Name: primary cell culture of purified gabaergic or glutamatergic neurons established through fluorescence-activated cell sorting
Uploaded: 2019-06-06T13:00:00
Duration: 10 min 57 s
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筆者は、ジェニー・キルシュとアナ Teichmüller が、フローサイトメトリー・コア施設、ドイツ Rheuma ・ Forschungszentrum、ベルリンで提供されている優れた技術サポートに感謝したい。私たちは、生存分析の彼の助けのためのジエの歌に感謝したいと思います。また、プロトコルの批判的な読書のための蛍光マウスとキリスト教のエブネルの画像をキャプチャする彼女の助けのためにリタ Loureiro に感謝したいと思います。VGAT トランスジェニックラットは、宮脇博士によって提供された pCS2 ・ヴィーナスを用いて、日本の岡崎自然科学研究所において、柳川氏、平林、川口氏によって作製した。この作品は、ドイツの研究評議会によってサポートされました (Forschungsgemeinschaft, DFG EXC 257 IV).

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著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

ここでは、一次ニューロンの選別と培養を組み合わせて、精製された神経細胞培養を生成する方法について述べる。この方法は、典型的な主に解離したニューロン培養プロトコルよりも約1時間長くかかりますが、特定のニューロンタイプを含む何百もの反復培養を生成することができます。精製されたニューロンは、少なくとも16日間分離して成長することができ、軸索およびデンドライトを延長し、反復する運動電位の列車を発射することができる (図 2および図 3)。重要なことに、これらの細胞は、電気生理学的、形態学的および生存の分析を含む、通常の主要なニューロンの解離と同じ実験分析に従うことができる。これらの精製された培養物を用いた作業の主な利点は、特定の細胞型の開発を単独で研究することができることである。また、精製培養の開発を支援するために、グリア細胞と精製したニューロンを共培養するためのプロトコールを提示している。前に示したように、グリア細胞との精製されたニューロンの共培養は、それらの生存を改善し、増殖およびネットワーク形成7を促進することができる (図 4)。そこで、我々は、グリアニューロン相互作用の研究をさらに進めるべき方法の組み合わせをここに提示し、関心のある他の細胞タイプの間の発達および相互作用を研究するのに有用であることを証明することができる。
精製 glutamatergic ニューロンの培養に関する研究は、グリア細胞が神経ネットワークおよびシナプス形成の発達を促進する因子を分泌する方法に関する基礎的な洞察を明らかにした16,17,18.一般に、特定のニューロン型を精製するための方法は、GABAergic ニューロンではなく glutamatergic ニューロンの開発を研究するためにより首尾よく適用されている。このことが、この2つの細胞の種類の理解に格差をもたらしています。GABAergic と glutamatergic ニューロンは、解剖学、生理学、発達の起源に関して大きく異なるため、GABAergic ニューロンを自らの権利で研究し、その機能と生理学をよりよく理解することが重要です。ここで提示されたプロトコルを用いて、GABAergic および glutamatergic ニューロンがシナプス伝達7の確立のためのグリア分泌因子に依存する方法における重要な相違を以前に同定した。このプロトコルを公開することにより、他の人がニューロンとグリア細胞間の重要な相互作用についてさらに洞察を得ることを願っています。
このプロトコルでは、異なるトランスジェニックげっ歯類の GABAergic または glutamatergic ニューロンを精製するために使用したフローサイトメトリーベースの細胞分類法について述べる。Venus 陽性 GABAergic ニューロンは、VGAT ヴィーナスマウス13またはラット8および TdTomato 陽性 glutamatergic ニューロンから選別され、NexCre から選別された。Ai9 マウス (NexCre9および Ai9 レポーターライン6から元々飼育される、Turko et al., 20187) を参照のこと。近年、技術の進歩により、トランスジェニック動物の生成が著しく容易になっている。このように、蛍光分子を発現する動物の利用可能性は、多くの異なる細胞タイプにおいて、急速に成長してきた。これは、順番に、蛍光活性化細胞選別の使用および適用性を増加させた。対象となる細胞を単離するための代替方法は現在16、19、20存在するが、それらは自然発生表面に対する適切な抗体の利用可能性に依存することによって幾分妨げられている抗原。これは、既に利用可能である多くの細胞特異的トランスジェニックレポーター動物から細胞を選別するために既に使用することができる蛍光ベースの細胞選別方法と比較すると、その汎用性を制限する。それにもかかわらず、最適化された場合、抗体ベースの選別法は迅速かつ高収量であり、軸索およびデンドライトがそのままで細胞を精製できるため、細胞解剖学をより良好に保存することができる。したがって、抗体選別法は、ソート戦略を決定する際に考慮されるべきである。最終的に、関心のある細胞タイプ、細胞が選別される年齢、トランスジェニック動物または表面抗原の利用可能性および細胞数が最も適切な選別戦略を選択する際の決定要因となるであろう。
