurones.">Adult rat brain astrocytes support survival of both NGF-dependent and NGF-insensitive neurones.</a> Nature. 282 (5734), 80-82 (1979).</li><li>Geissler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+hippocampal+neurons,+which+lack+four+crucial+extracellular+matrix+molecules,+display+abnormalities+of+synaptic+structure+and+function+and+severe+deficits+in+perineuronal+net+formation.">Primary hippocampal neurons, which lack four crucial extracellular matrix molecules, display abnormalities of synaptic structure and function and severe deficits in perineuronal net formation.</a> Journal of Neuroscience. 33 (18), 7742-7755 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labeling+of+both+gabaergicand+glycinergic+neurons+in+vesicular+GABA+transporter+(VGAT)-venus+transgenic+mouse.">Fluorescent labeling of both gabaergicand glycinergic neurons in vesicular GABA transporter (VGAT)-venus transgenic mouse.</a> Neuroscience. 164 (3), 1031-1043 (2009).</li><li>H&#246;ltje, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Rho+gtpasein+astrocyte+morphology+and+migratory+response+during+in+vitro+wound+healing.">Role of Rho gtpasein astrocyte morphology and migratory response during in vitro wound healing.</a> Journal of Neurochemistry. 95 (5), 1237-1248 (2005).</li><li>Booker, S. A., Song, J., Vida, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+Patch-clamp+Recordings+from+Morphologically-+and+Neurochemically-identified+Hippocampal+Interneurons.">Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons.</a> Journal of Visualized Experiments. , e51706 (2014).</li><li>Pfrieger, F. W., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+efficacy+enhanced+by+glial+cells+in+vitro.">Synaptic efficacy enhanced by glial cells in vitro.</a> Science. 277 (5332), 1684-1687 (1997).</li><li>Ullian, E. M., Sapperstein, S. K., Christopherson, K. S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+synapse+number+by+glia.">Control of synapse number by glia.</a> Science. 291, 657-661 (2001).</li><li>Christopherson, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombospondins+are+astrocyte-secreted+proteins+that+promote+CNS+synaptogenesis.">Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis.</a> Cell. 120, 421-433 (2005).</li><li>Berghuis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-derived+neurotrophic+factor+controls+functional+differentiation+and+microcircuit+formation+of+selectively+isolated+fast-spiking+gabaergic+interneurons.">Brain-derived neurotrophic factor controls functional differentiation and microcircuit formation of selectively isolated fast-spiking gabaergic interneurons.</a> European Journal of Neuroscience. 20 (5), 1290-1306 (2004).</li><li>Liddelow, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+microglia+induce+neurotoxic+reactive+astrocytes+via+Il-1&#945;,+tnf&#945;,+and+c1q.">Activated microglia induce neurotoxic reactive astrocytes via Il-1&#945;, tnf&#945;, and c1q.</a> Nature. 541, 481-487 (2017).</li><li>Tomlinson, M. J., Tomlinson, S., Yang, X. B., Kirkham, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+separation:+Terminology+and+practical+considerations.">Cell separation: Terminology and practical considerations.</a> Journal of Tissue Engineering. 4, (2013).</li><li>Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+survival+of+hippocampal+neurons+in+B27-supplemented+Neurobasal,+a+new+serum-free+medium+combination.">Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination.</a> Journal of Neuroscience Research. 35 (5), 567-576 (1993).</li></ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

