Name: efficient differentiation of human pluripotent stem cells into liver cells
Uploaded: 2019-06-11T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells at JoVE.com

We danken Bing Lim voor discussies en het Stanford Institute for Stem Cell Biology & regeneratieve geneeskunde voor infrastructuur ondersteuning. Dit werk werd gesteund door het California Institute for Regenerative Medicine (DISC2-10679) en het Stanford-UC Berkeley Siebel stam Cell Institute (to L.T.A. and K.M.L.) en het Stanford Beckman Center voor moleculaire en genetische geneeskunde, evenals de anonieme, Baxter en DiGenova families (naar K.M.L.).

1. voorbereiding van differentiatie media
Opmerking: Raadpleeg de tabel met materialen voor de fabrikant informatie over de gebruikte materialen en reagentia.
<ol><li>
Bereiding van basis chemisch gedefinieerde media (CDM) Opmerking: CDM2, CDM3, CDM4 en CDM5 zijn chemisch gedefinieerde media die worden gebruikt als basismedia koppelen voor het differentiëren van hpscs op levercellen in verschillende stadia. De samenstelling van deze medi...

<ol>
	<li>Bernal, W., Wendon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Liver+Failure.">Acute Liver Failure.</a> New England Journal of Medicine. 369, 2525-2534 (2013).</li><li>Ang, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Roadmap+for+Human+Liver+Differentiation+from+Pluripotent+Stem+Cells.">A Roadmap for Human Liver Differentiation from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Reports. 22, 2190-2205 (2018).</li><li>Fisher, R. A., Strom, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Hepatocyte+Transplantation:+Worldwide+Results.">Human Hepatocyte Transplantation: Worldwide Results.</a> Transplantation. 82, 441-449 (2006).</li><li>Dhawan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+human+hepatocyte+transplantation:+Current+status+and+challenges.">Clinical human hepatocyte transplantation: Current status and challenges.</a> Liver transplantation. 21, S39-S44 (2015).</li><li>Salama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+Hematopoietic+Stem+Cell+Transplantation+in+48+Patients+with+End-Stage+Chronic+Liver+Diseases.">Autologous Hematopoietic Stem Cell Transplantation in 48 Patients with End-Stage Chronic Liver Diseases.</a> Cell Transplantation. 19, 1475-1486 (2017).</li><li>Tan, A. K. Y., Loh, K. M., Ang, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+regenerative+potential+and+functionality+of+human+liver+cells+in+mice.">Evaluating the regenerative potential and functionality of human liver cells in mice.</a> Differentiation. 98, 25-34 (2017).</li><li>Loh, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Endoderm+Induction+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+by+Logically+Directing+Signals+Controlling+Lineage+Bifurcations.">Efficient Endoderm Induction from Human Pluripotent Stem Cells by Logically Directing Signals Controlling Lineage Bifurcations.</a> Cell Stem Cell. 14, 237-252 (2014).</li><li>Loh, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+Pairwise+Choices+Leading+from+Pluripotency+to+Human+Bone,+Heart,+and+Other+Mesoderm+Cell+Types.">Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types.</a> Cell. , 451-467 (2016).</li><li>Zhao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+the+efficient+metabolic+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+hepatocytes+by+correcting+specification+defects.">Promotion of the efficient metabolic maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes by correcting specification defects.</a> Cell Research. 23, 157-161 (2012).</li><li>Si Tayeb, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+generation+of+human+hepatocyte-like+cells+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells.</a> Hepatology. 51, 297-305 (2010).</li><li>Carpentier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+in+miniaturized+format+suitable+for+high-throughput+screen.">Hepatic differentiation of human pluripotent stem cells in miniaturized format suitable for high-throughput screen.</a> Stem Cell Research. 16, 640-650 (2016).</li><li>Avior, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial-derived+lithocholic+acid+and+vitamin+K2+drive+the+metabolic+maturation+of+pluripotent+stem+cells-derived+and+fetal+hepatocytes.">Microbial-derived lithocholic acid and vitamin K2 drive the metabolic maturation of pluripotent stem cells-derived and fetal hepatocytes.</a> Hepatology. 62, 265-278 (2015).</li><li>Ogawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+and+cAMP+signaling+promote+the+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+hepatocytes.">Three-dimensional culture and cAMP signaling promote the maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes.</a> Development. 140, 3285-3296 (2013).</li><li>Rostovskaya, M., Bredenkamp, N., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+consistent+generation+of+pancreatic+lineage+progenitors+from+human+pluripotent+stem+cells.">Towards consistent generation of pancreatic lineage progenitors from human pluripotent stem cells.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 370, 20140365 (2015).</li><li>Haridass, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repopulation+Efficiencies+of+Adult+Hepatocytes,+Fetal+Liver+Progenitor+Cells,+and+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Hepatic+Cells+in+Albumin-Promoter-Enhancer+Urokinase-Type+Plasminogen+Activator+Mice.">Repopulation Efficiencies of Adult Hepatocytes, Fetal Liver Progenitor Cells, and Embryonic Stem Cell-Derived Hepatic Cells in Albumin-Promoter-Enhancer Urokinase-Type Plasminogen Activator Mice.</a> The American Journal of Pathology. 175, 1483-1492 (2009).</li></ol>

Deze methode maakt het genereren van verrijkte populaties van lever Bud-voorlopercellen, en vervolgens hepatocyte-achtige cel, van hPSCs. Het vermogen om verrijkte populaties van menselijke levercellen te genereren is belangrijk voor het praktische gebruik van dergelijke cellen. Eerdere methoden voor het genereren van hepatocyten van hPSCs leverde onzuivere celpopulaties die zowel lever-als niet-levercellen bevatten die, bij transplantatie in knaagdieren, bot en kraakbeen opleverden naast leverweefsel15...