蛍光ベースの細胞選別は、細胞を精製するための簡単で再現性のある方法ですが、細胞の品質を維持するためには、プロトコルの特定の段階で注意する必要があります。例えば、各遠心分離ステップに続いて、細胞ペレットが可能な限り迅速に再懸濁され、細胞が正常に回収されたことを確認することが重要である。時折、細胞ペレットは、上清を除去する際に妨げられ得る。したがって、遠心分離ステップの間に、広範囲の細胞損失を除外するために顕微鏡下の細胞の存在をチェックすることが推奨される。細胞めっきに続いて、細胞は、摂食前に少なくとも1時間接着することを許されるべきである。細胞があまりにも早く供給されると、いくつかの細胞がカバースリップから外れてしまい、それによって培養密度が低下することがある。培養中の1時間後、細胞の健康を評価することが賢明である。細胞が正常に見えない (健康な細胞の例が図 2aに示されている) 場合、または有意な細胞死がある場合、これは、解離または選別手順の間の問題を示す可能性がある。さらに重要な考慮事項は、任意の細胞型を培養する際に、細胞培養培地を管理する際に注意を要することである。NBA メディアは、pH インジケータ22として機能するフェノールレッドが含まれています。メディアの色が黄色くなりすぎると、pH が酸性になりすぎることを示します。メディアがピンク色になると、溶液のアルカリ性が強すぎることを示します。長期間開いているストックソリューションは、特に円錐管に等分メディアは、時間の経過とともによりアルカリ性になる傾向がある。したがって、新鮮な完全 NBA メディアを毎週作成し、2週間ごとにメディアを完成させることをお勧めします (中程度のバッファーは大気条件下で、より安定している必要があります)。これらの点を考慮して、細胞選別および細胞培養装置へのアクセスを備えた任意の実験室において、精製細胞培養を確立することが可能でなければならない。
私たちの実験の大部分では、単一の動物から精製された培養物を製造しました。しかし、生化学的分析のために細胞を精製する場合、ソートのために複数の動物を一緒にプールする必要があるかもしれません。私たちは、上記のプロトコル (データは示されていません) を使用して8つの胚マウス (胚日13匹) まで正常に選別しました。しかし、より多くの動物を選別する場合、組織量の増加に対応するために、パパインと BSA ソリューションの両方の量を増やす必要があるかもしれません (手順 2.1.1-2.1.4 で説明)。さらに、より多くの細胞が培養物にめっきされる場合、より頻繁な供給スケジュールが必要とされ得る。出発点として、細胞は調節された媒体の100μ l を除去し、新鮮で完全な NBA の媒体の200μ l を加えることによって7日ごとに毎日供給することができる。ニューロンの生存性のために, より多くの動物を並べ替える場合, できるだけ多くのソート時間を最小限に抑えるために考えられるべきである.これは、多くの場合、精製細胞を効率的に使用するために下流分析を慎重に最適化する必要があります。私たちは日常的にマウスニューロンを600イベント/秒、最大500000–800000細胞 (生後 0 ~ 2) の割合でソートしています。しかし、これはソート速度と条件を徹底的に最適化することができませんでした。したがって、ソート速度および歩留まりのさらなる改善が可能であるべきである。
精製されたニューロンは、生存のためにグリアに調節される培地を必要とする。これは、ニューロンおよびグリア細胞を別々に培養することによって以前に実証されており、グリアを調節した培地10でニューロンを処置する前に。実験では、細胞培養プレート内に配置された半透過性の細胞培養インサートでグリア細胞を培養することにより、精製ニューロンを支持することを選択しました。この方法は、グリア由来の細胞外マトリックスタンパク質およびニューロン12との相互作用を研究するために首尾よく適用されている。非接触であるが、この方法によって提供される継続的な支持体は、細胞の別個の培養物と比較した場合の多くの利点を有する。最も顕著なのは、ニューロンを有するグリア細胞の共培養は、細胞培養培地の連続的な調節およびコンディショニングを可能にする、インビボの状況により密接に類似している。加えて、細胞の連続的な共培養は、ニューロンとグリアとの間の潜在的なフィードバックシグナル伝達を可能にするが、これは分離された培養物では不可能である。私たちのプロトコルでは、必要に応じて、連続的な共培養法を容易に省略することができ、グリアに調整された媒体を有するニューロンの古典的な治療を行うことができる。
要約すると、ここで提示されるプロトコルは、彼らが独自の精製された細胞培養実験を確立することができる強固な基盤を読者に提供することを目的とする。我々は、トランスジェニック動物及びウイルス構築物の利用可能性が当面の間増加し続けることを予測する。したがって、蛍光に基づく細胞選別技術は、さらに広く用いられ、かつ有用となる可能性が高い。

細胞選別は、細胞の不均一な混合物から関心のある生細胞を単離するための強力なツールです。細胞は、サイズと形状の基準だけでなく、蛍光マーカー1,2の発現に基づいて並べ替えることができます。多くの場合、蛍光色素共役抗体は、細胞特異的な表面抗原3,4を標的として、異なる細胞タイプにラベルを付けるために使用されます。あるいは、トランスジェニック動物またはウイルス送達系は、細胞特異的プロモーター5、6の下で蛍光色素を発現するように設計されている。歴史的に、トランスジェニックツールおよび動物の開発は、費用と時間を要した。最近では、コストの削減と技術的な問題の減少によって、使用できるレポーターラインの数が劇的に増加しました。トランスジェニックツールおよびレポーター動物の利用可能性が成長し続けるにつれて、蛍光ベースの細胞選別法の有用性および適用可能性も同様である。
我々は、最近、細胞培養7に備えて一次ニューロンを精製するためにトランスジェニック動物からの細胞選別を日常的に適用することができることを実証した。ラットまたはマウスのいずれかから細胞を選別することにより、蛍光ニューロンを分離および培養することができ、GABAergic または glutamatergic ニューロンのいずれかで特異的に蛍光レポータータンパク質を発現することが可能である6、8、9。これらの精製されたニューロン培養を研究することにより、GABAergic および glutamatergic ニューロンがシナプス伝達7の確立のためのグリア分泌因子に依存する方法における重要な相違を同定することができた。さらに、精製されたニューロンとのグリア細胞の共培養によって、グリア細胞がニューロン10、11の増殖および生存において果たす重要な役割を示す以前の観察にも拡張することができた。このように、細胞選別と細胞培養を組み合わせることで、特定のニューロンタイプの開発だけでなく、その機能に対するグリア細胞の影響を調べることができました。
