Name: efficient differentiation of human pluripotent stem cells into liver cells
Uploaded: 2019-06-11T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells at JoVE.com

نشكر بينغ ليم على المناقشات ومعهد ستانفورد لبيولوجيا الخلايا الجذعية والطب التجديدي لدعم البنية التحتية. وقد دعم هذا العمل معهد كاليفورنيا للطب التجديدي (DISC2-10679) ومعهد ستانفورد-يو سيبير سيبل للخلايا الجذعية (إلى L.T.A. وK.M.L.) ومركز ستانفورد بيكمان للطب الجزيئي والوراثي وكذلك المجهول، [بإكستر] و [دجنوفا] أسرات (إلى [ك.م.ل.]).

1. إعداد وسائل الإعلام التمايز
ملاحظة: راجع جدول المواد للحصول على معلومات الشركة المصنعة فيما يتعلق بالمواد والكواشف المستخدمة.
<ol><li>
إعداد وسائط أساسية محددة كيميائياً (آلية التنمية النظيفة) ملاحظة: آلية التنمية النظيفة 2 وآلية التنمية النظي?...

<ol>
	<li>Bernal, W., Wendon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Liver+Failure.">Acute Liver Failure.</a> New England Journal of Medicine. 369, 2525-2534 (2013).</li><li>Ang, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Roadmap+for+Human+Liver+Differentiation+from+Pluripotent+Stem+Cells.">A Roadmap for Human Liver Differentiation from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Reports. 22, 2190-2205 (2018).</li><li>Fisher, R. A., Strom, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Hepatocyte+Transplantation:+Worldwide+Results.">Human Hepatocyte Transplantation: Worldwide Results.</a> Transplantation. 82, 441-449 (2006).</li><li>Dhawan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+human+hepatocyte+transplantation:+Current+status+and+challenges.">Clinical human hepatocyte transplantation: Current status and challenges.</a> Liver transplantation. 21, S39-S44 (2015).</li><li>Salama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+Hematopoietic+Stem+Cell+Transplantation+in+48+Patients+with+End-Stage+Chronic+Liver+Diseases.">Autologous Hematopoietic Stem Cell Transplantation in 48 Patients with End-Stage Chronic Liver Diseases.</a> Cell Transplantation. 19, 1475-1486 (2017).</li><li>Tan, A. K. Y., Loh, K. M., Ang, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+regenerative+potential+and+functionality+of+human+liver+cells+in+mice.">Evaluating the regenerative potential and functionality of human liver cells in mice.</a> Differentiation. 98, 25-34 (2017).</li><li>Loh, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Endoderm+Induction+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+by+Logically+Directing+Signals+Controlling+Lineage+Bifurcations.">Efficient Endoderm Induction from Human Pluripotent Stem Cells by Logically Directing Signals Controlling Lineage Bifurcations.</a> Cell Stem Cell. 14, 237-252 (2014).</li><li>Loh, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+Pairwise+Choices+Leading+from+Pluripotency+to+Human+Bone,+Heart,+and+Other+Mesoderm+Cell+Types.">Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types.</a> Cell. , 451-467 (2016).</li><li>Zhao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+the+efficient+metabolic+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+hepatocytes+by+correcting+specification+defects.">Promotion of the efficient metabolic maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes by correcting specification defects.</a> Cell Research. 23, 157-161 (2012).</li><li>Si Tayeb, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+generation+of+human+hepatocyte-like+cells+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells.</a> Hepatology. 51, 297-305 (2010).</li><li>Carpentier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+in+miniaturized+format+suitable+for+high-throughput+screen.">Hepatic differentiation of human pluripotent stem cells in miniaturized format suitable for high-throughput screen.</a> Stem Cell Research. 16, 640-650 (2016).</li><li>Avior, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial-derived+lithocholic+acid+and+vitamin+K2+drive+the+metabolic+maturation+of+pluripotent+stem+cells-derived+and+fetal+hepatocytes.">Microbial-derived lithocholic acid and vitamin K2 drive the metabolic maturation of pluripotent stem cells-derived and fetal hepatocytes.</a> Hepatology. 62, 265-278 (2015).</li><li>Ogawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+and+cAMP+signaling+promote+the+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+hepatocytes.">Three-dimensional culture and cAMP signaling promote the maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes.</a> Development. 140, 3285-3296 (2013).</li><li>Rostovskaya, M., Bredenkamp, N., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+consistent+generation+of+pancreatic+lineage+progenitors+from+human+pluripotent+stem+cells.">Towards consistent generation of pancreatic lineage progenitors from human pluripotent stem cells.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 370, 20140365 (2015).</li><li>Haridass, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repopulation+Efficiencies+of+Adult+Hepatocytes,+Fetal+Liver+Progenitor+Cells,+and+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Hepatic+Cells+in+Albumin-Promoter-Enhancer+Urokinase-Type+Plasminogen+Activator+Mice.">Repopulation Efficiencies of Adult Hepatocytes, Fetal Liver Progenitor Cells, and Embryonic Stem Cell-Derived Hepatic Cells in Albumin-Promoter-Enhancer Urokinase-Type Plasminogen Activator Mice.</a> The American Journal of Pathology. 175, 1483-1492 (2009).</li></ol>