אנו מתארים כאן שיטה המשלבת את המיון והculturing של נוירונים ראשוניים כדי ליצור תרביות תאים עצביים מטוהרים. שיטה זו לוקח בערך 1 h יותר מאשר פרוטוקול אופייני העיקרי התרבות העצבית הבסיסית עדיין מאפשר את הדור של מאות תרבויות שכפול המכיל סוגים עצביים ספציפיים. הנוירונים מטוהרים, אשר ניתן לגדל בבידוד לפחות 16 ימים, להאריך אקסונים ודנדריטים והוא יכול לפטר רכבות חוזרות של פוטנציאל פעולה (איור 2 ואיור 3). וחשוב מכך, תאים אלה הם מקבילות לאותם מנתח ניסיוני כמו תרבויות נוירואליות העיקרי הנתק הראשוני, כולל אלקטרופיזיולוגיה, ניתוח מורפולוגיים והישרדות. היתרון העיקרי של עבודה עם תרבויות אלה מטוהרים הוא כי התפתחות של סוגי תאים ספציפיים ניתן ללמוד בבידוד. כדי לתמוך בפיתוח של תרבויות מטוהרים, אנו גם מציגים פרוטוקול עבור שיתוף culturing נוירונים מטוהרים עם תאי גליה. כפי שמוצג קודם לכן, co-culturing מטוהרים נוירונים עם תאים גליה משפר את ההישרדות שלהם, צמיחה והוא יכול לקדם את היווצרות הרשת7 (איור 4). כך, אנו מציגים כאן שילוב של שיטות שאמורות לקדם את המחקר של האינטראקציות גליה-נוירונים והוא עשוי להיות שימושי לחקר הפיתוח והאינטראקציה בין סוגי תאים אחרים של העניין.
מחקרים על תרבויות של מטוהרים glutamatergic נוירונים חשפו תובנות בסיסיות לדרך תאים גליה להפריש גורמים המקדמים את הפיתוח של רשתות נוירוונאליות והיווצרות סינפסה16,17,18 . באופן כללי, שיטות לטיהור סוגים ספציפיים של תא העצב הוחלו בהצלחה רבה יותר כדי ללמוד את התפתחותם של הנוירונים הglutamatergic במקום נוירונים GABAergic. זה הוביל לפער בהבנת האופן שבו שני סוגי תאים אלה מתפתחים. בהינתן כי GABAergic ו glutamatergic הנוירונים שונים באופן משמעותי במונחים של האנטומיה שלהם, פיזיולוגיה ומקורות התפתחותיות, זה חיוני כי אנו לומדים הנוירונים GABAergic בזכות שלהם, כדי להבין טוב יותר את תפקידם ואת הפיזיולוגיה. באמצעות הפרוטוקול המוצג כאן, זיהינו בעבר הבדלים חשובים בדרך GABAergic ו glutamatergic נוירונים תלוי בגורמים גליה-מופרש להקמת שידור סינפטית7. על ידי פרסום פרוטוקול זה אנו מקווים כי אחרים יכולים לעשות תובנות נוספות לתוך האינטראקציות החשובות בין נוירונים ותאי גליה.
בפרוטוקול זה, אנו מתארים את הזרימה cy, לנסות שיטת מיון התא, אשר השתמשנו כדי לטהר GABAergic או glutamatergic נוירונים מתוך קווי מכרסמים שונים הטרנסגניים. ונוס הנוירונים בצורה חיובית GABAergic ממוינים VGAT ונוס עכברים13 או חולדות8 ו-tdtomato חיובי glutamatergic הנוירונים היו ממוינים מתוך nexcre Ai9 עכברים (שנולדו במקור מ NexCre9 ו Ai9 שורות הכתב6, ראה turko et al., 20187). בשנים האחרונות, בגלל הפיתוחים הטכנולוגיים, הפכו הדור של חיות הטרנסגניים לקלים יותר באופן משמעותי. ככזה, הזמינות של בעלי חיים המבטא מולקולות פלורסנט, בסוגים רבים של תאים שונים, גדל במהירות. זה, בתורו, הגביר את השימוש והישימות של מיון התא המופעל פלורסנט. בעוד ששיטות חלופיות לבידוד תאי עניין הקיימות כיום16,19,20, הן מודרכים במידה מסוימת על ידי התלות שלהם על הזמינות של נוגדנים מתאימים למשטח טבעי אנטיגנים. זה מגביל את צדדיות שלהם בהשוואה עם שיטות מיון מבוסס-פלואורסצנטית תא, אשר ניתן כבר להשתמש כדי למיין תאים מתוך הרבים תאים מסוימים העיתונאי הטרנסגניים שכבר זמינים. עם זאת, כאשר ממוטבת, מבוססי נוגדן שיטות מיון יכול להיות מהיר ומניב גבוה, ואולי אפילו טוב יותר לשמר את אנטומיה התא, על ידי התרת טיהור של תאים עם אקסונים שלהם ו דנדטים21שלמים. לפיכך, שיטות מיון נוגדנים צריכות להיחשב עדיין כאשר מחליטים על אסטרטגיית מיון. בסופו של דבר, סוג התא של עניין, את הגיל שבו תאים ממוינים, הזמינות של בעלי חיים טרנסגניים או אנטיגנים פני השטח ואת מספר התאים הדרושים יהיו הגורמים המכריע בעת בחירת אסטרטגיית המיון המתאימה ביותר.
