Name: efficient differentiation of human pluripotent stem cells into liver cells
Uploaded: 2019-06-11T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells at JoVE.com

Vi takker Bing lim for diskussioner og Stanford Institute for stamcelle biologi & regenerativ medicin til infrastruktur støtte. Dette arbejde blev støttet af California Institute for regenerative Medicine (DISC2-10679) og Stanford-UC Berkeley Siebel Stem Cell Institute (til L.T.A. og K.M.L.) og Stanford Beckman Center for molekylær og genetisk medicin samt den anonyme, Baxter og DiGenova familier (til K.M.L.).

1. forberedelse af differentierings medier
Bemærk: Der henvises til tabellen over materialer for producentens oplysninger om de anvendte materialer og reagenser.
<ol><li>
Klargøring af base kemisk definerede medier (CDM) Bemærk: CDM2, CDM3, CDM4 og CDM5 er kemisk definerede medier, der bruges som base medier til at differentiere hPSCs til leverceller på forskellige stadier. Sammensætningen af disse medier kan findes i tabel 1...

<ol>
	<li>Bernal, W., Wendon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Liver+Failure.">Acute Liver Failure.</a> New England Journal of Medicine. 369, 2525-2534 (2013).</li><li>Ang, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Roadmap+for+Human+Liver+Differentiation+from+Pluripotent+Stem+Cells.">A Roadmap for Human Liver Differentiation from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Reports. 22, 2190-2205 (2018).</li><li>Fisher, R. A., Strom, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Hepatocyte+Transplantation:+Worldwide+Results.">Human Hepatocyte Transplantation: Worldwide Results.</a> Transplantation. 82, 441-449 (2006).</li><li>Dhawan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+human+hepatocyte+transplantation:+Current+status+and+challenges.">Clinical human hepatocyte transplantation: Current status and challenges.</a> Liver transplantation. 21, S39-S44 (2015).</li><li>Salama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+Hematopoietic+Stem+Cell+Transplantation+in+48+Patients+with+End-Stage+Chronic+Liver+Diseases.">Autologous Hematopoietic Stem Cell Transplantation in 48 Patients with End-Stage Chronic Liver Diseases.</a> Cell Transplantation. 19, 1475-1486 (2017).</li><li>Tan, A. K. Y., Loh, K. M., Ang, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+regenerative+potential+and+functionality+of+human+liver+cells+in+mice.">Evaluating the regenerative potential and functionality of human liver cells in mice.</a> Differentiation. 98, 25-34 (2017).</li><li>Loh, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Endoderm+Induction+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+by+Logically+Directing+Signals+Controlling+Lineage+Bifurcations.">Efficient Endoderm Induction from Human Pluripotent Stem Cells by Logically Directing Signals Controlling Lineage Bifurcations.</a> Cell Stem Cell. 14, 237-252 (2014).</li><li>Loh, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+Pairwise+Choices+Leading+from+Pluripotency+to+Human+Bone,+Heart,+and+Other+Mesoderm+Cell+Types.">Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types.</a> Cell. , 451-467 (2016).</li><li>Zhao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+the+efficient+metabolic+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+hepatocytes+by+correcting+specification+defects.">Promotion of the efficient metabolic maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes by correcting specification defects.</a> Cell Research. 23, 157-161 (2012).</li><li>Si Tayeb, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+generation+of+human+hepatocyte-like+cells+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells.</a> Hepatology. 51, 297-305 (2010).</li><li>Carpentier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+in+miniaturized+format+suitable+for+high-throughput+screen.">Hepatic differentiation of human pluripotent stem cells in miniaturized format suitable for high-throughput screen.</a> Stem Cell Research. 16, 640-650 (2016).</li><li>Avior, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial-derived+lithocholic+acid+and+vitamin+K2+drive+the+metabolic+maturation+of+pluripotent+stem+cells-derived+and+fetal+hepatocytes.">Microbial-derived lithocholic acid and vitamin K2 drive the metabolic maturation of pluripotent stem cells-derived and fetal hepatocytes.</a> Hepatology. 62, 265-278 (2015).</li><li>Ogawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+and+cAMP+signaling+promote+the+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+hepatocytes.">Three-dimensional culture and cAMP signaling promote the maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes.</a> Development. 140, 3285-3296 (2013).</li><li>Rostovskaya, M., Bredenkamp, N., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+consistent+generation+of+pancreatic+lineage+progenitors+from+human+pluripotent+stem+cells.">Towards consistent generation of pancreatic lineage progenitors from human pluripotent stem cells.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 370, 20140365 (2015).</li><li>Haridass, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repopulation+Efficiencies+of+Adult+Hepatocytes,+Fetal+Liver+Progenitor+Cells,+and+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Hepatic+Cells+in+Albumin-Promoter-Enhancer+Urokinase-Type+Plasminogen+Activator+Mice.">Repopulation Efficiencies of Adult Hepatocytes, Fetal Liver Progenitor Cells, and Embryonic Stem Cell-Derived Hepatic Cells in Albumin-Promoter-Enhancer Urokinase-Type Plasminogen Activator Mice.</a> The American Journal of Pathology. 175, 1483-1492 (2009).</li></ol>