هذه الطريقة تمكن من توليد السكان المخصب من الذرية برعم الكبد، والخلايا الشبيهة بالكبد في وقت لاحق، من hPSCs. القدرة على توليد السكان المخصب من خلايا الكبد البشرية مهم للاستخدام العملي لهذه الخلايا. الطرق السابقة لتوليد خلايا الكبد من hPSCs أسفرت عن مجموعات الخلايا غير النقية التي تحتوي على كل ...

الغرض من هذا البروتوكول هو التمييز بكفاءة الخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى (hPSCs) في السكان المخصب من الذرية برعم الكبد والخلايا الشبيهة بخلايا الكبد2. الوصول إلى إمدادات جاهزة من الذرية الكبد البشري والخلايا الشبيهة بخلايا الكبد تسريع الجهود للتحقيق في وظائف الكبد والمرض ويمكن تمكين علاجات زرع الخلوية الجديدة لفشل الكبد3،4، 5. وقد ثبت أن هذا الأمر ينطوي على تحديات في الماضي لأن الـ hPSCs (التي تشمل الخلايا الجذعية الجنينية والمستحثة متعددة القوى) يمكن أن تفرق في جميع أنواع الخلايا في جسم الإنسان؛ وبالتالي، كان من الصعب تمييزها حصرا إلى مجموعة نقية من نوع خلية واحدة، مثل خلايا الكبد6.
للتمييز الدقيق hPSCs في خلايا الكبد, أولاً من المهم أن نفهم ليس فقط كيف يتم تحديد خلايا الكبد ولكن أيضا كيف تتطور أنواع الخلايا غير الكبد. معرفة كيفية تطور الخلايا غير الكبدية من المهم أن تقمع منطقيا تشكيل السلالات غير الكبد ية أثناء التمايز، وبالتالي توجيه حصرا hPSCs نحو مصير الكبد2. ثانياً، من الضروري تحديد الخطوات التنموية المتعددة التي تميز من خلالها المراكز hPSCs نحو مصير الكبد. ومن المعروف أن hPSCs تميز بالتتابع إلى أنواع متعددة من الخلايا المعروفة باسم خط البدائية (APS)، endoderm النهائي (DE)، القلفة الخلفية (PFG) وذرية برعم الكبد (LB) قبل تشكيل الخلايا الشبيهة بالخلايا الكبدية (HEP). كشف العمل في وقت سابق عن إشارات تحدد مصير الكبد والإشارات التي قمعت تشكيل أنواع الخلايا البديلة غير الكبد (بمافي ذلك المعدة والبنكرياس والذرية المعوية) في كل اختيار النسب التنموي2، 7 , 8.
وبشكل جماعي، أدت هذه الرؤى إلى طريقة أحادية الطبقة خالية من المصل للتمييز بين hPSCs نحو خط بدائي، بطانة الجلد النهائي، القلفة الخلفية، الذرية برعم الكبد وأخيرا، الخلايا الشبيهة بالخلايا الكبدية2. وبشكل عام، تنطوي الطريقة على بذر الـ hPSCs في طبقة أحادية الكثافة، وإعداد ستة كوكتيلات من وسائط التمايز (التي تحتوي على عوامل نمو وجزيئات صغيرة تنظم مختلف مسارات الإشارات التنموية)، إضافة هذه الوسائط بالتتابع للحث على التمييز على مدى 18 يوما. خلال هذه العملية، لا حاجة إلى تمرير الخلايا. من الجدير بالذكر، لأن هذه الطريقة تشمل صراحة الإشارات التي تقمع تشكيل أنواع الخلايا غير الكبدية، وهذا النهج التمايز1 أكثر كفاءة يولد الذرية الكبد والخلايا الشبيهة بالخلايا الكبدية بالمقارنة مع الموجودة طرقالتمايز 2،9،10،11،12. وعلاوة على ذلك، فإن البروتوكول الموصوف في هذا النص يتيح الجيل الأسرع من خلايا الكبد التي تعبر في نهاية المطاف عن مستويات أعلى من عوامل النسخ الكبدي والانزيمات من تلك التي تنتجها بروتوكولات أخرى9،10 , 11 , 12.
البروتوكول الموضح هنا له مزايا معينة على بروتوكولات التمايز الحالية. أولاً، ينطوي على تمايز أحادي الطبقة بين hPSCs، وهو أبسط من الناحية الفنية مقارنة بأساليب التمايز ثلاثية الأبعاد، مثل تلك التي تعتمد على الأجسام الجنينية13. ثانيا، يستغل هذا الأسلوب تقدما في الآونة الأخيرة حيث خلايا endoderm النهائي (مقدمة مبكرة لخلايا الكبد) يمكن أن تولد بكفاءة وسرعة في غضون 2 أيام من التمايز hPSC2،7، وبالتالي تمكين اللاحقة إنتاج خلايا الكبد مع زيادة النقاء. ثالثا، في مقارنات جنبا إلى جنب، والخلايا الشبيهة بخلايا الكبد التي تنتجها هذه الطريقة2 تنتج المزيد من ALBUMIN والتعبير عن مستويات أعلى من عوامل النسخ الكبدي والانزيمات مقارنة مع خلايا الكبد المنتجة في طرق أخرى10، 11و12 .

