Name: primary cell culture of purified gabaergic or glutamatergic neurons established through fluorescence-activated cell sorting
Uploaded: 2019-06-06T13:00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить за отличную техническую поддержку, оказанную Дженни Кирш и Ана Тейхмюллер в Flow Cytometry Core Facility, Deutsches Rheuma-Forschungszentrum, Берлин. Мы хотели бы поблагодарить Цзе Сон за помощь в анализе выживания. Мы также хотели бы поблагодарить Риту Лурейро за помощь в захвате изображений флуоресцентных мышей и Кристиана Эбнера за критическое чтение протокола. Трансгенные крысы VGAT-Venus были созданы докторами Янагава, М. Хирабаяси и И. Кавагути в Национальном институте физиологических наук, Окадзаки, Япония, с использованием pCS2-Venus, предоставленных д-ром А. Мияваки. Эта работа была поддержана Немецким исследовательским советом (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG EXC 257 к IV).

<ol>
	<li>Radcliff, G., Jaroszeski, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basics+of+flow+cytometry.">Basics of flow cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 91, 1-24 (1998).</li><li>Feher, K., Kirsch, J., Radbruch, A., Chang, H. D., Kaiser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+population+identification+using+fluorescence-minus-one+controls+with+a+one-class+classifying+algorithm.">Cell population identification using fluorescence-minus-one controls with a one-class classifying algorithm.</a> Bioinformatics. 30 (23), 3372-3378 (2014).</li><li>Sergent-Tanguy, S., Chagneau, C., Neveu, I., Naveilhan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+activated+cell+sorting+(FACS):+a+rapid+and+reliable+method+to+estimate+the+number+of+neurons+in+a+mixed+population.">Fluorescent activated cell sorting (FACS): a rapid and reliable method to estimate the number of neurons in a mixed population.</a> Journal of Neuroscience Methods. 129 (1), 73-79 (2003).</li><li>Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+basic+principles+and+applications.">Flow cytometry: basic principles and applications.</a> Critical Reviews in Biotechnology. 37 (2), 163-176 (2017).</li><li>Guez-Barber, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+purification+of+immunolabeled+cell+types+from+adult+rat+brain.">FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 203 (1), 10-18 (2012).</li><li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).</li><li>Turko, P., Groberman, K., Browa, F., Cobb, S., Vida, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Dependence+of+GABAergic+and+Glutamatergic+Neurons+on+Glia+for+the+Establishment+of+Synaptic+Transmission.">Differential Dependence of GABAergic and Glutamatergic Neurons on Glia for the Establishment of Synaptic Transmission.</a> Cerebral Cortex. , (2018).</li><li>Uematsu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+chemical+composition+of+cortical+gabaergic+neurons+revealed+in+transgenic+venus-expressing+rats.">Quantitative chemical composition of cortical gabaergic neurons revealed in transgenic venus-expressing rats.</a> Cerebral Cortex. 18, 315-330 (2008).</li><li>Goebbels, S., Bormuth, I., Bode, U., Hermanson, O., Schwab, M. H., Nave, K. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+targeting+of+principal+neurons+in+neocortex+and+hippocampus+of+NEX-Cre+mice.">Genetic targeting of principal neurons in neocortex and hippocampus of NEX-Cre mice.</a> Genesis. 44, 611-621 (2006).</li><li>Banker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trophic+interactions+between+astroglial+cells+and+hippocampal+neurons+in+culture.">Trophic interactions between astroglial cells and hippocampal neurons in culture.</a> Science. 209, 809-810 (1980).</li><li>Lindsay, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+rat+brain+astrocytes+support+survival+of+both+NGF-dependent+and+NGF-insensitive+neurones.">Adult rat brain astrocytes support survival of both NGF-dependent and NGF-insensitive neurones.</a> Nature. 282 (5734), 80-82 (1979).</li><li>Geissler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+hippocampal+neurons,+which+lack+four+crucial+extracellular+matrix+molecules,+display+abnormalities+of+synaptic+structure+and+function+and+severe+deficits+in+perineuronal+net+formation.">Primary hippocampal neurons, which lack four crucial extracellular matrix molecules, display abnormalities of synaptic structure and function and severe deficits in perineuronal net formation.</a> Journal of Neuroscience. 33 (18), 7742-7755 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labeling+of+both+gabaergicand+glycinergic+neurons+in+vesicular+GABA+transporter+(VGAT)-venus+transgenic+mouse.">Fluorescent labeling of both gabaergicand glycinergic neurons in vesicular GABA transporter (VGAT)-venus transgenic mouse.</a> Neuroscience. 164 (3), 1031-1043 (2009).</li><li>H&#246;ltje, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Rho+gtpasein+astrocyte+morphology+and+migratory+response+during+in+vitro+wound+healing.">Role of Rho gtpasein astrocyte morphology and migratory response during in vitro wound healing.</a> Journal of Neurochemistry. 95 (5), 1237-1248 (2005).</li><li>Booker, S. A., Song, J., Vida, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+Patch-clamp+Recordings+from+Morphologically-+and+Neurochemically-identified+Hippocampal+Interneurons.">Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons.</a> Journal of Visualized Experiments. , e51706 (2014).</li><li>Pfrieger, F. W., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+efficacy+enhanced+by+glial+cells+in+vitro.">Synaptic efficacy enhanced by glial cells in vitro.</a> Science. 277 (5332), 1684-1687 (1997).</li><li>Ullian, E. M., Sapperstein, S. K., Christopherson, K. S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+synapse+number+by+glia.">Control of synapse number by glia.</a> Science. 291, 657-661 (2001).</li><li>Christopherson, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombospondins+are+astrocyte-secreted+proteins+that+promote+CNS+synaptogenesis.">Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis.</a> Cell. 120, 421-433 (2005).</li><li>Berghuis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-derived+neurotrophic+factor+controls+functional+differentiation+and+microcircuit+formation+of+selectively+isolated+fast-spiking+gabaergic+interneurons.">Brain-derived neurotrophic factor controls functional differentiation and microcircuit formation of selectively isolated fast-spiking gabaergic interneurons.</a> European Journal of Neuroscience. 20 (5), 1290-1306 (2004).</li><li>Liddelow, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+microglia+induce+neurotoxic+reactive+astrocytes+via+Il-1&#945;,+tnf&#945;,+and+c1q.">Activated microglia induce neurotoxic reactive astrocytes via Il-1&#945;, tnf&#945;, and c1q.</a> Nature. 541, 481-487 (2017).</li><li>Tomlinson, M. J., Tomlinson, S., Yang, X. B., Kirkham, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+separation:+Terminology+and+practical+considerations.">Cell separation: Terminology and practical considerations.</a> Journal of Tissue Engineering. 4, (2013).</li><li>Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+survival+of+hippocampal+neurons+in+B27-supplemented+Neurobasal,+a+new+serum-free+medium+combination.">Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination.</a> Journal of Neuroscience Research. 35 (5), 567-576 (1993).</li></ol>