ここでは、トランスジェニックマウスまたはラットの皮質および海馬からの GABAergic および glutamatergic ニューロンの精製および培養のためのプロトコルをここに提示する。また、Geissler et al.12から適応した、精製ニューロンおよびグリア細胞の非接触共培養のための方法も提示する。精製された GABAergic 培養物を生成するために、我々は、VGAT-ヴィーナス-ウィスターラット8または VGAT-ヴィーナスマウス13から蛍光ニューロンを選別し、強化された黄色蛍光タンパク質変異体 (Venus) を選択的に発現する > 95% の皮質 GABAergic ニューロン.精製された glutamatergic 培養物を生成するために、NexCre から蛍光ニューロンを選別しました。Ai9 マウス6,9は、皮質 glutamatergic ニューロンにおいて tdTomato を発現する。全体の選別および培養手順は 3-4 h 内で行うことができ、電気生理学的、形態学的および細胞生存分析に適した数百の複製培養物を生成するために使用することができる。この方法は、単純で再現性があり、対象の細胞タイプに対して純度 97% を超える精製ニューロン培養を生成することができます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Neural Basal A media (NBA)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10888022</td>
			<td>Cell Culture Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17504001</td>
			<td>Culture supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>35050-038</td>
			<td>Culture supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P1399</td>
			<td>Coverslip coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P4762-1G</td>
			<td>Enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A3294-100G</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hibernate A low fluorescence media</td>
			<td>Brain Bits Ltd</td>
			<td>HALF</td>
			<td>Cell Transport media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM)</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>F0435</td>
			<td>Glial Culture Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>S0115</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin / EDTA</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L2163</td>
			<td>Enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Tip Pasteur Pipette</td>
			<td>Neo Labs</td>
			<td>-</td>
			<td>Used for trituration of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>BD</td>
			<td>353047</td>
			<td>Culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>352070</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>352096</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips: 12 mm round</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P231.1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353001</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 &#181;m CellTrics Cell Sieve</td>
			<td>sysmex</td>
			<td>04-004-2326</td>
			<td>To remove cell clumps before cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottom polystyrene tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>352054</td>
			<td>Transport tube for sorted cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottom polypropylyne tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>352063</td>