Denne metode muliggør generering af berigede populationer af lever opløbet progenitors, og efterfølgende hepatocyte-lignende celler, fra hPSCs. Evnen til at generere berigede populationer af humane leverceller er vigtig for den praktiske anvendelse af sådanne celler. Tidligere metoder til at generere hepatocytter fra hPSCs gav uren cellepopulationer, der indeholder både leveren og ikke-leveren celler, der, ved transplantation til gnavere, gav knogle og brusk i tillæg til leveren væv15. Derf...

Formålet med denne protokol er effektivt at differentiere humane pluripotente stamceller (hpscs) til berigede populationer af lever opløbet forfædre og hepatocyte-lignende celler2. Adgang til en klar levering af humane lever progenitorer og hepatocyte-lignende celler vil fremskynde bestræbelserne på at undersøge leverfunktion og sygdom og kunne muliggøre nye cellulære transplantations terapier for leversvigt3,4, 5. Dette har vist sig udfordrende i fortiden, da hPSCs (som omfatter embryonale og inducerede pluripotente stamceller) kan differentiere i alle celle-typer af den menneskelige krop; Det har derfor været vanskeligt udelukkende at skelne dem til en ren population af en enkelt celletype, såsom leverceller6.
For præcist at differentiere hPSCs i leverceller, først er det afgørende at forstå ikke kun hvordan leverceller er specificeret, men også hvordan ikke-lever celle-typer udvikle. Viden om, hvordan ikke-leverceller udvikle er vigtigt at logisk undertrykke dannelsen af ikke-leveren nedstamningens under differentiering, og dermed udelukkende vejlede hpscs i retning af en lever skæbne2. For det andet er det vigtigt at afgrænse de mange udviklingsmæssige trin, hvorigennem hPSCs differentierer mod en lever skæbne. Det er kendt, at hpscs sekventielt differentiere i flere celle-typer kendt som primitive streak (APS), definitive endoderm (de), posterior foregut (PFG) og lever bud forfædre (lb) før danner hepatocyte-lignende celler (HEP). Tidligere arbejde afslørede de signaler, der specificerer leveren skæbne og de signaler, som undertrykt dannelsen af alternative ikke-leveren celle-typer (herunder mave, bugspytkirtel, og tarm progenitors) på hver udviklingsmæssige Lineage valg2, 7 , 8.
Kollektivt, disse indsigter har givet anledning til en serum-fri, enkeltlags metode til at differentiere hpscs mod primitive streak, definitive endoderm, posterior forgut, lever bud forfædre og endelig, hepatocyte-lignende celler2. Samlet metoden indebærer såning af hpscs i en enkeltlags i en passende tæthed, forbereder seks cocktails af differentiering medier (indeholdende vækstfaktorer og små molekyler, der regulerer forskellige udviklingsmæssige signalering veje), og sekventielt tilføje disse medier til at inducere differentiering i løbet af 18 dage. Under processen, ingen passaging af celler er nødvendig. Bemærk, fordi denne metode eksplicit omfatter signaler, der undertrykker dannelsen af ikke-lever celle-typer, denne differentiering tilgang1 mere effektivt genererer lever progenitorer og hepatocyte-lignende celler i forhold til eksisterende differentierings metode2,9,10,11,12. Desuden giver den protokol, der er beskrevet i denne tekst, mulighed for hurtigere generering af hepatocytter, som i sidste ende udtrykker højere niveauer af hepatiske transkriptionsfaktorer og enzymer end dem, der produceres af andre protokoller9,10 , 11 , 12.
Den her beskrevne protokol har visse fordele i forhold til de nuværende differentierings protokoller. For det første, det indebærer enkeltlags differentiering af hpscs, som er teknisk enklere i forhold til tredimensionelle differentierings metoder, såsom dem, der er afhængige af embryooide organer13. For det andet udnytter denne metode et nyligt fremskyndet, hvorved definitive endoderm-celler (en tidlig forløber for leverceller) kan genereres effektivt og hurtigt inden for 2 dage efter hpsc-differentiering på2,7, hvilket gør det muligt at fremstilling af hepatocytter med øget renhed. For det tredje, i side-by-side sammenligninger, hepatocyte-lignende celler produceret af denne metode2 PRODUCERE mere ALBUMIN og udtrykke højere niveauer af hepatiske transkriptionsfaktorer og enzymer i forhold til hepatocytter produceret i andre metoder10, 11,12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >&#160;Geltrex</td>
			<td >Thermofisher Scientific</td>
			<td >A1569601</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1:1 DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.2&#160;&#956;m pore membrane filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GTTP02500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mTeSR1</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thiazovivin</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>3845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >&#160;Accutase</td>
			<td>Gibco or Millipore&#160;</td>
			<td>Gibco A11105, Millipore&#160; SCR005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >IMDM, GlutaMAX&#8482; Supplement</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>31980030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ham&#39;s F-12 Nutrient Mix, GlutaMAX&#8482; Supplement</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>31765035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >KOSR, Knockout serum replacement</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly(vinyl alcohol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;&#160;</td>
			<td>P8136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Transferrin&#160;</td>
			<td >Sigma-Aldrich&#160;&#160;</td>
			<td >10652202001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chemically Defined Lipid Concentrate</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td >11905031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >human Activin</td>
			<td >R&#38;D</td>
			<td>338-AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CHIR99201</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>4423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PI103</td>
			<td >Tocris</td>
			<td >2930/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >human FGF2</td>
			<td >R&#38;D</td>
			<td>233-FB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DM3189</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>6053/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >A83-01</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>2939/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Human BMP4</td>
			<td >R&#38;D</td>
			<td>314-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C59</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>5148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TTNPB</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>0761/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Forskolin</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>1099/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Oncostatin M</td>
			<td >R&#38;D</td>
			<td>295-OM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dexamethasone</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>1126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ro4929097</td>
			<td >Selleck Chem</td>
			<td>S1575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AA2P</td>
			<td>Cayman chemicals</td>
			<td>16457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >human recombinant Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;&#160;</td>
			<td>11061-68-0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient differentiation of human pluripotent stem cells into liver cells