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Мы описываем здесь метод, который сочетает в себе сортировку и культивирование первичных нейронов для генерации очищенных нейрональных клеточных культур. Этот метод занимает около 1 ч больше, чем типичный первичный отдельный протокол нейронной культуры, но позволяет для генерации сотен репликационных культур, содержащих конкретные типы нейронов. Очищенные нейроны, которые могут быть выращены в изоляции, по крайней мере 16 дней, продлить аксоны и дендриты и может огонь повторяющихся поездов действия потенциалов(Рисунок 2 и Рисунок 3). Важно отметить, что эти клетки поддаются тем же экспериментальным анализам, что и регулярные первичные разрозненные нейронные культуры, включая электрофизиологические, морфологические и анализы на выживание. Основным преимуществом работы с этими очищенными культурами является то, что развитие конкретных типов клеток может быть изучено изолированно. Для поддержки развития очищенных культур мы также представляем протокол для совместного культивирования очищенных нейронов с глиальными клетками. Как показано ранее, совместное культивирование очищенных нейронов с глиальными клетками улучшает их выживание, рост и может способствовать формированию сети7 (Рисунок 4). Таким образом, мы представляем здесь сочетание методов, которые должны способствовать изучению взаимодействия глиа-нейронов и может оказаться полезным для изучения развития и взаимодействия между другими типами клеток интересов.
Исследования культур очищенных глутамерных нейронов выявили фундаментальное понимание того, как глиальные клетки выделяют факторы, способствующие развитию нейронных сетей и образованию синапсов16,17,18 . В целом, методы очистки конкретных типов нейронов были более успешно применены для изучения развития глутаматергических нейронов, а не ГАМК., нейронов. Это привело к несоответствию в нашем понимании того, как развиваются эти два типа клеток. Учитывая, что ГАМК и глутамергических нейронов значительно отличаются с точки зрения их анатомии, физиологии и развития происхождения, очень важно, что мы изучаем ГАМК нейронов в их собственном праве, чтобы лучше понять их функции и физиологии. Используя протокол, представленный здесь, мы ранее определили важные различия в том, как ГАМК и глутамергические нейроны зависят от глиа-секретных факторов для создания синаптической передачи7. Публикуя этот протокол, мы надеемся, что другие смогут глубже понять важные взаимодействия между нейронами и глиальными клетками.
В этом протоколе мы описываем метод сортировки клеток на основе потока, который мы использовали для очистки ГАМК или глутаметатергических нейронов от различных трансгенных линий грызунов. Венера положительные ГАМК нейроны были отсортированы из VGAT Венера мышей13 или крыс8 и TdTomato положительные глутамергические нейроны были отсортированы из NexCre; Ai9 мышей (выведенные первоначально от NexCre9 и Ai9 репортер линии6, см. Turko et al., 20187). В последние годы, благодаря технологическим достижениям, производство трансгенных животных стало значительно проще. Таким образом, доступность животных, выражающих флуоресцентные молекулы, во многих различных типах клеток, быстро росла. Это, в свою очередь, увеличило использование и применимость флуоресцентной активированной сортировки клеток. В то время как альтернативные методы изоляции клеток, представляющих интерес в настоящее время существуют16,19,20, они несколько мешает их зависимость от наличия подходящих антител к естественной поверхности антигенов. Это ограничивает их универсальность по сравнению с флуоресценцией на основе методов сортировки клеток, которые уже могут быть использованы для сортировки клеток из многих клеток конкретных трансгенных животных репортера, которые уже доступны. Тем не менее, при оптимизации, антитела на основе методов сортировки может быть быстрым и высокой урожайности, и может даже лучше сохранить анатомию клеток, позволяя очистки клеток с их аксонов и дендритов нетронутыми21. Поэтому при принятии решения о стратегии сортировки следует все же учитывать методы сортировки антител. В конечном счете, тип клеток, возраст, в котором клетки должны быть сортированы, наличие трансгенных животных или поверхностных антигенов и количество клеток, необходимых будет определяющих факторов при выборе наиболее подходящей стратегии сортировки.