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >&#160;Geltrex</td>
			<td >Thermofisher Scientific</td>
			<td >A1569601</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1:1 DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.2&#160;&#956;m pore membrane filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GTTP02500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mTeSR1</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thiazovivin</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>3845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >&#160;Accutase</td>
			<td>Gibco or Millipore&#160;</td>
			<td>Gibco A11105, Millipore&#160; SCR005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >IMDM, GlutaMAX&#8482; Supplement</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>31980030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ham&#39;s F-12 Nutrient Mix, GlutaMAX&#8482; Supplement</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>31765035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >KOSR, Knockout serum replacement</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly(vinyl alcohol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;&#160;</td>
			<td>P8136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Transferrin&#160;</td>
			<td >Sigma-Aldrich&#160;&#160;</td>
			<td >10652202001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chemically Defined Lipid Concentrate</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td >11905031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >human Activin</td>
			<td >R&#38;D</td>
			<td>338-AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CHIR99201</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>4423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PI103</td>
			<td >Tocris</td>
			<td >2930/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >human FGF2</td>
			<td >R&#38;D</td>
			<td>233-FB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DM3189</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>6053/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >A83-01</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>2939/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Human BMP4</td>
			<td >R&#38;D</td>
			<td>314-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C59</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>5148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TTNPB</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>0761/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Forskolin</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>1099/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Oncostatin M</td>
			<td >R&#38;D</td>
			<td>295-OM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dexamethasone</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>1126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ro4929097</td>
			<td >Selleck Chem</td>
			<td>S1575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AA2P</td>
			<td>Cayman chemicals</td>
			<td>16457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >human recombinant Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;&#160;</td>
			<td>11061-68-0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient differentiation of human pluripotent stem cells into liver cells