			<td>Collection tube for sorted cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture inserts &#8211; 0.4 &#181;m transparent PET</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353 095</td>
			<td>For the co-culture of neurons and glia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra fine Bonn Scissors</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>14084-08</td>
			<td>To remove overlying skin and bone of mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra narrow Scissors</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>14088-10</td>
			<td>To remove overlying skin and bone of rats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>11242-40</td>
			<td>To hold the head in place</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula (130 mm long / 5 mm tip width)</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>3006.1</td>
			<td>To remove the brain to filter paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blades</td>
			<td>Swan-Morton</td>
			<td>#0308</td>
			<td>To mechanically dissociate neural tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemocytometer (Neubauer Imroved)</td>
			<td>Optik Labor</td>
			<td>-</td>
			<td>To cell count dissociated cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Miners Goggles (excitation light)</td>
			<td>Biological Laboratory Equipment 
			Maintenance and Servce Ltd (BLS)</td>
			<td>FHS/LS-1G</td>
			<td>To excite TdTomato</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Miners Goggles (emission filter)</td>
			<td>Biological Laboratory Equipment 
			Maintenance and Servce Ltd (BLS)</td>
			<td>FHS/EF-4R2</td>
			<td>Td Tomato compatible emission filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Miners Goggles (excitation light)</td>
			<td>Biological Laboratory Equipment 
			Maintenance and Servce Ltd (BLS)</td>
			<td>FS/ULS-02B2</td>
			<td>To excite Venus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Miners Goggles (emission filter)</td>
			<td>Biological Laboratory Equipment 
			Maintenance and Servce Ltd (BLS)</td>
			<td>FS/TEF-3GY1</td>
			<td>Venus compatible emission filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse-Anti-GFP primary antibodies</td>
			<td>UC Davis</td>
			<td>75-132</td>
			<td>To enhance Venus signal following fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse-Anti-GFAP primary antibodies</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G-3893</td>
			<td>The identification of reactive astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit-Anti-CD11b primary antibodies</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>1561-15</td>
			<td>The identification of microglial cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit-Anti-MBP primary antibodies</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB980</td>