Хотя сортировка клеток на основе флуоресценции является простым и воспроизводимым методом очистки клеток, следует принимать меры по уходу во время определенных этапов протокола для сохранения качества клеток. Например, после каждого шага центрифугации, важно, чтобы убедиться, что клетка гранулы повторно приостановлено как можно быстрее, и что клетки были успешно восстановлены. Иногда, клеточные гранулы могут быть нарушены при удалении супернатанта. Поэтому рекомендуется, между шагами центрифугации, чтобы проверить наличие клеток под микроскопом, чтобы исключить любые обширные потери клеток. После клеточного покрытия, клетки должны быть разрешены придерживаться, по крайней мере 1 ч перед кормлением. Если клетки подаются слишком рано, некоторые клетки могут выбиться из покрывало, тем самым уменьшая плотность культуры. После 1 ч в культуре, разумно оценить здоровье клеток. Если клетки не кажутся здоровыми (пример здоровых клеток показан на рисунке 2A),или есть значительная гибель клеток, то это может быть признаком проблемы во время диссоциации или процедуры сортировки. Еще одним важным соображением, при культивированиелюбой любой тип клетки, заключается в том, чтобы заботиться при управлении среды клеточной культуры. НБА СМИ содержит фенол красный, который выступает в качестве индикатора рН22. Если носители становятся слишком желтыми по цвету, то это указывает на то, что рН слишком кислой; если носитель становится слишком розовым, то это указывает на то, что решение слишком щелочное. Фондовые решения открыты в течение длительных периодов времени, особенно сми aliquoted в конические трубки, как правило, становятся более щелочной с течением времени. Поэтому рекомендуется составлять свежие полные средства массовой информации НБА каждую неделю и полные средства массовой информации каждые две недели (средние буферы в атмосферных условиях и, следовательно, должны быть более стабильными). Принимая эти моменты во внимание, должно быть возможно установить очищенные культуры клеток в любой лаборатории с доступом к сортировке клеток и оборудованию культуры клеток.
В большинстве наших экспериментов мы производили очищенные культуры из одного животного. Однако при очистке клеток для биохимического анализа может возникнуть необходимость объединить несколько животных для сортировки. Мы успешно сортировали до 8 эмбриональных мышей (эмбриональный день 13 животных) с помощью вышеуказанного протокола (данные не показаны). Однако, если больше животных должны быть отсортированы, это может быть необходимо увеличить объем как папаин и BSA решений (описанных в шагах 2.1.1-2.1.4) для размещения увеличение количества тканей. Кроме того, если больше клеток покрыто культурой, то может потребоваться более частый график кормления. В качестве отправной точки, клетки могут быть поданы каждые 7 дней, удалив 100 л условных носителей и добавив 200 Л свежих полных носителей НБА. Ради жизнеспособности нейронов, если сортировать больше животных, следует подумать, чтобы свести к минимуму время сортировки как можно больше. Это часто требует тщательной оптимизации ниже по течению анализов для эффективного использования очищенных клеток. Мы регулярно сортировали нейроны мыши со скоростью 600 событий / с, до 500000-800000 000 клеток на животное (послеродовой день 0-2). Однако это было без исчерпывающей оптимизации скорости и условий сортировки. Поэтому возможно дальнейшее улучшение скорости сортировки и урожайности.
Очищенные нейроны требуют глиа-кондиционированных средств для их выживания. Это было продемонстрировано ранее культивирование мнокак нейронов и глиальных клеток отдельно, перед лечением нейронов с глиальных условных средств массовой информации10. В наших экспериментах мы решили поддерживать очищенные нейроны, культивируя глиальные клетки на полупроницаемых клеточных вставках, которые помещаются внутри пластины клеточной культуры. Этот метод был успешно применен для изучения глиа-производных внеклеточных матричных белков и их взаимодействия с нейронами12. Бесконтактная, но непрерывная поддержка, предоставляемая этим методом, имеет ряд преимуществ по сравнению с отдельной культурой клеток. Наиболее примечательно, что со-культура глиальных клеток с нейронами позволяет непрерывнорегулировать и кондиционирования средств культуры клетки, которые более близко походят ситуация in vivo. Кроме того, непрерывная сокультура клеток позволяет для потенциальной обратной связи сигнализации между нейронами и глии, которая не возможна в разделенных культурах. В нашем протоколе, при необходимости, непрерывный метод совместной культуры может быть легко опущен и классическое лечение нейронов с глиа-кондиционированных средств массовой информации может быть выполнена.
Таким образом, представленный здесь протокол призван обеспечить читателю прочную основу, из которой они могут создавать свои собственные эксперименты по очищенной культуре клеток. Мы прогнозируем, что доступность трансгенных животных и вирусных конструкций будет продолжать расти в обозримом будущем. Таким образом, методы сортировки клеток, основанные на флуоресценции, вероятно, станут еще более широко используемыми и ценными.