يزيل الكبد السموم من المواد الضارة، ويفرز البروتينات الحيوية، وينفذ الأنشطة الأيضية الرئيسية، وبالتالي الحفاظ على الحياة. وبالتالي، فإن فشل الكبد - الذي يمكن أن ينجم عن تناول الكحول المزمن، والتهاب الكبد، والتسمم الحاد، أو غيرها من الإهانات - هو حالة خطيرة يمكن أن تتوج بالنزيف واليرقان والغيبوبة والموت في نهاية المطاف. ومع ذلك, وقد أحبطت نُهج لعلاج فشل الكبد, فضلا عن دراسات وظائف الكبد والمرض, جزئيا بسبب عدم وجود إمدادات وفيرة من خلايا الكبد البشرية. ولهذا الغرض، يفصّل هذا البروتوكول التمايز الفعال للخلايا الجذعية البشرية المتعددة القوى (hPSCs) في الخلايا الشبيهة بخلايا الكبد، مسترشدة بخارطة طريق تنموية تصف كيفية تحديد مصير الكبد عبر ست خطوات تمايز متتالية. من خلال التلاعب مسارات الإشارات التنموية لتعزيز تمايز الكبد وقمع تشكيل مصائر الخلايا غير المرغوب فيها بشكل صريح، تولد هذه الطريقة بكفاءة مجموعات من الذرية برعم الكبد البشري والخلايا الشبيهة بالكبد بحلول أيام 6 و18 من التمايز PSC، على التوالي. ويتحقق ذلك من خلال التحكم الدقيق زمنياً في مسارات الإشارات التنموية، التي تمارسها الجزيئات الصغيرة وعوامل النمو في وسط ثقافة خالية من المصل. التمايز في هذا النظام يحدث في الطبقات الأحادية وينتج الخلايا الشبيهة بخلايا الكبد التي تعبر عن إنزيمات خلايا الكبد المميزة ولها القدرة على تطعيم نموذج الماوس من فشل الكبد المزمن. القدرة على توليد بكفاءة أعداد كبيرة من خلايا الكبد البشرية في المختبر له تداعيات لعلاج فشل الكبد، لفحص المخدرات، وللدراسات الميكانيكية لأمراض الكبد.

بعد 24 ساعة من التمايز APS، سوف تعتمد المستعمرات عموما مورفولوجيا مختلفة من المستعمرات غير المتمايزة المصاحبة لفقدان الحدود المشرقة التي عادة ما تحصر مستعمرات hPSC. من الناحية الشكلية، خلايا خط بدائية عموما لها حدود خشنة وأكثر انتشارا وأقل إحكاما من hPSCs-هذا هو مذكر من الانتق...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells at JoVE.com

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

يفصّل هذا البروتوكول طريقة أحادية الطبقة وخالية من المصل لتوليد خلايا شبيهة بخلايا الكبد بكفاءة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى (hPSCs) في غضون 18 يومًا. وهذا ينطوي على ست خطوات كما hPSCs تميز بالتتابع إلى أنواع الخلايا المتوسطة مثل خط البدائية, endoderm النهائي, القلفة الخلفية وذرية برعم الكبد قبل تشكيل الخلايا الشبيهة بالكبد.

التمايز الفعال للخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى في خلايا الكبد