			<td>The identification of oligodendrocyes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary cell culture of purified gabaergic or glutamatergic neurons established through fluorescence-activated cell sorting

このプロトコルの全体的な目標は、GABAergic または glutamatergic ニューロンのいずれかから派生した精製されたニューロン培養を生成することである。精製されたニューロンは、インビトロで16日間にわたって定義された培地で培養することができ、電気生理学的、形態学的および生存分析を含む解離した培養物に典型的に実施されるあらゆる分析に従順である。これらの培養物の主な利点は、グリア細胞または他のニューロンタイプから生じるような複雑な外的影響がない場合に特定の細胞型を選択的に研究することができることである。しかし、精製された細胞を用いて実験を計画する際には、ニューロンが成長と生存のためにグリアの調整を受けた培地に強く依存することに注意することが重要です。さらに、glutamatergic ニューロンは、シナプス伝達の確立のためのグリア分泌因子にさらに依存する。そこで我々は、非接触配列におけるニューロンとグリア細胞の共培養の方法についても述べる。これらの方法を用いて、GABAergic と glutamatergic ニューロンネットワークの開発の間の主な違いを特定しました。したがって、精製されたニューロンの培養を研究することは、神経系がどのように発達し機能するかについての理解を深める大きな可能性を秘めている。さらに、精製された培養物は、薬理学的薬剤の直接作用、増殖因子、または特定の細胞型に対する遺伝的操作の結果を調べるために有用であり得る。より多くのトランスジェニック動物が利用可能になるにつれて、関心のある追加の特定の細胞タイプにラベルを付け、ここに記載されたプロトコルがそれらの適用可能性および電位において成長することを期待する。

トランスジェニックマウスまたはラット皮質からの蛍光ニューロンの解離および細胞選別を、約3〜4時間で行うことができる。結果は、非常に純粋な蛍光ニューロンの集団であり、16日間培養で増殖させることができる。
精製培養物を生成するために、トランスジェニック動物を、適切なフィルターセットを有する蛍光灯 (蛍光性新生児 VGAT ヴィーナスおよび NexCre の例) を使用して最初に同定した。Ai9 マウスの仔を図 1aに示す)。トランスジェニック動物の同定に続いて、解剖した組織を解離し、そして最も強い蛍光ニューロンを選別して、精製された細胞集団を作製した。NexCre の蛍光強度ドットプロットの例;FACS 中に得られた Ai9 および VGAT ヴィーナスマウスニューロンを、図 1bに示す。最適化されると、個々の P0-2 NexCre の皮質および海馬から50万および80万細胞の間で収穫することができる。Ai9 または VGAT ヴィーナスマウス。細胞は、600のイベント/秒以上の速度で並べ替えることができる。細胞純度の推定値は、DAPI を用いて核マーカーとして行った (図 1c)。陽性細胞を強く選別することにより、97% 以上の純度を日常的に7個達成することができる。
成功した選別の後、めっきされたニューロンは、形状が丸く現れ、滑らかな膜を有し、インビトロで約1時間後に神経突起芽を見るべきである (図 2a、B)。インビトロで7日間によって、いくつかの細胞死が明らかであるかもしれないが、生存細胞はすべての培養条件下に存在すべきである (図 2c、D)。インビトロでの 12 ~ 16 日間において、細胞全体のパッチクランプ記録およびビオシチン15を用いて、精製されたニューロンの形態学的および電気生理学的発達を調査することができる (図 3)。精製された培養物の分析は、glutamatergic と GABAergic ニューロンの両方が、細胞体から軸索およびデンドライトを拡張することができたことを明らかにしている (図 3a, B) と応答してアクション電位を生成する能力を保持するsuprathreshold 脱分極性現在の注射 (図 3c, D)。しかし特に、精製後、GABAergic ニューロンのみが大量の自発的シナプス伝達を受け、glutamatergic ニューロンはグリア細胞が存在しない場合にシナプス伝達を非常にわずかに受ける (図 3e、F)7.
以前に報告したように、精製培養の細胞は、並べ替えられていない培養物よりも不十分であり、非常に小さなデンドライトと軸索があります。これらの欠損を克服するために、グリア細胞12,14を用いて精製された培養物の開発を支援するための適応および応用方法を行った。我々のグリア支持培養物 (DIV7) の細胞構成を図 4aに示す。これらの培養物は、主としてグリア線維性酸性タンパク質 (GFAP) 陽性アストロサイトを含んでいたが、分化分子のいくつかのクラスター (CD11b) 陽性ミクログリアおよびミエリン塩基性タンパク質 (MBP) 陽性のオリゴデンドロサイトを含んでいた。DIV 7 の後、これらの細胞を細胞培養インサートに継代して、精製ニューロンの非接触サポートを提供することができます (図 4b、C)。グリア-ニューロンの共培養の分析により、約4万のグリア細胞は、精製 glutamatergic と GABAergic ニューロンの両方の長期生存と成長を改善するのに十分であったことが明らかになった (図 4d、E)7。さらに、電気生理学的解析は、glutamatergic ニューロンが、グリア細胞と共培養され、非常に活発であり、かつネットワーク活性が強く増加していたことを明らかにした (glutamatergic ニューロンを支持したグリアの割合は、作用の破裂を発火するポテンシャル:62%;n = 28;図 4f、G)。したがって、グリアの支持は、ニューロンの成長と生存を促進するだけでなく、シナプス伝達を促進し、glutamatergic 培養におけるネットワーク活動を確立するためにも重要である。