למרות מיון התא המבוסס על קרינה פלואורסצנטית הוא שיטה פשוטה ומיועלת לטיהור תאים, יש לנקוט טיפול בשלבים מסוימים של הפרוטוקול כדי לשמר את איכות התאים. למשל, לאחר כל צעד צנטריפוגה, חשוב לוודא כי הגלולה התא מושעה מחדש מהר ככל האפשר, תאים ששוחזרו בהצלחה. לעיתים, ניתן להפריע לגלולה הסלולרית בעת הסרת הסופרנטאנט. לכן מומלץ, בין צנטריפוגה צעדים, כדי לבדוק את נוכחות של תאים תחת המיקרוסקופ כדי לשלול כל אובדן התאים הנרחב. לאחר ציפוי התא, יש לאפשר לתאים לדבוק לפחות 1 h לפני האכלה. אם התאים מוזנים מוקדם מדי, תאים מסוימים עלולים להיות מחליקים מתוך הכיסויים, ובכך להקטין את צפיפות התרבות. לאחר 1 h בתרבות, זה נבון להעריך את בריאות התא. אם תאים אינם מופיעים בריאים (דוגמה לתאים בריאים מוצג באיור 2A), או שיש מוות משמעותי בתאים, הדבר עשוי להוות אינדיקציה לבעיה במהלך הליך הדיסוציאציה או המיון. שיקול חשוב נוסף, כאשר culturing כל סוג תא, היא לדאוג בעת ניהול מדיה תרבות התא. מדיית ה-NBA מכילה אדום פנול, המשמש כמחוון pH22. אם המדיה הופכת צהובה מדי בצבע, אז זה מצביע על כך pH הוא חומצי מדי; אם המדיה נעשית ורודה מדי, הדבר מצביע על כך שהפתרון הוא בסיסי מדי. פתרונות מניות פתוחים לפרקי זמן ארוכים, בעיקר אמצעי תקשורת המצוטטים בצינורות חרוטיים, נוטים להפוך ליותר אלקליין לאורך זמן. לכן מומלץ ליצור מדיה חדשה מלאה ב-NBA בכל שבוע ומדיה להשלים כל שבועיים (מאגרי בינוני תחת תנאים אטמוספריים ולכן צריך להיות יציב יותר). לקיחת נקודות אלה בחשבון זה צריך להיות אפשרי כדי ליצור תרביות תאים מטוהרים בכל מעבדה עם גישה מיון התא וציוד תרבות התא.
ברוב הניסויים שלנו הצלחנו לייצר תרבויות מטוהרים מחיה אחת. עם זאת, בעת טיהור תאים עבור ניתוחים ביוכימיים, ייתכן שיהיה צורך לבריכה יחד בעלי חיים מרובים למיון. בהצלחה מוינו עד 8 עכברים עובריים (יום מעובריים 13 בעלי חיים) באמצעות פרוטוקול הנ ל (נתונים לא מוצגים). עם זאת, אם יש יותר בעלי חיים להיות ממוינים, ייתכן שיהיה צורך להגדיל את הנפח של שניהם פפאין ו-bsa פתרונות (מתוארים בשלבים 2.1.1 – 2.1.4) כדי להתאים את הגידול בכמות הרקמה. בנוסף, אם יותר תאים מצופים בתרבות, ייתכן שיידרש לוח זמנים תכוף יותר להזנה. כנקודת התחלה, תאים יכולים להיות מוזנים כל 7 ימים על ידי הסרת 100 μL של מדיה ממוזג והוספת 200 μL של מדיה חדשה להשלים ה-NBA. למען יכולת הקיום של הנוירונים, אם למיין יותר בעלי חיים, המחשבה צריכה להיות ניתנת כדי למזער את זמן המיון ככל האפשר. זה דורש לעתים קרובות אופטימיזציה קפדנית של ניתוחי במורד הזרם לשימוש יעיל של תאים מטוהרים. יש לנו מיון שגרתי הנוירונים בעכבר בשיעור של 600 אירועים/s, עד 500000 – 800000 תאים לכל בעל חיים (לאחר לידה 0 – 2). עם זאת, זה היה ללא אופטימיזציה ממצה של מהירויות מיון ותנאים. לכן, שיפורים נוספים במהירות המיון ובתשואה צריכים להיות אפשריים.
הנוירונים מטוהרים דורשים מדיה ממוזג להישרדותה. זה כבר הוכח בעבר על ידי הנוירונים culturing ותאי גליה בנפרד, לפני טיפול בנוירונים עם מזגן גליה מדיה10. בניסויים שלנו, בחרנו לתמוך בנוירונים מטוהרים על ידי תאים גליה culturing על למחצה חדיר תרבות התא מוסיף, אשר ממוקמים בתוך לוחית התרבות התא. שיטה זו חלה בהצלחה ללמוד מטריקס הנגזרים מטריצות חלבונים האינטראקציה שלהם עם נוירונים12. התמיכה הרציפה המסופקת באמצעות שיטה זו כוללת מספר יתרונות בהשוואה לתרבות התאים הנפרדת. בעיקר, שיתוף התרבות של תאים גליה עם נוירונים מאפשר רגולציה רציפה ומיזוג של התקשורת תרבות התא, אשר דומה יותר במצב vivo. בנוסף, שיתוף התרבות הרציפה של תאים מאפשר איתות משוב פוטנציאלי בין נוירונים ו גליה, אשר אינו אפשרי בתרבויות מופרדות. בפרוטוקול שלנו, אם נדרש, שיטת שיתוף התרבות הרציפה ניתן להשמיט בקלות וטיפול קלאסי של נוירונים עם מדיה ממוזג-glia ניתן לבצע.
לסיכום, הפרוטוקול המוצג כאן שואפת לספק לקורא בסיס מוצק שממנו הם יכולים לבסס את הניסויים שלהם בתרבות התא הטהור. אנו מנבאות כי הזמינות של בעלי חיים טרנסגניים ומבנים ויראליות תמשיך להגדיל לעתיד הקרוב. לכן, טכניקות מיון התא מבוסס על הזריחה צפויים להיות אפילו יותר נפוץ ויקר.