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

هذه الطريقة تمكن من توليد أعداد كبيرة من السلف برعم الكبد البشري وخلايا تشبه الكبد مع نقاء عالية. القدرة على توليد خلايا الكبد هذه يمكن أن تكون مهمة للطب التجديدي وغيرها من المجالات. من خلال التحكم في مسارات الإشارات التنموية لتعزيز تمايز الكبد وقمع تشكيل أنواع الخلايا غير المرغوب فيها ، تمكن هذه الطريقة من التوليد الفعال لذريات برعم الكبد البشري والخلايا الشبيهة بال الكبد من قبل ستة أيام و 18 يومًا من التمايز على التوالي.الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي النقاء العالي لخلايا الكبد البشرية التي تولدت. إلى كونه هذا الإجراء، إضافة 50 ملليلتر من IMDM إلى قارورة مخروطية تحتوي على شريط ضجة. سخني متوسطة إلى 50 درجة مئوية وأضيف 0.5 جرام من PVA مع التحريك المستمر لإعداد مخزون PVA بتركيز 10 ملليغرام لكل ملليلتر.بعد ذلك، قم بإزالة محلول PVA من وسادة التدفئة والسماح لها بالتهدئة إلى درجة حرارة الغرفة. بمجرد تبريد الحل، فلتره من خلال مرشح ميكرومتر معقمة، 0.2. إعداد آلية التنمية النظيفة 2 و CDM3 عن طريق الجمع بين PVA المصفاة مع الكواشف الأخرى على النحو المبين في الجدول الأول من بروتوكول النص.استخدم فلتر ميكرومتر معقمة، 0.2 لتصفية جميع الوسائط. ثم إعداد الوسائط الأساسية المتبقية، CDM4 و CDM5، على النحو المبين في الجدول الأول من البروتوكول النصي. لإعداد التمايز المتوسط، أولاً ذوبان الجزيئات الصغيرة المجمدة و/ أو عوامل النمو في درجة حرارة الغرفة.Aliquot خارج المبلغ المطلوب من متوسطة الأساس وإضافة الجزيئات الصغيرة المحددة وعوامل النمو إلى وسط القاعدة في التركيزات المناسبة. في اليوم السابق للاستخدام، ذوبان المصفوفة في أربع درجات مئوية. في اليوم التالي، تمييع المصفوفة بنسبة 1 إلى 100 عن طريق إضافة 500 ميكرولترات من المصفوفة إلى 50 ملليلتر من DMEM الباردة.الماصات المصفوفة المخففة في العدد المطلوب من الآبار باستخدام كمية كافية من الحل لتغطية سطح البئر. نقل لوحة مكسوة بالمصفوفة إلى حاضنة في 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة على الأقل. مباشرة قبل البذر، الطامح حل المصفوفة المتبقية من الآبار المغلفة.ثم، الطامح المتوسطة من لوحة ثقافة hPSC التقاء إلى حد كبير وإضافة وكيل تفكك اشترى تجاريا، مع التأكد من استخدام ما يكفي لتغطية السطح الذي تنمو الخلايا. احتضان hPSCs في وكيل تفكك في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق أو حتى تبدأ بعض المستعمرات فصل. بعد ذلك، إضافة DMEM و F-12 لتمييع عامل الانفصام.استخدام ماصة المصلية خمسة ملليلتر إلى ماص بلطف صعودا وهبوطا عدة مرات لغسل قبالة جميع الخلايا من سطح البئر. جمع الخلايا المفردة التي أعيد اعتمادها في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر وتمييع مع DMEM وF-12 حسب الحاجة. أجهزة الطرد المركزي هذا الأنبوب من hPSCs التي تم جمعها في 350 مرات ز و4 درجات مئوية لمدة ثلاث دقائق ل بيليه الخلايا.في انتظار الطرد المركزي، التبخر المصفوفة من لوحة التي سيتم بذر hPSCs. إضافة كمية كافية من الوسائط mTeSR إلى آبار المستلمين لتغطيتها. عندما يكون الطرد المركزي كاملاً، يُطلق التعرق بعناية، تاركاً الهدّانات المُتَركِة في الجزء السفلي من الأنبوب المخروطي.Resuspend بيليه الخلية في mTeSR تكملها بميكروفولالار واحد من الثيازوفيفين التي تم الحصول عليها تجاريا. باستخدام ماصة P1000، triturate بلطف مرتين إلى ثلاث مرات لإعادة بوزن بالتساوي بيليه الخلية في تعليق خلية واحدة. على الفور ماصة 10 ميكرولترات من تعليق الخلية في قياس الهيموسيتات وعد عدد الخلايا.ضبط حجم hpscs resuspended مع الثيازوفيين المكمل mTeSR لتحقيق التركيز المطلوب الخلية للطلاء. ثم، يهز لوحة في نمط الصليب عدة مرات للتأكد من أن يتم توزيع الخلايا بالتساوي. بعد أن تم مطلي hPSCs لمدة 24 ساعة على الأقل، استخدم مجهر النقيض المرحلة للتحقق من مورفولوجيا الخلايا مع التركيز بشكل خاص على قطر المستعمرات hPSC مطلي.بعد ذلك، إعداد يوم واحد APS التمايز المتوسطة كما هو مبين في الجدول الثاني من بروتوكول النص. بعد يوم واحد من البذر، الطامح mTeSR ثيوزافيفين الملحق من hPSCs مطلي وغسلها لفترة وجيزة مع وسائل الإعلام IMDM. بعد ذلك، إضافة يوم واحد المتوسطة إلى hPSCs.تسجيل الوقت ووضع الخلايا مرة أخرى في الحاضنة في 37 درجة مئوية. الاستمرار في خطوات التمايز اللاحقة من خلال إعداد وسيط التمايز المطلوب وإضافته إلى الخلايا في أيام التمايز الخاصة به في نفس الوقت من اليوم تقريبًا. في هذه الدراسة، يتم إنشاء مجموعات من النسل برعم الكبد والخلايا الشبيهة بال الكبد في وقت لاحق من hPSCs.في اليوم الثاني من التمايز ، وقد تم تمييز الخلايا المتتالية البدائية في اليوم الثاني خلايا endoderm نهائية. الغالبية العظمى من هذه الخلايا تعبر عن SOX17 و FOXA2. بحلول اليوم الثالث من التمايز ، وقد تم تمييز الخلايا endoderm إلى السلف التي تظهر متعددة الأضلاع في الشكل.في وقت لاحق، بحلول اليوم السادس، وقد تميز السلف foregut إلى السلف برعم الكبد. هذه السلف برعم الكبد التعبير عن وكالة فرانس برس, TPX3, وHNF4alpha. عبر ثلاثة خطوط hPSC، هذه الطريقة يولد اليوم ستة مستجدات الكبد الإيجابي AFP في كفاءة ما يقرب من 89٪ أخيرا، بعد 18 يوما من تمايز الكبد من hPSCs، الألبومين إيجابية خلايا تشبه الكبد تظهر.مورفولوجيا، هذه الخلايا تظهر الظهارية، وتشكيل الحدود مشرق تذكرنا bile canaliculi. في هذه المرحلة، السيتوبلازم من اليوم 18 hPSC المشتقة خلايا الكبد يظهر أغمق من النواة. عند بذر الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات للتمايز ، لا بد من زرعها في الكثافة الصحيحة وكذلك توزيعها عبر البئر عن طريق هز الطبق.القدرة على إنتاج الكبدات البشرية في المختبر هو التكنولوجيا التمكينية التي من شأنها أن تسمح للعلماء للتحقيق في الآليات الكامنة في تطوير الكبد. ينتج هذا الأسلوب أعداد كبيرة من خلايا الكبد البشرية في المختبر والتي يمكن استخدامها للتحقيق في وظائف الكبد والمرض وتمكين العلاجات الجديدة في نهاية المطاف لفشل الكبد.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