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58974/58974fig1.jpg"> 図 1: glutamatergic と GABAergic ニューロンの精製(A) NexCre の TdTomato の導入遺伝子発現からの蛍光シグナルを示す画像;VGAT ヴィーナスマウス (下段) に Ai9 マウス (上段) 及び金星。スケールバー = 5 mm。 (B) 皮質の TdTomato と金星の蛍光を NexCre から分離した細胞の強度散布図。Ai9 マウス (上段) および VGAT ヴィーナスマウス (下段)。強力な蛍光 TdTomato またはヴィーナスニューロンが選別のために選択されました (ゲーティングボックスで示される)。(C、左)ソートされた TdTomato (上) および金星 (下) 陽性ニューロンの共焦点画像。(C、右)DAPI で共染色した細胞を示す結合画像 (青色より疑似カラー)。TdTomato 蛍光は内因性であり、固定にもかかわらず強いままである (マゼンタ疑似カラー)。Venus 発現は、GFP およびアレクサ Fluor-488-共役二次抗体 (緑色の疑似カラー) に対する一次抗体の組み合わせを用いて増強される。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58974/58974fig1large.jpg" target="_blank">この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58974/58974fig2.jpg"> 図 2: 精製 glutamatergic または GABAergic ニューロンの細胞培養(A) 赤外線 (明視野) 画像を結合し、TdTomato (左) と金星 (右) 陽性ニューロンから蛍光シグナルを重畳して1時間インビトロで培養した。白い矢印は成長している神経突起の位置を示す。(B) TdTomato (左) と金星 (右) 陽性ニューロンの共焦点画像をインビトロで1時間培養した。(C, D)TdTomato (C) および金星陽性ニューロン (D) の明視野 (上部) および結合明視野および蛍光画像 (下段) は、インビトロで7日間培養した (DIV)。白い矢は死んだ細胞からの凝縮した核の位置を示す。色付き矢印は蛍光標識ニューロンを示します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58974/58974fig2large.jpg" target="_blank">この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58974/58974fig3.jpg"> 図 3: 精製されたニューロンの形態学的、電気生理学的およびシナプス特性。(A、B)TdTomato (A) と金星陽性ニューロン (B) の共焦点像は、それぞれ DIV 13 および DIV 14 にある。細胞は、神経突起の可視化を支援するために反転ルックアップテーブルを使用して黒色で提示されます。インセットは、同定されたニューロンによって発現される蛍光シグナルを示す。(C, D)TdTomato (C) および Venus 陽性ニューロン (D) から hyperpolarizing (200 pA、20 pA ステップ) および脱分極性 (200 pA) の電流パルス、全細胞パッチクランプ記録による電圧応答。インセットは、対応する記録されたニューロンを示します。各セルの静止膜電位は、記録トレースの左側に表示されます。(E、F)TdTomato (E) および Venus 陽性ニューロン (F) から得られた代表的な電圧-クランプ録音 (10 s)。自発的興奮性シナプス後事象 (EPSCs) は、TdTomato 陽性ニューロンから記録し、50 mV の保持電位で維持した。自発的に発生する阻害シナプス後事象 (IPSCs) を、0 mV の保持電位に維持した Venus 陽性ニューロンから記録した。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58974/58974fig3large.jpg" target="_blank">この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58974/58974fig4.jpg"> 図 4: グリア共培養によるニューロン発達の支援(A) グリア線維性酸性タンパク質 (GFAP、左)、分化分子 (CD11b、中) およびミエリン塩基性タンパク質 (MBP、右) に immunolabeled グリア培養の共焦点画像。グリア細胞は、DIV 7 について培養した。(B) 細胞培養物の画像は、非接触配置で精製されたニューロンとのグリア細胞を共培養するために用いられる。(C) ニューロンとグリアを共培養するために用いられる空間的配置の概略図である。(D, E)TdTomato (D) と金星陽性ニューロン (E) の共焦点画像を、グリア支持の欠如 (左) または存在 (右) で14日間にわたって増殖させた。(F, G)TdTomato (F) および Venus 陽性ニューロン (G) からの電流クランプ記録 (60 s) を、グリア支持の不在 (上) または存在 (底) で14日間培養した。ニューロンは、それらの安静時膜電位で記録された (各記録トレースの左側に提示される)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58974/58974fig4large.jpg" target="_blank">この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

このプロトコルは、生後マウスまたはラットの新皮質および海馬からの蛍光 GABAergic または glutamatergic ニューロンの精製および培養のための細胞選別ベースの方法を記載している。

蛍光活性化細胞選別により確立された精製 GABAergic または Glutamatergic ニューロンの初代細胞培養

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...