Сортировка клеток является мощным инструментом для изоляции живых клеток, представляющих интерес, от разнородной смеси клеток. Клетки могут быть отсортированы на основе размера и формы критериев, а также выражение флуоресцентных маркеров1,2. Часто флюорофор-конъюгированные антитела используются для обозначения различныхтипов клеток, ориентируясь на клеточные поверхностные антигены 3,4. Кроме того, трансгенных животных или вирусных систем доставки были разработаны, чтобы выразить флюорофоры под клеток конкретных промоутеров5,6. Исторически разработка трансгенных инструментов и животных была дорогостоящей и трудоемкой. В последнее время сокращение расходов и сокращение технических трудностей привели к резкому увеличению числа имеющихся репортерских линий. По мере того как наличие трансгенных инструментов и животных репортера продолжает сядете, также должно быть полезность и применимость флуоресцентных методов сортировки клеток.
Недавно мы показали, что сортировка клеток от трансгенных животных может быть регулярно применяется для очистки первичных нейронов в рамках подготовки к клеточной культуре7. Путем сортировки клеток от крыс или мышей, мы смогли изолировать и культуры флуоресцентных нейронов, которые выражают флуоресцентные белки репортера конкретно либо ГАМК или глутамерных нейронов6,8,9. Изучая эти очищенные нейронные культуры, мы смогли определить важную разницу в том, как ГАМК и глутамергические нейроны зависят от глиа-секретных факторов для создания синаптической передачи7. Кроме того, путем совместного культивирования скользящих клеток с очищенными нейронами, мы смогли расширить на предыдущих наблюдений, демонстрирующих важную роль, что глиальные клетки играют в росте и выживании нейронов10,11. Таким образом, благодаря сочетанию клеточной сортировки и клеточной культуры, мы смогли изучить не только развитие конкретных типов нейронов в изоляции, но и сследовать влияние глиальных клеток на их функцию.
Мы представляем здесь протокол для очистки и культуры ГАМК и глутамергических нейронов из коры и гиппокампа трансгенных мышей или крыс. Мы также представляем метод бесконтактной кокультуры очищенных нейронов и глиальных клеток, адаптированный из Geissler et al.12. Для того, чтобы генерировать очищенные ГАМК-культуры, мы отсортировали флуоресцентные нейроны из VGAT-Venus-A Wistar крыс8 или VGAT-Venus мышей13, которые избирательно выразить расширенный желтый вариант флуоресцентного белка (Венера) в корковых ГАМК нейронов. Для генерации очищенных глутамерных культур мы отсортировали флуоресцентные нейроны из NexCre; Ai9 мышей6,9, которые выражают tdTomato в корковых глутамерных нейронов. Вся процедура сортировки и культуры может быть выполнена в течение 3-4 ч и может быть использована для создания сотен повторяющих культур, пригодных для электрофизиологического, морфологического и анализа выживаемости клеток. Метод прост, воспроизводим и может производить очищенные нейронные культуры, которые превышают 97% чистой для клеточного типа интереса.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Neural Basal A media (NBA)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10888022</td>
			<td>Cell Culture Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17504001</td>
			<td>Culture supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>35050-038</td>
			<td>Culture supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P1399</td>
			<td>Coverslip coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P4762-1G</td>
			<td>Enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A3294-100G</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hibernate A low fluorescence media</td>
			<td>Brain Bits Ltd</td>
			<td>HALF</td>
			<td>Cell Transport media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM)</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>F0435</td>
			<td>Glial Culture Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>S0115</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin / EDTA</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L2163</td>
			<td>Enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Tip Pasteur Pipette</td>
			<td>Neo Labs</td>
			<td>-</td>
			<td>Used for trituration of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>BD</td>
			<td>353047</td>
			<td>Culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>352070</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>352096</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips: 12 mm round</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P231.1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353001</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 &#181;m CellTrics Cell Sieve</td>
			<td>sysmex</td>
			<td>04-004-2326</td>
			<td>To remove cell clumps before cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottom polystyrene tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>352054</td>
			<td>Transport tube for sorted cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottom polypropylyne tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>352063</td>
			<td>Collection tube for sorted cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture inserts &#8211; 0.4 &#181;m transparent PET</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353 095</td>
			<td>For the co-culture of neurons and glia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra fine Bonn Scissors</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>14084-08</td>
			<td>To remove overlying skin and bone of mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra narrow Scissors</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>14088-10</td>
			<td>To remove overlying skin and bone of rats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>11242-40</td>
			<td>To hold the head in place</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula (130 mm long / 5 mm tip width)</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>3006.1</td>
			<td>To remove the brain to filter paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blades</td>
			<td>Swan-Morton</td>
			<td>#0308</td>
			<td>To mechanically dissociate neural tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemocytometer (Neubauer Imroved)</td>
			<td>Optik Labor</td>
			<td>-</td>
			<td>To cell count dissociated cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Miners Goggles (excitation light)</td>
			<td>Biological Laboratory Equipment 
			Maintenance and Servce Ltd (BLS)</td>
			<td>FHS/LS-1G</td>
			<td>To excite TdTomato</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Miners Goggles (emission filter)</td>
			<td>Biological Laboratory Equipment 
			Maintenance and Servce Ltd (BLS)</td>
			<td>FHS/EF-4R2</td>
			<td>Td Tomato compatible emission filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Miners Goggles (excitation light)</td>
			<td>Biological Laboratory Equipment 
			Maintenance and Servce Ltd (BLS)</td>
			<td>FS/ULS-02B2</td>
			<td>To excite Venus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Miners Goggles (emission filter)</td>
			<td>Biological Laboratory Equipment 
			Maintenance and Servce Ltd (BLS)</td>
			<td>FS/TEF-3GY1</td>
			<td>Venus compatible emission filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse-Anti-GFP primary antibodies</td>
			<td>UC Davis</td>
			<td>75-132</td>
			<td>To enhance Venus signal following fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse-Anti-GFAP primary antibodies</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G-3893</td>
			<td>The identification of reactive astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit-Anti-CD11b primary antibodies</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>1561-15</td>
			<td>The identification of microglial cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit-Anti-MBP primary antibodies</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB980</td>
			<td>The identification of oligodendrocyes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary cell culture of purified gabaergic or glutamatergic neurons established through fluorescence-activated cell sorting