מיון התא הוא כלי רב עוצמה לבידוד של תאים חיים מעניינים מתערובת הטרוגנית של תאים. ניתן למיין תאים בהתאם לקריטריוני גודל וצורה, כמו גם לביטוי של סמני פלורסנט1,2. לעתים קרובות, fluorophore-נוגדנים מצופנים משמשים כדי לסמן סוגי תאים שונים על-ידי פילוח של משטח ספציפי לתא אנטיגנים3,4. לחילופין, בעלי חיים טרנסגניים או מערכות שילוח נגיפי הותכננו לבטא fluorophores תחת היזמים ספציפיים לתא5,6. מבחינה היסטורית, התפתחות הכלים הטרנסגניים ובעלי החיים הייתה יקרה וצורכת זמן רב. לאחרונה, הפחתת עלויות ופחות קשיים טכניים הובילו לעלייה דרמטית במספר שורות הכתב הזמינות. כאשר הזמינות של כלים טרנסגניים ובעלי חיים עיתונאי ממשיכה לצמוח, כך גם התועלת והישימות של שיטות מיון של תאים פלואורסצנטית מבוססי.
הדגמנו לאחרונה כי התא מיון מבעלי חיים טרנסגניים ניתן להחיל באופן שגרתי כדי לטהר את הנוירונים העיקריים לקראת תרבות התא7. על-ידי מיון תאים מחולדות או עכברים, היינו מסוגלים לבודד את הנוירונים התרבות פלורסנט, אשר לבטא העיתונאי פלורסנט חלבונים במיוחד ב gabaergic או glutamatergic נוירונים6,8,9. על ידי לימוד אלה תרבויות נוירואליות מטוהרים, היינו מסוגלים לזהות הבדל חשוב בדרך GABAergic ו glutamatergic נוירונים תלוי בגורמים מופרש גליה להקמת שידור סינפטית7. בנוסף, על ידי co-culturing תאים גליאל עם נוירונים מטוהרים, היינו מסוגלים להאריך על תצפיות קודמות הממחיש את התפקיד הקריטי כי תאי גליה לשחק בצמיחה והישרדות של נוירונים10,11. כך, באמצעות שילוב של מיון התא ותרבות התא, הצלחנו ללמוד לא רק את הפיתוח של סוגי נוירונים ספציפיים בבידוד, אבל היו מסוגלים לחקור את ההשפעה של תאי גליה על תפקידם.
אנו מציגים כאן פרוטוקול לטיהור ותרבות של GABAergic ו glutamatergic נוירונים מן הקליפה ההיפוקמפוס של עכברים הטרנסגניים או חולדות. אנו מציגים גם שיטה עבור שיתוף התרבות ללא קשר של נוירונים מטוהרים ותאי גליה, המותאם מגייסלר ואח '12. כדי ליצור תרבויות GABAergic מטוהרים, יש לנו מיון נוירונים פלורסנט מ VGAT-ונוס-חולדות Wistar8 או vgat-ונוס עכברים13, אשר באופן סלקטיבי לבטא גרסה צהובה משופרת של חלבון פלורסנט (ונוס) ב-> 95% של . נוירונים. כדי ליצור תרבויות glutamatergic מטוהרים, יש לנו מיון נוירונים פלורסנט מ NexCre מיין; Ai9 עכברים6,9, אשר לבטא tdtomato בנוירונים glutamatergic הקליפת העצם. הליך מיון ותרבות כולו ניתן לבצע בתוך 3-4 h והוא יכול לשמש כדי לייצר מאות תרבויות שכפול מתאים אלקטרופיזיולוגיה, מורפולוגית וניתוח הישרדות תאים. השיטה היא פשוטה, הניתנת להפקה ויכולה לייצר תרבויות נוירואליות מטוהרים, כי הם גדולים מ 97% טהור עבור סוג התא של עניין.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Neural Basal A media (NBA)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10888022</td>
			<td>Cell Culture Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17504001</td>
			<td>Culture supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>35050-038</td>
			<td>Culture supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P1399</td>
			<td>Coverslip coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P4762-1G</td>
			<td>Enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A3294-100G</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hibernate A low fluorescence media</td>
			<td>Brain Bits Ltd</td>
			<td>HALF</td>
			<td>Cell Transport media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM)</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>F0435</td>
			<td>Glial Culture Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>S0115</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin / EDTA</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L2163</td>
			<td>Enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Tip Pasteur Pipette</td>
			<td>Neo Labs</td>
			<td>-</td>
			<td>Used for trituration of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>BD</td>
			<td>353047</td>
			<td>Culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>352070</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>352096</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips: 12 mm round</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P231.1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353001</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 &#181;m CellTrics Cell Sieve</td>
			<td>sysmex</td>
			<td>04-004-2326</td>
			<td>To remove cell clumps before cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottom polystyrene tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>352054</td>
			<td>Transport tube for sorted cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottom polypropylyne tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>352063</td>
			<td>Collection tube for sorted cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture inserts &#8211; 0.4 &#181;m transparent PET</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353 095</td>
			<td>For the co-culture of neurons and glia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra fine Bonn Scissors</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>14084-08</td>
			<td>To remove overlying skin and bone of mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra narrow Scissors</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>14088-10</td>
			<td>To remove overlying skin and bone of rats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>11242-40</td>
			<td>To hold the head in place</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula (130 mm long / 5 mm tip width)</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>3006.1</td>
			<td>To remove the brain to filter paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blades</td>
			<td>Swan-Morton</td>
			<td>#0308</td>
			<td>To mechanically dissociate neural tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemocytometer (Neubauer Imroved)</td>
			<td>Optik Labor</td>
			<td>-</td>
			<td>To cell count dissociated cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Miners Goggles (excitation light)</td>
			<td>Biological Laboratory Equipment 
			Maintenance and Servce Ltd (BLS)</td>
			<td>FHS/LS-1G</td>
			<td>To excite TdTomato</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Miners Goggles (emission filter)</td>
			<td>Biological Laboratory Equipment 
			Maintenance and Servce Ltd (BLS)</td>
			<td>FHS/EF-4R2</td>
			<td>Td Tomato compatible emission filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Miners Goggles (excitation light)</td>
			<td>Biological Laboratory Equipment 
			Maintenance and Servce Ltd (BLS)</td>
			<td>FS/ULS-02B2</td>
			<td>To excite Venus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Miners Goggles (emission filter)</td>
			<td>Biological Laboratory Equipment 
			Maintenance and Servce Ltd (BLS)</td>
			<td>FS/TEF-3GY1</td>
			<td>Venus compatible emission filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse-Anti-GFP primary antibodies</td>
			<td>UC Davis</td>
			<td>75-132</td>
			<td>To enhance Venus signal following fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse-Anti-GFAP primary antibodies</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G-3893</td>
			<td>The identification of reactive astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit-Anti-CD11b primary antibodies</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>1561-15</td>
			<td>The identification of microglial cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit-Anti-MBP primary antibodies</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB980</td>
			<td>The identification of oligodendrocyes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary cell culture of purified gabaergic or glutamatergic neurons established through fluorescence-activated cell sorting