Leveren afgifte skadelige stoffer, udskiller vitale proteiner, og udfører vigtige metaboliske aktiviteter, dermed opretholde livet. Derfor leversvigt — som kan være forårsaget af kronisk indtagelse af alkohol, hepatitis, akut forgiftning, eller andre fornærmelser — er en alvorlig tilstand, der kan kultivere i blødning, gulsot, koma, og i sidste ende døden. Men, tilgange til behandling af leversvigt, samt undersøgelser af leverfunktion og sygdom, er blevet forpurret delvis af manglen på en rigelig forsyning af humane leverceller. Med henblik herpå indeholder denne protokol en detaljeret beskrivelse af den effektive differentiering af humane pluripotente stamceller (hPSCs) i hepatocytter-lignende celler, som styres af en udviklings køreplan, der beskriver, hvordan lever skæbnen specificeres i seks på hinanden følgende differentierings trin. Ved at manipulere udviklingsmæssige signalerings veje for at fremme lever differentiering og eksplicit undertrykke dannelsen af uønskede celle skæbner, genererer denne metode effektivt populationer af humane lever opløbet progenitorer og hepatocytter-lignende celler ved dage 6 og 18 i henholdsvis PSC-differentieringen. Dette opnås gennem den tidsmæssigt præcise kontrol af udviklingsmæssige signalerings veje, der udøves af små molekyler og vækstfaktorer i et serumfrit kulturmedium. Differentiering i dette system forekommer i monolag og udbytter hepatocyt-lignende celler, der udtrykker karakteristiske hepatocyt enzymer og har evnen til at forankret en musemodel af kronisk leversvigt. Evnen til effektivt at generere et stort antal humane leverceller in vitro har forgreninger til behandling af leversvigt, for Drug screening, og for Mekanistiske undersøgelser af leversygdom.