Общая цель этого протокола заключается в генерации очищенных нейронных культур, полученных либо из ГАМК или глутаматергических нейронов. Очищенные нейроны могут быть культивированы в определенных средствах массовой информации в течение 16 дней в пробирке и поддаются любым анализам, обычно проводимым на разрозненных культурах, включая электрофизиологические, морфологические и анализы выживания. Основным преимуществом этих культур является то, что конкретные типы клеток могут быть выборочно изучены в отсутствие сложных внешних воздействий, таких как те, которые возникали из глиальных клеток или других типов нейронов. При планировании экспериментов с очищенными клетками, однако, важно отметить, что нейроны сильно зависят от глии кондиционированных средств для их роста и выживания. Кроме того, глутаматергические нейроны также зависят от глиа-секретных факторов для установления синаптической передачи. Поэтому мы также описываем метод совместного культивирования нейронов и глиальных клеток в бесконтактной договоренности. Используя эти методы, мы выявили основные различия между развитием ГАМК и глутаатергических нейронных сетей. Таким образом, изучение культур очищенных нейронов имеет большой потенциал для дальнейшего нашего понимания того, как развивается и функционирует нервная система. Кроме того, очищенные культуры могут быть полезны для исследования прямого действия фармакологических агентов, факторов роста или для изучения последствий генетических манипуляций на конкретные типы клеток. По мере того как все больше и больше трансгенных животных становятся доступными, маркировка дополнительных конкретных типов клеток интерес, мы ожидаем, что протоколы, описанные здесь будет расти в их применимости и потенциал.