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא ליצור תרבויות נוירואליות מטוהרים נגזר משני GABAergic או glutamatergic נוירונים. נוירונים מטוהרים יכולים להיות מתורבתים במדיה מוגדרת במשך 16 ימים מחוץ למבחנה והם מוזמנים לניתוח כלשהו שבוצע בדרך כלל על תרבויות שאינן מוצדות, ובכלל זה אלקטרופיזיולוגיה, ניתוח מורפולוגיים והישרדות. היתרון העיקרי של תרבויות אלה הוא כי סוגי תאים ספציפיים ניתן ללמוד באופן סלקטיבי בהעדר השפעות חיצוניות מורכבות, כגון אלה הנובעים מתאי גליה או סוגי נוירונים אחרים. בעת תכנון ניסויים עם תאים מטוהרים, עם זאת, חשוב לציין כי הנוירונים תלויים בחוזקה על מדיה ממוזג של גליה לצמיחה שלהם הישרדות. בנוסף, הנוירונים glutamatergic עוד תלוי בגורמים glia-המופרשים להקמת שידור סינפטית. לפיכך, אנו מתארים גם שיטה עבור נוירונים co-culturing ותאי גליה בסידור ללא מגע. באמצעות שיטות אלה, זיהינו הבדלים משמעותיים בין הפיתוח של הרשתות הנוירורגיות וglutamatergic. כך, לימוד תרבויות של נוירונים מטוהרים יש פוטנציאל גדול לקידום ההבנה שלנו איך מערכת העצבים מפתחת ופונקציות. יתר על כן, תרבויות מטוהרים עשוי להיות שימושי עבור חקירת הפעולה הישירה של סוכני תרופתי, גורמי גדילה או לחקור את ההשלכות של מניפולציות גנטיות על סוגי תאים ספציפיים. ככל שחיות יותר ויותר טרנסגניים הופכות לזמינות, מתייג סוגים נוספים של סוגי תאים מסוימים, אנו מצפים שהפרוטוקולים המתוארים כאן יגדלו בישימות ובפוטנציאל שלהם.