このプロトコルは、特定のタイプの一次ニューロンを精製し、培養するための簡単で再現可能な方法を記述する。これらの培養は、電気生理学的、形態学的および生存解析に適している。精製されたニューロンの培養は、神経生理学の基礎、シナプスの形成、およびニューロンネットワークの発達方法を研究するために使用することができます。皮質グルタミン酸主細胞およびGABAergicインターニューロンに焦点を当てていますが、この手順は、蛍光タンパク質を発現する神経細胞を研究するために簡単に変更することができます。ガラスカバーリップを調製するために、最初に5ミリリットルのアリコートを解凍して、1ミリリットルPLL溶液あたり200マイクログラムを取り出します。このストック溶液を、45ミリリットルの純噴射等水を加えて、1ミリリットル当たり20マイクログラムに希釈します。次に、新しい50ミリリットルの円錐管に溶液を殺菌し、このチューブをPLL滅菌としてラベル付けします。次に、滅菌PLL溶液に100個の無菌丸12ミリメートルガラスカバーリップを入れます。チューブを5~10分に2~3分攪拌してコーティングを確実にします。PLLコーティングの40分後、ティッシュペーパーを2枚取り、フローキャビネットに平らに置きます。70%エタノールを使用して紙を殺菌し、折り目を取り除くために平らにし、乾燥させます。PLLで1時間ガラスカバーリップをコーティングした後、余分なPLL溶液を除去し、滅菌注入グレードの水を追加します。カバーリップを2〜3秒間静かに攪拌して余分なPLLを取り除きます。このすすいのステップをさらに2回繰り返します。余分な水を取り除き、その後、滅菌ティッシュペーパーにカバーリップを転送します。乾燥したら、カバーリップを24ウェルカルチャープレートに移します。細胞培養液を調製するために、細胞培養バッファーの12ミリリットルを15ミリリットルの円錐チューブに測定し、BSAとしてラベルを付ける。異なる15ミリリットルチューブに細胞培養バッファーの5ミリリットルを測定し、パパインとしてラベル.その後、両方のチューブを摂氏37度で15分間インキュベートします。BSAとラベル付けされたチューブに120ミリグラムのBSAを加えます。その後、溶液を溶解するためにチューブを反転させます。その後、パパインとラベル付けされたチューブに7ミリグラムのパパインを加えます。両方のチューブを15分間水浴に戻します。フィルターは、新鮮な円錐管にBSA溶液を殺菌します。滅菌BSA溶液を3つのチューブに分割し、各チューブにBSA滅菌とラベルを付け、1つ、2つ、または3つ。今フィルターは、パパインチューブを殺菌し、パパイン滅菌としてチューブをラベル付けします。すべてのチューブを水浴に戻し、使用するまで摂氏37度でインキュベートを続けます。組織解剖の準備のために、海馬と皮質の解剖に必要なメス、はさみ、鉗子、およびへらをレイアウトする。フローキャビネットに35ミリメートルのペトリ皿2個と滅菌フィルターペーパーを含む100ミリメートルのペトリ皿を置きます。トランスジェニックNexCreを収集します。;Ai9またはベシクラルGABAトランスポーターヴィーナスマウスは、野生のタイプのリットルの仲間から蛍光パプを識別するために適切な励起および発光フィルタを備えた蛍光ランプを使用して解剖される。動物を解剖する直前に、各ペトリ皿に冷たい無菌細胞培養バッファーを充填します。解剖後、トランスジェニックの子犬の脳を滅菌濾紙に慎重に移す。まず、小脳を解剖し、2つの半球を分離します。その後、各半球から海馬と皮質を慎重に分離します。解剖した組織を、冷蔵細胞培養バッファーを含む35ミリメートルのペトリ皿に移します。その後、解剖された海馬と皮質を別の35ミリメートルのペトリ皿の蓋に移します。メスの刃の平らな端を使用して、小片だけが残るまで慎重に十字架の動きで組織を刻みます。次に、ペトリ皿蓋から滅菌パパインチューブに少量のパパイン溶液で切り刻んだ組織を移す。25分間摂氏37度で組織をインキュベートします。パパインインキュベーション後、滅菌パパインチューブと無菌BSAチューブをフローキャビネットに移します。その後、1ミリリットルのパスツールピペットを使用して、ペパパインチューブからBSAチューブ1にコルチコヒッポカンピ組織のみを移送します。組織の大きな塊を分割するために、1ミリリットルパスツールピペットを使用して組織を数回トリチュレートします。