Диссоциация и клеточная сортировка флуоресцентных нейронов из трансгенной мыши или крысиной кортико-гиппокампальной ткани может быть выполнена примерно в 3-4 ч. Результатом является популяция высокочистых флуоресцентных нейронов, которые могут быть выращены в культуре в течение 16 дней.
Для создания очищенных культур трансгенные животные были впервые идентифицированы с помощью флуоресцентной лампы с соответствующими фильтрующими наборами (примеры флуоресцентных неонатальных VGAT Venus и NexCre; Ai9 мыши щенки показаны на рисунке 1A). После выявления трансгенных животных расчлененная ткань была разобщена, а наиболее сильно флуоресцентные нейроны были отсортированы для получения очищенной популяции клеток. Пример флуоресценции интенсивности точек участков для NexCre; Нейроны мыши Ai9 и VGAT Venus, полученные во время FACS, показаны на рисунке 1B. При оптимизации можно собрать от 500 000 до 800 000 клеток из коры головного мозга и гиппокампа отдельных P0 -2 NexCre; Ai9 или VGAT Венера мышей. Клетки могут быть отсортированы со скоростью свыше 600 событий/ с. Оценки чистоты клеток были выполнены с использованием DAPI в качестве ядерного маркера(рисунок 1С). Путем сортировки сильно положительных клеток, чистота более 97% может быть регулярно достигнута7.
После успешной сортировки, покрые нейроны должны появиться круглые формы, имеют гладкую мембрану и должны быть замечены, чтобы прорасти нейриты примерно после 1 ч в пробирке(рисунок 2A,B). К 7 дням in vitro, хотя некоторая смерть клетки может быть явно, жизнеспособные клетки должны присутствовать в всех условиях культуры(рисунок 2C,D). В 12-16 дней в пробирке, используя цельно-клеточные записи патч-зажима и биоцитина заполнения15, можно исследовать морфологическое и электрофизиологическое развитие очищенных нейронов (Рисунок 3). Анализ очищенных культур показывает, что как глутамерные, так и ГАМК-нейроны смогли расширить аксоны и дендриты из своих клеточных тел(рисунок 3A, B) и сохранить способность генерировать потенциал действия в ответ на надпорог деполяризации текущих инъекций(рисунок 3C, D). Примечательно, однако, после очистки, только ГАМК нейроны получили значительное количество спонтанной синаптической передачи, и глутаматергические нейроны получают очень мало синаптической передачи при отсутствии глиальных клеток (Рисунок 3E , F) 7.
Как мы уже сообщали ранее, клетки в очищенных культурах, как правило, выживают более бедно,чем в несортированных культурах, и имеют значительно меньшие дендриты и аксоны 7. Чтобы преодолеть этот дефицит, мы адаптировали и применили методы поддержки развития очищенных культур глиальными клетками12,14. Сотовый состав наших глиальных поддерживающих культур (DIV7) показан на рисунке 4A. Эти культуры содержали преимущественно глиальный фибрилляционный кислый белок (GFAP) положительные астроциты, но также содержали некоторое скопление молекулдиации дифференциации (CD11b) положительной микроглии и миелина основного белка (MBP) положительных олигодендроцитов. После DIV 7, эти клетки могут быть переданы в клеточной культуры вставки для обеспечения бесконтактной поддержки очищенных нейронов(Рисунок 4B, C). Анализ глиа-нейронных сокультур показывает, что примерно 40 000 глиальных клеток было достаточно для улучшения долгосрочного выживания и роста как очищенных глутамерных, так и ГАМК-нейронов(Рисунок 4D,E)7. Кроме того, электрофизиологический анализ показывает, что глутаматергические нейроны, совместно культивированные с глиальными клетками, были очень активны и сильно увеличили сетевую активность (процент глиальных поддерживаемых глутамерных нейронов, стреляя всплесками действия потенциалы; n No 28; Рисунок 4F , G). Таким образом, глиальная поддержка важна не только для содействия росту и выживанию нейронов, но и для содействия синаптической передаче и налаживанию сетевой активности в глутаметергических культурах.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58974/58974fig1.jpg"> Рисунок 1. Очистка глутамерных и ГАМК-нейронов. (A) Изображения, показывающие флуоресцентный сигнал от трансгенного выражения TdTomato в NexCre; Мыши Ai9 (вверху) и Венера в VGAT Венера мышей (внизу). Шкала баров 5 мм. (B) Интенсивность рассеяния участков TdTomato и Венера флуоресценции кортико-гиппокампа диссоциированных клеток от NexCre; Мыши Ai9 (вверху) и VGAT Венера мышей (внизу). Сильно флуоресцентные tdTomato или Венера нейронов были выбраны для сортировки (показано gating коробки). (C, слева) Конфокальные изображения отсортированных TdTomato (вверху) и Венеры (внизу) положительных нейронов. (C, справа) Слияние изображения, показывающего ячейки, окрашенные совместно с DAPI (синим псевдоцветом). TdTomato флуоресценция является эндогенной и остается сильным, несмотря на фиксацию (в пурпурный псевдоцвет). Выражение Венеры усиливается с помощью комбинации первичных антител, направленных против GFP и Alexa Fluor-488-конъюгированных вторичных антител (зеленым псевдоколором). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58974/58974fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58974/58974fig2.jpg"> Рисунок 2. Клеточная культура очищенных глутамерных или ГАМК-нейронов. (A) Комбинированные инфракрасные (яркое поле) изображения и наложенный флуоресцентный сигнал от TdTomato (слева) и Венеры (справа) положительные нейроны культивируется в течение 1 ч в пробирке. Белые стрелки указывают на расположение растущих невритов. (B) Конфокальные изображения TdTomato (слева) и Венеры (справа) положительные нейроны культивируется в течение 1 ч в пробирке. (C, D) Яркое поле (вверху) и комбинированные яркие полевые и флуоресцентные изображения (внизу) TdTomato (C) и Венеры положительные нейроны (D) культивируются в течение 7 дней в пробирке (DIV). Белые стрелки показывают расположение сгущенных ядер из мертвых клеток. Цветные стрелки идентифицируют флуоресцентно помеченные нейроны. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58974/58974fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58974/58974fig3.jpg"> Рисунок 3. Морфологические, электрофизиологические и синаптические свойства очищенных нейронов. (A, B) Конфокальные изображения TdTomato (A) и Венеры положительные нейроны (B) на DIV 13 и DIV 14, соответственно. Клетки представлены в черном цвете с помощью перевернутой таблицы поиска для визуализации неврита. Вставки показывают флуоресцентный сигнал, выраженный идентифицированными нейронами. (C, D) Реакция напряжения от TdTomato (C) и Венеры положительный нейрон (D) для гиперполяризации (200 до -20 pA, в 20 pA шагов) и деполяризации (200 pA) ток импульсов, полученных целыми клетками патч-зажим записей. Вставки показывают соответствующие записанные нейроны. Потенциал покоя мембраны каждой клетки показан слева от следа записи. (E, F) Представитель напряжения-зажим записи (10 с) полученные из TdTomato (E) и Венеры положительных нейронов (F). Спонтанные возбуждающие посты (EPSCs) были записаны от TdTomato положительных нейронов, поддерживается на холдинговом потенциале 50 мВ. Спонтанно происходящие ингибирующие постсинаптические события (IPSCs) были зарегистрированы с Венеры положительные нейроны поддерживается на удержание потенциал 0 мВ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58974/58974fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58974/58974fig4.jpg"> Рисунок 4. Поддержка развития нейронов с глиальной кокультурой. (A) Конфокальные изображения глиальных культур иммуномаркировки для глиальных фибрилляционных кислотных белков (GFAP, слева), кластер молекулы дифференциации (CD11b, средний) и миелин основной белок (MBP, справа). Глиальные клетки культивировались для DIV 7. (B) Изображения клеточной культуры вставки, используемые для совместной культуры глиальных клеток с очищенными нейронами в бесконтактной договоренности. (C) Схема пространственного расположения используется для совместной культуры нейронов и глии. (D, E) Конфокальные изображения TdTomato (D) и Венеры положительные нейроны (E), выросли в течение 14 дней, в отсутствие (слева) или наличие (справа) глиальной поддержки. (F, G) Текущие зажимные записи (60 с) от TdTomato (F) и Венеры положительные нейроны (G) культивируется в течение 14 дней в отсутствие (вверху) или наличие (внизу) глиальной поддержки. Нейроны были записаны на их потенциал упокоения мембраны (представлены слева от каждого следа записи). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58974/58974fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting at JoVE.com