הדיסוציאציה ומיון התא של נוירונים פלורסנט מפני העכבר הטרנסגניים או העכברוש cortico-היפוקמאל רקמות ניתן לבצע בערך 3 – 4 h. התוצאה היא אוכלוסיה של נוירונים טהורים מאוד הניאון, אשר ניתן לגדל בתרבות במשך 16 ימים.
כדי ליצור תרבויות מטוהרים, בעלי חיים הטרנסגניים זוהו לראשונה באמצעות מנורת פלורסנט עם ערכות סינון המתאים (דוגמאות של ונוס הפלואורסצנטי VGAT ו-NexCre ונים; Ai9 גורי העכבר מוצגים באיור 1A). בעקבות הזיהוי של בעלי חיים טרנסגניים, לגזור רקמה היה הנתק, ואת הנוירונים הניאון החזק ביותר היו ממוינים כדי לייצר אוכלוסיית תאים מטוהרים. דוגמה מגרשים בעוצמה פלואורסצנטית נקודה עבור NexCre; Ai9 ו VGAT ונוס נוירונים העכבר, המתקבלים במהלך FACS, מוצגים באיור 1B. כאשר אופטימיזציה, ניתן לקצור בין 500,000 ו 800,000 תאים מן הקליפה ואת ההיפוקמפוס של הפרט P0-2 NexCre. Ai9 או העכברים של ונוס VGAT. תאים ניתן למיין במהירות כלפי מעלה של 600 אירועים/s. הערכות של טוהר התא בוצעו באמצעות DAPI כסמן גרעיני (איור 1C). על ידי מיון תאים חיוביים מאוד, טוהר של יותר מ 97% ניתן להשיג באופן שגרתי7.
בעקבות מיון מוצלח, נוירונים מצופה צריך להופיע סביב הצורה, יש ממברנה חלקה יש לראות נבט neurites לאחר כ 1 h ב מבחנה (איור 2A, B). על ידי 7 ימים של מבחנה, למרות כמה מוות תאים עשוי להיות גלוי, תאים קיימא צריך להיות נוכח בכל תנאי התרבות (איור 2C, D). בגיל 12-16 ימים בתחום החוץ, באמצעות הקלטות מהדק-הדבקת תאים וביולוציטין מילוי15, ניתן לחקור את ההתפתחות האלקטרולוגית והאלקטרו-פיזיולוגית של הנוירונים המטוהרים (איור 3). ניתוח של תרבויות מטוהרים חושף כי הן הנוירונים glutamatergic ו-gabaergic הצליחו להאריך אקסונים ו דנדריטים מגופם תאים (איור 3a, B) ולשמור על היכולת ליצור פוטנציאל פעולה בתגובה suprathreshold הקיטוב זריקות הנוכחי (איור 3C, D). בעיקר, עם זאת, בעקבות טיהור, רק הנוירונים GABAergic שהתקבלו כמויות משמעותיות של שידור סינפטית ספונטנית, ואת הנוירונים glutamatergic לקבל הילוכים הסינפטית מעט מאוד בהעדר תאי גליה (איור 3E , F) 7. לאחר מכן
כפי שדווחו בעבר, תאים בתרבויות מטוהרים נוטים לשרוד גרוע יותר מאשר אלה בתרבויות שאינן ממוינות ויש להם דנדריטים קטנים באופן משמעותי ו אקסונים7. כדי להתגבר על החסרונות הללו, יש לנו שיטות מותאם ומיושם לתמיכה בפיתוח של תרבויות מטוהרים עם תאים גליה12,14. הרכב הסלולר של תרבויות התמיכה גליה שלנו (DIV7) מוצג באיור 4a. התרבויות הללו הכילו חלבון חומצי בעיקר מסוג גליה fibrillary (gfap) האסטרוציטים חיוביות, אבל גם הכילו כמה מקבץ של מולקולה בידול (CD11b) מיקרוגליה חיוביים וחלבון בסיסי המיאלין (mbp) oligodendrocytes הפוך חיובית. לאחר DIV 7, תאים אלה יכולים להיות מיושנים לתוך מוסיף תרבות התא כדי לספק תמיכה ללא מגע של נוירונים מטוהרים (איור 4B, C). ניתוח של glia-נוירונים שיתוף תרבויות מגלה כי כ 40,000 התאים גליה היו מספיקים כדי לשפר את ההישרדות לטווח ארוך וצמיחה של שני glutamatergic מטוהרים ו gabaergic נוירונים (איור 4d, E)7. יתר על כן, ניתוח אלקטרולוגי מגלה כי הנוירונים glutamatergic, co-תרבותי עם תאי גליה, היו פעילים מאוד והיה מוגבר מאוד פעילות הרשת (אחוז של גליה נתמך glutamatergic הנוירונים יורה התפרצויות של פעולה פוטנציאל: 62%; n = 28; איור 4F , G). תמיכה glial ולכן חשוב לא רק לקידום הצמיחה העצב והישרדות, אלא גם לקידום שידור סינפטית והקמת פעילות הרשת בתרבויות glutamatergic.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58974/58974fig1.jpg"> איור 1: טיהור הglutamatergic והנוירונים הגאייגיים. (א) תמונות המציגות אות פלורסנט מהביטוי הטרנזגנטי של TdTomato בנקמין; Ai9 עכברים (למעלה) ונוס בעכברים VGAT ונוס (למטה). קנה מידה ברים = 5 מ"מ. (ב) עוצמה פיזור מגרשים של TdTomato ו ונוס הזריחה של היפוטיקו-ההיפוקמאל תאים הנתק מתוך nexcre; Ai9 עכברים (למעלה) ועכברים VGAT ונוס (למטה). מאוד פלורסנט TdTomato או ונוס נוירונים נבחרו עבור מיון (המצוין על ידי תיבות ה, לעבור). (ג, שמאל) תמונות confocal וקד של TdTomato ממוין (למעלה) ו ונוס (למטה) נוירונים חיוביים. (ג, ימין) תמונה ממוזגת המציגה תאים מוכתמים באמצעות DAPI (בצבע כחול-מדומה). זריחה TdTomato הוא אנדוסוגני והוא נשאר חזק למרות הקיבעון (בצבע פסאודו מגנטה). ביטוי ונוס משופר באמצעות שילוב של נוגדן העיקרי בבימויו של GFP ו אלקסה Fluor-488-מצומת נוגדן משני (בצבע מדומה ירוק). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58974/58974fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58974/58974fig2.jpg"> איור 2: תרבות התא של glutamatergic מטוהרים או הנוירונים. (A) תמונות אינפרא-אדום (שדה בהיר) משולב עם אות פלורסנט מתוך TdTomato (משמאל) ו-ונוס (מימין) נוירונים בצורה חיובית תרבותית עבור 1 h ב מבחנה. חיצים לבנים מציינים את המיקום של neurites גדל. (ב) מיקוד תמונות של TdTomato (משמאל) ו ונוס (מימין) נוירונים בצורה חיובית תרבותית עבור 1 h ב מבחנה. (ג, ד) שדה בהיר (למעלה) ומשולבים בתמונות פלורסנט (למטה) של TdTomato (C) ו-ונוס נוירונים (D) תרבותי במשך 7 ימים בתחום החוץ (DIV). חיצים לבנים מראים את המיקום. של גרעין מרוכז מתאים מתים חיצים צבעוניים לזהות הנוירונים בעלי תווית בעקשנות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58974/58974fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58974/58974fig3.jpg"> איור 3: תכונות מורפולוגיות, אלקטרופיזיולוגיות וסינפטית של נוירונים מטוהרים. (א, ב) תמונות confocal וקד של TdTomato (A) ו ונוס חיובי נוירונים (ב) ב DIV 13 ו-DIV 14, בהתאמה. תאים מוצגים בשחור באמצעות שולחן המראה הפוכה כדי לסייע neurite הדמיה. מערכות insets מציגות את אות הפלורסנט המבוטאת על ידי הנוירונים שזוהו. (ג, ד) תגובת מתח של TdTomato (ג) ו-ונוס תא העצב (D) כדי להיפרפולזציה (200 to-20 הרשות הפלסטינית, ב 20 הצעדים הפלסטינית) ו לבצע הקיטוב (200 pA) הזרמים הנוכחיים, המתקבלים על ידי הקלטה שלמה של התיקון-מלחציים. Insets להציג את הנוירונים המוקלט המתאימים. פוטנציאל הממברנה המנוחה של כל תא מסומן משמאל למעקב אחר ההקלטה. (E, F) הקלטות מהדק מתח הנציג (10 s) המתקבלים TdTomato (E) ו-ונוס הנוירונים חיוביים (F). האירועים הEPSCs מרגש ספונטנית (הקלטה) הוקלטו מתוך נוירונים חיוביים TdTomato, מתוחזק בפוטנציאל מחזיק של 50 mV. באופן ספונטני אירועים פוסט סינפטית מעכבות (IPSCs) נרשמו מתוך ונוס הנוירונים חיוביים המתוחזקות בפוטנציאל מחזיק 0 mV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58974/58974fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58974/58974fig4.jpg"> איור 4: תמיכה בפיתוח תא העצב עם שיתוף התרבות גליה. (א) מיקוד תמונות של תרבויות גליה החיסונית עבור גליה fibrillary חלבון חומצי (gfap, שמאל), אשכול של מולקולה בידול (CD11b, באמצע) וחלבון בסיסי המיאלין (mbp, ימין). תאים גליאל היו מתורבתים עבור DIV 7. (ב) תמונות של תרבות התא מוסיפה לשימוש בתאי גליה משותפים עם נוירונים מטוהרים בסידור שאינו קשור למגע. (ג) סכמטי של ההסדר המרחבי המשמש לשיתוף הנוירונים והתרבות של גליה. (ד, ה) תמונות confocal וקד של tdtomato (D) ו-ונוס הנוירונים חיוביים (E), גדל עבור 14 ימים, בהעדר (שמאל) או נוכחות (מימין) של תמיכה גליה. (F, G) הקלטות נוכחיות-קלאמפ (60 s) מ-tdtomato (F) ו-ונוס נוירונים (G) תרבותית עבור 14 ימים בהעדר (למעלה) או נוכחות (למטה) של תמיכה גליה. נוירונים הוקלטו הפוטנציאל שלהם הממברנה מנוחה (מוצג משמאל של כל מעקב הקלטה). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58974/58974fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting at JoVE.com