これに続いて、細かい先端パスツールピペットを使用して組織を7回トリチュレートする。30秒後、BSAチューブ1からBSAチューブ2に下液と組織の1ミリリットルを移す。BSAチューブ内の組織を、微細な先端パスツールピペットを使用して数回数回トリチュレートします。トリアーレーション後、BSAチューブ1からBSAチューブ3に下側組織と溶液の1ミリリットルを移す。BSAチューブ内の組織を数回3回トリチュレートする。トリアージの後、すべての溶液と組織をチューブ2と3からBSAチューブ1に移します。さらに2〜3回トリチュレートし、遠心分離機を3,000回gで3分間トリチュレートする。遠心分離後、ペレット化した組織から上清を慎重に除去し、P1000ピペットを使用して、完全な冬眠の2ミリリットルの低蛍光培地で細胞を再懸濁する。次いで、組織を20回トリチュレートして、組織溶液の完全な再懸濁を確実にする。続いて、30マイクロメートルの細胞ふるいを通して細胞懸濁液をポリスチレンサンプルチューブにファイラーする。完全な冬眠Aメディアの300マイクロリットルを必要な数のポリプロピレンチューブにピペット処理して、細胞選別コレクションチューブを準備します。分類する蛍光セルの種類ごとに、適切な励起フィルターと発光フィルタを選択します。488ナノメートルの励起波長を用いて金星タンパク質を励起し、530/40の発光フィルタセットを通して放出された光を検出します。531ナノメートルの励起波長を用いたTdTomatoタンパク質をエキサイトし、575/30の発光フィルタセットを通して発光した光を検出します。高純度の場合は、明るく標識された蛍光細胞を選別します。細胞の選別後、収集した細胞を2ミリリットルの丸底遠心管に移す。その後、3,000回gで細胞を遠心分離し、3分間細胞ペレットを形成する。プリ温め完了NBA培地の必要量で細胞ペレットを再懸濁し、マイクロリットル当たり1,000細胞の細胞密度を達成する。解像細胞の存在を確認するには、4Xまたは10X対物レンズを使用して顕微鏡下で細胞溶液をチェックします。細胞をめっきする前に、2〜3秒間中速で渦を発生させるため、細胞懸濁を確実にする。ボルテックスに続いて、各カバースリップの中央に細胞懸濁液の10マイクロリットルを素早くピペット。1時間後、500マイクロリットルの事前温めた完全なNBA培地で細胞を供給し、摂氏37度でインキュベーターに戻ります。精製したニューロンとグリア細胞を共培養するために、グリア細胞を必要な数の細胞培養挿入物に通す。これは、完全なNBA培地の500マイクロリットルの液滴で40,000個のグリア細胞をめっきすることによって行われる。1時間後、グリア細胞培養挿入物を精製ニューロンに移す。培養インサートから余分な培地を取り除き、培養用の培養器にプレートを戻します。正常な並べ替えに続いて、メッキされたニューロンは滑らかな膜で丸い形で現れるべきであり、体外で約1時間後に神経症を惜しむ必要があります。インビトロで7日間までに、いくつかの細胞死が明らかであるが、生存可能な細胞はすべての培養条件に存在すべきである。精製培養物の分析は、グルタミン酸作動性ニューロンとGABAergicニューロンの両方が、細胞体から軸索および樹状突起を拡張し、超閾値脱分極電流注入に応答して作用電位を生成する能力を保持することができたことを明らかにした。特に精製に続いて、GABAERGICニューロンだけが大量の自発的シナプス伝達を受け、グルタミン酸ニューロンはグリア細胞の不在時にシナプス伝達をほとんど受け取らなかった。重要なことに、グリア細胞で精製されたニューロンを培養すると、グルタミン酸細胞におけるシナプス伝達を促進するだけでなく、ニューロンの成長と生存を改善します。カバーリップの十分な偏光コーティングと、手順全体を通して培養培地の生理学的pHを維持することは、良好な細胞培養を確保するための鍵である。このプロトコルに従って、精製培養物にRNAシーケンシングおよびタンパク質量分析を行い、翻訳および転写プロセスを特定の神経細胞タイプで調査することが可能であるべきである。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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