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

Этот протокол описывает метод сортировки клеток для очистки и культуры флуоресцентных ГАМК-нейронов из неокортекса и гиппокампа послеродовых мышей или крыс.

Первичная культура клеток очищенных ГАМК или глутамергических нейронов, созданных с помощью флуоресценции активированной сортировки клеток

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...

Этот протокол описывает простой и воспроизводимый метод очистки и культивирования конкретных типов первичных нейронов. Эти культуры подходят для электрофизиологического, морфологического и анализа выживаемости. Культуры очищенных нейронов могут быть использованы для изучения основ нейронной физиологии, формирования синапсов, а также того, как развиваются нейронные сети.В то время как мы фокусируемся на корковых глутаматергических основных клетках и ГАМК-интернейронах, эта процедура может быть легко изменена для изучения любых нейронных линий, выражаюющих флуоресцентные белки. Для подготовки стеклянных обложек сначала размораживается пятимиллилитровая алицита 200 микрограмм на миллилитр PLL раствора. Разбавить этот запас раствор до 20 микрограмм на миллилитр, добавив 45 миллилитров чистой воды инъекционного класса.Затем фильтр стерилизовать раствор в новую 50 миллилитров конической трубки и этикетки этой трубки, как PLL стерильной. Далее поместите 100 стерильных круглых 12-миллиметровых стеклянных крышек в стерильный раствор PLL. Агитировать трубку каждые пять-десять минут в течение двух-трех минут, чтобы обеспечить равномерное покрытие.После 40 минут покрытия PLL, возьмите два куска бумаги и положите их плашмя в шкаф потока. Стерилизовать бумагу с помощью 70%этанола затем сгладить, чтобы удалить складки и оставить высохнуть. После покрытия стеклянные крышки в течение одного часа с PLL, удалить избыток раствора PLL и добавить стерильные инъекции класса воды.Аккуратно агитировать крышки в течение двух-трех секунд, чтобы удалить избыток PLL. Повторите этот полоскающий шаг еще два раза. Удалите излишки воды, а затем перенесите крышки на стерильную бумагу.После высыхания, передача coverslips на 24 хорошо культуры пластины. Чтобы подготовить решения клеточной культуры, измерьте 12 миллилитров буфера клеточной культуры до 15 миллилитров конической трубки и этикетки как BSA. Измерьте пять миллилитров буфера клеточной культуры до другой 15-миллилитровой трубки и этикетки как папаин.Впоследствии инкубировать обе трубки в течение 15 минут при 37 градусах по Цельсию. Добавьте 120 миллиграммов BSA в трубку с маркировкой BSA. Затем инвертировать трубку, чтобы помочь растворить раствор.Затем добавьте семь миллиграммов папаина в трубку с маркировкой папаин. Вернуть обе трубки на водяную баню в течение 15 минут. Фильтр стерилизовать раствор BSA в свежую коническую трубку.Разделите стерильный раствор BSA на три трубки и помечат каждую трубку как стерильную и одну, две или три. Теперь фильтр стерилизовать папаин трубки и этикетки трубки, как папаин стерильным. Вернуть все трубки обратно в ванну для воды и продолжать инкубировать при 37 градусов по Цельсию до использования.Чтобы подготовиться к вскрытию тканей, выложить скальпель, ножницы, типсы и шпатель, необходимые для вскрытия гиппокампа и коры головного мозга. Поместите две 35-миллиметровые чашки Петри и 100-миллиметровую чашку Петри, содержащую стерильную фильтровальную бумагу, в шкаф потока. Сбор трансгенных NexCre; Ai9 или vesicular ГАМК транспортер Венера мыши щенков, которые должны быть вскрыты с помощью флуоресцентной лампы с соответствующим возбуждением и выбросов фильтров для дискриминации флуоресцентных щенков от диких типа литровых товарищей.Непосредственно перед вскрытием животных заполните каждую чашку Петри охлажденным стерильным буфером культуры клеток. После вскрытия тщательно перенесите мозг трансгенного щенка в стерильную фильтровальную бумагу. Во-первых, вскрыть мозжечок и отделить два полушария.Затем тщательно отделить гиппокамп и кору от каждого полушария. Перенесите расчлененную ткань на 35-миллиметровую чашку Петри, содержащую буфер охлажденной клеточной культуры. Затем перенесите расчлененный гиппокамп и кору на крышку еще 35-миллиметровой чашки Петри.Используя плоский край лезвия скальпеля, тщательно нарезать ткани в движении крест, пока только мелкие кусочки остаются. Затем перенесите нарезанную ткань с небольшим количеством раствора папаина из крышки чашки Петри в стерильную трубку папаина. Инкубировать ткань при 37 градусах по Цельсию в течение 25 минут.После инкубации папаина перенесите стерильную папиновую трубку и стерильные трубки BSA в шкаф потока. Затем используйте один миллилитр Пастер пипетки для передачи только кортикогиппокампальной ткани из папинной трубки в трубку BSA один. Для того, чтобы разбить любые большие скопления тканей, тритурировать ткани несколько раз с помощью одного миллилитров Пастер пипетки.После этого, тритурировать ткани семь раз с помощью тонкой наконечник Пастер пипетки. Через 30 секунд перенесите один миллилитр нижнего раствора и ткани из трубки BSA в две трубки BSA. Тритурировать ткани в трубке BSA два раза с помощью тонкой наконечник Пастер пипетки.После тритурации перенесите один миллилитр нижней ткани и раствор из трубки BSA в три трубки BSA. Тритурат ткани в трубке BSA три раза. После тритурации перенесите весь раствор и ткани из трубок два и три в трубку BSA один.