وجه التفريق بين فروعه المكونة للدم البدائي والنهائي من الخلايا الجذعية Pluripotent البشرية

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

التمايز كفاءة الخلايا الجذعية المحفزة لNKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; البنكرياس أسلاف

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

في المختبر تمايز متعددة القدرات البشرية الخلايا الجذعية إلى خلايا الأرومة الغاذية

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Protocol for the Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mixed Cultures of Neurons and Glia for Neurotoxicity Testing

بروتوكول لتمييز الخلايا الجذعية المحفزة البشرية المستحثة في الثقافات المختلطة من الخلايا العصبية والجلد للاختبار العصبي

Human pluripotent stem cells can differentiate into various cell types that can be applied to human-based in vitro toxicity assays. One major advantage is ...

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

في المختبر تمايز الخلايا الجذعية البشرية الوسيطة إلى الفنية كارديوميوسيتي مثل الخلايا

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

التفريق بين الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية من الخلايا الجذعية Pluripotent المستحث أو الجنينية البشرية سريعة وموجهة

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

فعالة وقابلة للتمايز الموجهة متوافقة سريرياً القرنية حوفي طلائي الخلايا الجذعية من الخلايا الجذعية Pluripotent البشرية

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

في المختبر توليد المشتقات سميط من البشرية التي يسببها الخلايا الجذعية Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation

العلاج العابر للخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى مع DMSO لتعزيز التمايز

Despite the growing use of pluripotent stem cells (PSCs), challenges in efficiently differentiating embryonic and induced pluripotent stem cells (ESCs and ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

كفاءه التمايز العصبي باستخدام ثقافة خليه واحده من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...