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

פרוטוקול זה מתאר מיון תא שיטה מבוססת על טיהור ותרבות של GABAergic פלורסנט או glutamatergic נוירונים מקליפת המוח וההיפוקמפוס של עכברים לאחר הלידה או חולדות.

התא הראשי תרבות של מטוהרים GABAergic או Glutamatergic נוירונים הוקמה באמצעות מיון תאים פלואורסצנטית מופעל

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...

פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה לשחזור לטיהור ולכתה של סוגים מסוימים של נוירון ראשי. תרבויות אלה מתאימות לניתוח אלקטרופיזיולוגי, מורפולוגי והישרדותי. תרבויות של נוירונים מטוהרים ניתן להשתמש כדי ללמוד יסודות של פיזיולוגיה עצבית, היווצרות של סינפסות, כמו גם איך רשתות עצביות לפתח.בעוד אנו מתמקדים בתאים ראשיים גלוטמטרגיים קליפת המוח ו interneurons GABAergic, הליך זה ניתן לשנות בקלות כדי ללמוד את כל הקווים העצביים המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים. כדי להכין כיסויי זכוכית, הראשון להפשיר aliquot חמישה מיליליטר של 200 מיקרוגרם לכל פתרון PLL מיליליטר. לדלל פתרון מלאי זה 20 מיקרוגרם למיליליטר על ידי הוספת 45 מיליליטר של מים כיתה הזרקה טהורה.ואז לסנן לעקר את הפתרון לתוך צינור חרוט חדש 50 מיליליטר ולתייג את הצינור הזה כמו PLL סטרילי. לאחר מכן, מניחים 100 כיסויי זכוכית סטריליים עגולים 12 מילימטר בתתברית PLL סטרילית. להתסיס את הצינור כל חמש עד 10 דקות במשך שתיים עד שלוש דקות כדי להבטיח אפילו ציפוי.לאחר 40 דקות של ציפוי PLL, לקחת שתי חתיכות של נייר טישו ולהניח אותם שטוחים בארון הזרימה. לעקר את הנייר באמצעות 70%אתנול ואז לשטח כדי להסיר קמטים ולהשאיר להתייבש. לאחר ציפוי כיסויי הזכוכית במשך שעה אחת עם PLL, להסיר פתרון PLL עודף ולהוסיף מים כיתה הזרקה סטרילית.התסיס בעדינות את הכיסויים למשך שתיים עד שלוש שניות כדי להסיר PLL עודף. חזור על שלב שטיפה זה פעמיים נוספות. הסר מים עודפים ולאחר מכן להעביר את הכיסויים לנייר טישו סטרילי.לאחר התייבשות, מעבירים את הכיסויים לצלחת תרבות של 24 בארות. כדי להכין את פתרונות תרבות התא, למדוד את 12 מיליליטר של מאגר תרבות התא לצינור חרוט 15 מיליליטר תווית כמו BSA. למדוד את חמישה מיליליטר של חיץ תאים לצינור 15 מיליליטר שונה תווית כמו פפאין.לאחר מכן, דגירה שני הצינורות במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. הוסף 120 מיליגרם של BSA לצינור שכותרתו BSA. ואז להפוך את הצינור כדי לעזור להמיס את הפתרון.ואז להוסיף שבעה מיליגרם של פפאין לצינור שכותרתו פפאין. מחזירים את שני הצינורות לאמבט המים למשך 15 דקות. מסנן לעקר את פתרון BSA לתוך צינור חרוט טרי.חלק את פתרון ה- BSA הסטרילי לשלושה צינורות ותייג כל צינור כסטרילי של BSA ואחד, שניים או שלושה. עכשיו לסנן לעקר את צינור פפאין ולתייג את הצינור כמו פפאין סטרילי. מחזירים את כל הצינורות לאמבט המים וממשיכים להתהגר ב-37 מעלות צלזיוס עד לשימוש.כדי להתכונן לנתח רקמות, הניחו את האזמל, המספריים, המדפים והמתילה הדרושים לניתוח ההיפוקמפוס וקליפת המוח. מניחים שתי מנות פטרי 35 מילימטר צלחת פטרי 100 מילימטר המכיל נייר מסנן סטרילי בארון הזרימה. לאסוף NexCre מהויר; Ai9 או כלי רכב גאבא טרנספורטר ונוס עכבר גורים כי הם להיות ניתוח באמצעות מנורה פלואורסצנטי עם מסנני קריאה ופלטה מתאימים להפלות גורים פלואורסצנטיים מן בני זוג ליטר סוג בר.מיד לפני לנתח את בעלי החיים, למלא כל צלחת פטרי עם חיץ תרבות תאים סטריליים מצוננים. לאחר הניתוח, מעבירים בזהירות את מוחו של הגור הטרנסגני לנייר סינון סטרילי. ראשית, לנתח את המוח הקטן ולהפריד בין שתי ההמיספרות.לאחר מכן הפרד בזהירות את ההיפוקמפוס וקליפת המוח מכל חצי כדור. מעבירים את הרקמה המנותקת לצלחת פטרי 35 מ"מ המכילה חיץ תרבות תאים צוננים. לאחר מכן מעבירים את ההיפוקמפוס וקליפת המוח שנותקו למכסה של צלחת פטרי נוספת של 35 מ"מ.בעזרת הקצה השטוח של להב אזמל, קוצצים בזהירות את הרקמה בתנועה חוצה עד שנותרו רק חלקים קטנים. לאחר מכן, להעביר את הרקמה הקצוצה עם כמות קטנה של פתרון פפאין מן המכסה צלחת פטרי לצינור פפאין סטרילי. דגירה הרקמה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 25 דקות.לאחר דגירה פפאין, להעביר את צינור פפאין סטרילי צינורות BSA סטריליים לארון הזרימה. ואז להשתמש פיפטה פסטר מיליליטר אחד להעביר רק את רקמת קורטיקוהיפוקמפוס מצינור פפאין לתוך הצינור BSA אחד. על מנת לשבור את כל גושים גדולים של רקמה, triturate הרקמה מספר פעמים באמצעות פיפטה פסטר מיליליטר אחד.לאחר מכן, triturate הרקמה שבע פעמים באמצעות פיפטה פסטר עצה בסדר. לאחר 30 שניות, להעביר מיליליטר אחד של הפתרון התחתון ואת הרקמה מצינור BSA אחד לצינור BSA 2. טריטוראט הרקמה בצינור BSA פעמיים מספר פעמים באמצעות פיפטה פסטר עצה בסדר.לאחר טריטורציה, להעביר מיליליטר אחד של הרקמה התחתונה פתרון מצינור BSA אחד לצינור BSA שלוש. טריורט את הרקמה בצינור BSA שלוש פעמים. לאחר טריטורציה, להעביר את כל הפתרון ואת הרקמה מצינורות 2 ו -3 לתוך צינור BSA אחד.