Тритурат еще два-три раза и центрифуга по 3000 раз г в течение трех минут. После центрифугации, тщательно удалить супернатант из гранулированной ткани и повторно использовать клетки с помощью P1000 пипетки в двух миллилитров полной спячки низкой флуоресценции среды. Затем тритурировать ткани 20 раз, чтобы обеспечить полное повторное успение раствора ткани.Впоследствии, филе ячейки подвески через 30 микрометровых клеток сито в полистирол образца трубки. Подготовь трубки для сортировки клеток, засовав 300 микролитров полного спячки А в необходимое количество полипропилевых трубок. Для каждого типа флуоресцентных клеток, которые должны быть отсортированы, выбрать соответствующие возбуждения и выбросов фильтров.Возбуждайте белок Венеры с помощью длины волны возбуждения 488 нанометров и обнаруживаете испускаемый свет через набор фильтров выбросов 530/40. Возбуждайте белок TdTomato с помощью длины волны возбудителей 531 нанометров и обнаруживаете испускаемый свет через набор фильтров выбросов 575/30. Для высокой чистоты сортируют ярко помеченные флуоресцентные клетки.После сортировки клеток перенесите собранные клетки в две миллилитровые круглые нижние центрифуги. Затем центрифуга клетки на 3000 раз г в течение трех минут, чтобы сформировать ячейку гранулы. Resuspend ячейки гранулы в необходимом количестве предварительно разогретой полной среды НБА для достижения плотности клеток 1000 клеток на микролитер.Чтобы подтвердить наличие диссоциированных клеток, проверьте клеточный раствор под микроскопом с помощью объектива 4X или 10X. Перед покрытием клеток, вихрь на средней скорости в течение двух-трех секунд, чтобы обеспечить ую подвеску ячейки. После вихря, быстро pipette 10 микролитров подвески клетки к центру каждого coverslip.Через час накормите клетки 500 микролитров предварительно разогретой полной среды НБА и вернитесь в инкубатор при 37 градусах по Цельсию. Для совместной культуры очищенных нейронов и глиальных клеток, прохождение глиальных клеток к необходимому количеству вставки клеточной культуры. Это делается путем покрытия 40000 глиальных клеток в 500 микролитров капли полной среды НБА.Через час перенесите глиальные клеточные культуры вставки на очищенные нейроны. Удалите излишки мультимедиа из культурных вставок и верните пластины в инкубатор для культивирования. После успешной сортировки, по покрытием нейронов должны появиться круглые формы с гладкой мембраной и следует рассматривать, чтобы сэкономить невроидов примерно через час в пробирке.К семи дням в пробирке, хотя некоторые клетки смерти может быть очевидным, жизнеспособные клетки должны присутствовать во всех условиях культуры. Анализ очищенных культур показывает, что как глутаматергические, так и ГАМК-нейроны смогли расширить аксоны и дендриты из их клеточного тела и сохранить способность генерировать потенциал действия в ответ на супер порог деполяризации текущих инъекций. Примечательно, что после очищения, только ГАМК-нейроны получили значительное количество спонтанной синаптической передачи и глутаматергических нейронов получили очень мало синаптической передачи в отсутствие глиальных клеток.Важно отметить, что культивирование очищенных нейронов с глиальными клетками улучшает рост и выживание нейронов, а также способствует синаптической передаче в глутаматергических культурах. Достаточно поляризационные покрытия coverslips и поддержания физиологических рН культуры средств массовой информации на протяжении всей процедуры являются ключом к обеспечению хорошего качества клеточных культур. Следуя этому протоколу, должна быть возможность выполнить секвенирование РНК и белковую массовую спектроскопию на очищенных культурах, позволяющую исследуемые в конкретных типах нейронов процессы перевода и транскрипции.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

Оптимизирована процедура для флуоресцентной активированного сортировки клеток (FACS) Выделение вегетативной нервной прародителей из висцеральных органов плода мышей

During development neural crest (NC)-derived neuronal progenitors migrate away from the neural tube to form autonomic ganglia in visceral organs like the ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Спецификация конечного мозга глутаматергической нейронов из стволовых клеток человека плюрипотентных

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Фосфат кальция Трансфекцию первичной нейронов гиппокампа

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Первичная культура Mouse дофаминергических нейронов

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Флуоресценция Активированный сортировки клеток (FACS) и экспрессии генов Анализ Fos-экспрессирующих Нейроны из свежих и замороженных крыс ткани головного мозга

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

Первичная культура нейронов, изолированных от эмбриональной мыши Cerebellum

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Миграция, химиотерапия, и совместно-культурные анализы для стволовых клеток человека, полученных эндотелиальных клеток и ГАМК нейронов

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

Баллистическая маркировка пирамидальных нейронов в мозговых фрагментах и в первичной культуре клеток

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...