Efter 24 timers differentiering vil kolonier generelt indtage en anden morfologi end udifferentierede kolonier samtidig med tab af den lyse grænse, der typisk omgår hPSC-kolonier. Morfologisk, primitive streak celler generelt har Ragged grænser og er mere spredt og mindre kompakt end hPSCs-dette er stemningsfulde af en epitelial-til-mesenchymal overgang som pluripotente epiblast celler differentiere og indtrængning i den primitive stribe in vivo. Hvis koloni størrelsen af hPSCs før ...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells at JoVE.com

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Denne protokol beskriver en monolayer, serum-fri metode til effektivt at generere hepatocyte-lignende celler fra humane pluripotente stamceller (hPSCs) i 18 dage. Dette indebærer seks trin som hpscs sekventielt differentiere til mellemliggende celle-typer såsom primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut og lever opløbet forfædre før dannelse hepatocyte-lignende celler.

Effektiv differentiering af humane pluripotente stamceller i leverceller

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Denne metode gør det muligt at genere et stort antal menneskelige lever budfader og hepatocyte-lignende celler med høj renhed. Evnen til at generere disse leverceller kan være vigtigt for regenerativ medicin og andre områder. Ved at kontrollere de udviklingsmæssige signalering veje til at fremme lever differentiering og undertrykke dannelsen af uønskede celletyper, denne metode muliggør effektiv generation af menneskelige lever budgenitorer og hepatocyte-lignende celler med seks og 18 dages differentiering henholdsvis.Den største fordel ved denne teknik er den høje renhed af de menneskelige leverceller genereret. Til denne fremgangsmåde tilsættes 50 milliliter IMDM til en konisk kolbe med rørestang. Medium til 50 grader Celsius opvarmes, og der tilsættes 0,5 g PVA, mens der hele tiden gribes om for at forberede en PVA-bestand i en koncentration på 10 mg pr. milliliter.Derefter fjernes PVA-opløsningen fra varmepuden, og den køles ned til stuetemperatur. Når opløsningen er afkølet, filtreres den gennem et sterilt 0,2 mikrometerfilter. Forbered CDM2 og CDM3 ved at kombinere den filtrerede PVA med andre reagenser som beskrevet i tabel et af tekstprotokollen.Brug et sterilt 0,2 mikrometerfilter til at filtrere alle medier. Derefter forberede de resterende base medier, CDM4 og CDM5, som skitseret i tabel en af tekstprotokollen. For at forberede differentieringsmediet skal du først tø de frosne små molekyler og/eller vækstfaktorer op ved stuetemperatur.Aliquot ud den nødvendige mængde af base medium og tilsæt de angivne små molekyler og vækstfaktorer til basismediet ved passende koncentrationer. Dagen før brug, tø matrixen ved fire grader Celsius. Den næste dag fortyndes matrixen i et forhold på en til 100 ved at tilføje 500 mikroliter matrix i 50 milliliter kold DMEM.Pipette den fortyndede matrix i det nødvendige antal brønde ved hjælp af lige nok mængde opløsning til at dække overfladen af brønden. Den matrixbelagte plade overføres til en inkubator ved 37 grader Celsius i mindst 60 minutter. Umiddelbart før såning, aspirere den resterende matrix opløsning fra belagte brønde.Derefter aspirere mediet fra en stort set sammenløbet hPSC kultur plade og tilsæt kommercielt købt dissociation agent, og sørg for at bruge lige nok til at dække overfladen, hvor cellerne vokser. Inkuber hPSCs i dissociation agent ved 37 grader Celsius i fem minutter, eller indtil nogle kolonier begynder at løsne. Dernæst tilsættes DMEM og F-12 for at fortynde dissociationsmidlet.Brug en fem milliliter serologisk pipette til forsigtigt pipette op og ned flere gange for at vaske alle celler fra overfladen af brønden. De resuspenderede enkeltceller opsamls i et konisk rør på 50 milliliter og fortyndes med DMEM og F-12 efter behov. Centrifuge dette rør af indsamlede hPSCs ved 350 gange g og ved fire grader Celsius i tre minutter til pellet cellerne.Mens du venter på centrifugering, aspirere matrix fra pladen, hvor hPSCs vil blive seedet. Føj en tilstrækkelig mængde mTeSR-medier til modtagertæterne til at dække dem. Når centrifugering er færdig, skal du forsigtigt aspirere supernatanten, så de pelleterede hPSC'er i bunden af det koniske rør efterlades.Resuspend cell pellet i mTeSR suppleret med en mikromolar af kommercielt fremstillet Thiazovivin. Ved hjælp af en P1000 pipette triturate forsigtigt to til tre gange for jævnt resuspenderede cellepille i en enkelt celle suspension. Straks pipette 10 mikroliter af cellen suspension i et hæmocytometer og tælle antallet af celler.Juster mængden af de resuspenderede hPSCs med Thiazovivin-suppleret mTeSR for at opnå den ønskede cellekoncentration for plettering. Ryst derefter pladen i et krydsmønster flere gange for at sikre, at cellerne er jævnt fordelt. Når hPSC'erne er blevet belagt i mindst 24 timer, skal der anvendes et fasekontrastmikroskop til at kontrollere cellernes morfologi med særlig vægt på diameteren af belagte hPSC-kolonier.Derefter forberede dag en APS differentiering medium som skitseret i tabel to i tekstprotokollen. En dag efter såning, aspirere Thiazovivin-suppleret mTeSR fra belagte hPSCs og kort vaske dem med IMDM medier. Derefter skal du tilføje dag ét medie til hPSCs.Optag tiden og placer cellerne tilbage i kuvøsen ved 37 grader Celsius. Fortsæt med de efterfølgende differentieringstrin ved at forberede det nødvendige differentieringsmedium og tilføje det til cellerne på de respektive dage med differentiering omkring samme tidspunkt på dagen. I denne undersøgelse, berigede populationer af levernæpper progenitorer og efterfølgende hepatocyte-lignende celler er genereret fra hPSCs.Ved dag to af differentiering, primitive streak celler har differentieret i dag to endelige endoderm celler. Langt størstedelen af disse celler udtrykker SOX17 og FOXA2. Ved dag tre af differentiering, endoderm celler har differentieret i foregut stamfædre, der vises polygonale i form.Senere, ved dag seks, foregut stamfædre har differentieret i leverknopper stamfædre. Disse levernæver stamfader udtrykke AFP, TPX3, og HNF4alpha. På tværs af tre hPSC linjer, denne metode genererer dag seks AFP-positive lever stamfader på en effektivitet på ca 89%Endelig, efter 18 dages lever differentiering fra hPSCs, albumin-positive hepatocyte-lignende celler vises.Morfologisk, disse celler synes epitel, danner lyse grænser, der minder om galde canaliculi. På dette stadium, cytoplasma af dagen 18 hPSC-afledte hepatocytter synes mørkere end kernen. Når såning menneskelige pluripotente stamceller til differentiering, er det bydende nødvendigt at frø dem på den rigtige tæthed og også at distribuere dem på tværs af brønden ved at ryste pladen.Evnen til at producere menneskelige hepatocytter in vitro er en aktiverende teknologi, der vil give forskerne mulighed for at undersøge mekanismer underliggende leverudvikling. Denne metode producerer et stort antal menneskelige hepatocytter in vitro, som kan bruges til at undersøge leverfunktion og sygdom og til sidst muliggøre nye behandlingsformer for leversvigt.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Instrueret differentiering af Primitive og endelige hæmatopoietisk ophav fra humane pluripotente stamceller