טריטוראט פעמיים עד שלוש פעמים נוספות וצנטריפוגה ב 3,000 פעמים g במשך שלוש דקות. לאחר צנטריפוגה, להסיר בזהירות את supernatant מן הרקמה גלולה resuspend התאים באמצעות פיפטה P1000 בשני מיליליטר של שנת חורף מלאה מדיום פלואורסצנטי נמוך. לאחר מכן triturate הרקמה 20 פעמים כדי להבטיח התכווצות מלאה של פתרון הרקמה.לאחר מכן, filer ההשעיה התא דרך מסמר תא 30 מיקרומטר לתוך צינור מדגם פוליסטירן. הכן צינורות איסוף מיון תאים על ידי צינורות 300 microliters של שינה מלאה מדיה למספר הנדרש של צינורות פוליפרופילן. כדי שכל סוג תא פלואורסצנטי ימוין, בחר את מסנני העירור וההפחתה המתאימים.לרגש חלבון ונוס באמצעות 488 ננומטר אורך גל העירור ולזהות את האור הנפלט דרך 530/40 מסנן פליטה להגדיר. Excite חלבון TdTomato באמצעות 531 אורך גל העירור ננומטר ולזהות את האור הנפלט דרך 575/30 מסנן פליטה להגדיר. לקבלת טוהר גבוה, מיין תאים פלואורסצנטיים בעלי תווית בהירה.לאחר מיון התאים, מעבירים את התאים שנאספו לשני צינורות צנטריפוגה עגולים עגולים של שני מיליליטר. ואז צנטריפוגה התאים ב 3, 000 פעמים g במשך שלוש דקות כדי ליצור גלולה תא. תן שימוש חוזר לכדור התא בכמות הנדרשת של מדיום NBA מלא מחומם מראש כדי להשיג צפיפות תאים של 1,000 תאים למיקרוליטר.כדי לאשר את נוכחותם של תאים דיסוציאציה, בדוק את פתרון התא תחת מיקרוסקופ באמצעות עדשה אובייקטיבית 4X או 10X. לפני ציפוי התאים, מערבולת במהירות בינונית במשך שתיים עד שלוש שניות כדי להבטיח השעיה תא אפילו. בעקבות מערבולת, במהירות pipette 10 microliters של ההשעיה התא למרכז של כל כיסוי.לאחר שעה, להאכיל את התאים עם 500 microliters של מדיום ה-NBA מלא מחומם מראש ולחזור לחממה ב 37 מעלות צלזיוס. כדי לתרבת במשותף את הנוירונים המטוהרים ואת תאי הגלישה, מעבר תאים גליה למספר הנדרש של תרבות התא מוסיף. זה נעשה על ידי ציפוי 40, 000 תאי גלייה ב טיפה 500 microliter של מדיום NBA מלא.לאחר שעה אחת, העברת תרבות תא גליה מוסיף נוירונים מטוהרים. הסר מדיה עודפת מהתוספות התרבותיות והחזר את הצלחות לאינקובטור לצורך פולחן. לאחר מיון מוצלח, נוירונים מצופים צריכים להופיע עגולים בכושר עם קרום חלק ויש לראות כדי לחסוך נוירואידים לאחר כשעה במבחנה.על ידי שבעה ימים במבחנה, למרות כמה מוות תאי עשוי להיות ברור, תאים קיימא צריך להיות נוכח בכל תנאי התרבות. ניתוח של תרבויות מטוהרות מגלה כי הן נוירונים גלוטמטרגיים ו GABAergic הצליחו להאריך אקסונים ודנדריטים מגופם התא ולשמור על היכולת ליצור פוטנציאל פעולה בתגובה סף סופר depolarizing זריקות הנוכחי. יש לציין כי בעקבות הטיהור, רק תאי עצב GABAergic קיבלו כמות משמעותית של שידור סינפטי ספונטני נוירונים גלוטמטרגיים קיבלו שידור סינפטי מעט מאוד בהיעדר תאים גליה.חשוב לציין, culturing נוירונים מטוהרים עם תאים גליה משפר את הצמיחה וההישרדות של נוירונים, כמו גם קידום שידור סינפטי בתרבויות גלוטמטרגיות. ציפוי קיטוב מספיק של הכיסויים ושמירה על ה- pH הפיזיולוגי של תקשורת התרבות לאורך כל ההליך הם המפתח להבטחת תרבויות תאים באיכות טובה. בעקבות פרוטוקול זה, זה צריך להיות אפשרי לבצע רצף RNA וספקטרוסקופיה מסה חלבון על תרבויות מטוהרות המאפשר תהליכים תרגום שעתוק להיחקר בסוגים עצביים ספציפיים.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

נוהל אופטימליים עבור Fluorescence המופעל בידוד מיון (FACS) תא של אבות עצביות האוטונומית מאיברים בטן של עכברים עוברית

During development neural crest (NC)-derived neuronal progenitors migrate away from the neural tube to form autonomic ganglia in visceral organs like the ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

המפרט של נוירונים glutamatergic Telencephalic מתאי גזע pluripotent אדם

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

סידן פוספט Transfection של ראשוני נוירונים בהיפוקמפוס

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

יסודי תרבות של עכבר דופאמין נוירונים

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

ביטוי גנים מסוג התא ספציפי באמצעות סלולארי קרינה המופעל מיון לבדיקת רקמות במוח החולדה

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

רקמות קרינה הופעלו מיון תאים (FACS) וניתוח ביטוי גנים של נוירונים Fos להביע מ טרי קפוא מוח החולדה

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

התרבות הראשית של הנוירונים מבודדים מתוך עכבר ממוח עובריים

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

הגירה, כימותרפיה-אטרקציה, ושיתוף התרבות Assays בשביל הגזע האנושי תאים הנגזרת האנדותל והנוירונים

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

בליסטי לתיוג של הנוירונים בתוך המוח בפרוסות ובתרבות התא הראשוני

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...