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Effektiv Differentiering af pluripotente stamceller til NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; Pankreatisk progenitorer

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In vitro differentiering af humane pluripotente stamceller til trofoblastceller

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Protocol for the Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mixed Cultures of Neurons and Glia for Neurotoxicity Testing

Protokol for differentieringen af ​​humane inducerede pluripotente stamceller i blandede kulturer af neuroner og glia til neurotoksicitetstestning

Human pluripotent stem cells can differentiate into various cell types that can be applied to human-based in vitro toxicity assays. One major advantage is ...

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

In Vitro Differentiering af humane mesenkymale stamceller i funktionel Cardiomyocyte-lignende celler

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Hurtig, instrueret differentiering af retinale Pigment epitel celler fra menneskelige embryonale eller induceret pluripotente stamceller

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Effektiv og skalerbar styret differentiering af klinisk kompatibel hornhinde Limbal epitelial stamceller fra humane pluripotente stamceller

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro Generation af Somite derivater fra menneskelige induceret celler pluripotente stamceller

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation

Forbigående behandling af humane pluripotente stamceller med DMSO for at fremme differentiering

Despite the growing use of pluripotent stem cells (PSCs), challenges in efficiently differentiating embryonic and induced pluripotent stem cells (ESCs and ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

Effektiv neurale differentiering ved hjælp af enkelt cellekultur af humane embryonale stamceller

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...