Het doel van dit protocol is om de menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) efficiënt te differentiëren in verrijkte populaties van lever Bud-voorlopercellen en hepatocyten-achtige cel2. Toegang tot een klaar aanbod van menselijke lever voorlopercellen en hepatocyte-achtige cel zal versnellen inspanningen om te onderzoeken van de leverfunctie en ziekte en kan nieuwe cellulaire transplantatie therapieën voor leverfalen3,4, 5. Dit is in het verleden een uitdaging gebleken sinds hPSCs (waaronder embryonale en geïnduceerde pluripotente stamcellen) in alle celtypen van het menselijk lichaam kunnen worden onderscheiden; Bijgevolg was het moeilijk om ze uitsluitend te differentiëren tot een zuivere populatie van een enkel celtype, zoals levercellen6.
Om hPSCs nauwkeurig te differentiëren in levercellen, is het eerst essentieel om niet alleen te begrijpen hoe levercellen worden gespecificeerd, maar ook hoe niet-lever celtypen zich ontwikkelen. Kennis van hoe niet-levercellen zich ontwikkelen is belangrijk om de vorming van niet-lever lijnen tijdens differentiatie logischerwijs te onderdrukken, waardoor hPSCs uitsluitend naar een leverlot2wordt geleidbaar. Ten tweede is het essentieel om de meervoudige ontwikkelingsstappen te afbakenen waarmee hPSCs zich onderscheiden in de richting van een lever lot. Het is bekend dat hpscs opeenvolgend differentiëren in meerdere celtypen die bekend staan als de primitieve streak (APS), definitieve endoderm (de), posterieure foregut (PFG) en lever Bud voorlopercellen (lb) voor het vormen van hepatocyte-achtige cel(HEP). Eerder werk bleek de signalen die lever lot en de signalen die de vorming van alternatieve niet-levercel-typen onderdrukt (met inbegrip van de maag, pancreas, en intestinale voorlopercellen) bij elke ontwikkeling Lineage keuze2, 7 , 8.
Collectief, deze inzichten hebben geleid tot een serum-vrije, monolaag methode om te onderscheiden hpscs naar primitieve streak, definitieve endoderm, posterieure foregut, lever Bud voor ouders en ten slotte, hepatocyte-achtige cellen2. Over het algemeen omvat de methode het zaaien van hpscs in een monolaag op een geschikte dichtheid, het voorbereiden van zes cocktails van differentiatie media (met groeifactoren en kleine moleculen die verschillende ontwikkelings signalerings trajecten reguleren), en opeenvolgend toevoegen van deze media om differentiatie te induceren in de loop van 18 dagen. Tijdens het proces is geen passage van cellen nodig. Van noot, omdat deze methode expliciet signalen bevat die de vorming van niet-leverceltypen onderdrukken, genereert deze differentiatie benadering1 efficiënter lever voorlopercellen en hepatocyten achtige cel door vergelijking met bestaande differentiatie methoden2,9,10,11,12. Bovendien kan het in deze tekst beschreven protocol de snellere aanmaak van hepatocyten die uiteindelijk hogere niveaus van hepatische transcriptiefactoren en enzymen uitdrukken dan die geproduceerd door andere protocollen9,10 , 11 , 12.
Het hier beschreven protocol heeft bepaalde voordelen ten opzichte van de huidige differentiatie protocollen. Ten eerste omvat het monolaag-differentiatie van hpscs, wat technisch eenvoudiger is in vergelijking met driedimensionale differentiatie methoden, zoals die welke gebaseerd zijn op embryoïde lichamen13. Ten tweede exploiteert deze methode een recente voorschot waarbij definitieve endoderm cellen (een vroege voorloper van levercellen) efficiënt en snel kunnen worden gegenereerd binnen 2 dagen na de hpsc-differentiatie2,7, waardoor de daaropvolgende productie van hepatocyten met verhoogde zuiverheid. Ten derde produceren de hepatocyte-achtige cellen die met deze methode worden geproduceerd, in vergelijkingen naast elkaar , meer albumine en drukken hogere niveaus van hepatische transcriptiefactoren en enzymen uit in vergelijking met hepatocyten geproduceerd in andere methoden10, 11,12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >&#160;Geltrex</td>
			<td >Thermofisher Scientific</td>
			<td >A1569601</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1:1 DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.2&#160;&#956;m pore membrane filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GTTP02500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mTeSR1</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thiazovivin</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>3845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >&#160;Accutase</td>
			<td>Gibco or Millipore&#160;</td>
			<td>Gibco A11105, Millipore&#160; SCR005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >IMDM, GlutaMAX&#8482; Supplement</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>31980030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ham&#39;s F-12 Nutrient Mix, GlutaMAX&#8482; Supplement</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>31765035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >KOSR, Knockout serum replacement</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly(vinyl alcohol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;&#160;</td>
			<td>P8136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Transferrin&#160;</td>
			<td >Sigma-Aldrich&#160;&#160;</td>
			<td >10652202001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chemically Defined Lipid Concentrate</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td >11905031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >human Activin</td>
			<td >R&#38;D</td>
			<td>338-AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CHIR99201</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>4423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PI103</td>
			<td >Tocris</td>
			<td >2930/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >human FGF2</td>
			<td >R&#38;D</td>
			<td>233-FB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DM3189</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>6053/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >A83-01</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>2939/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Human BMP4</td>
			<td >R&#38;D</td>
			<td>314-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C59</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>5148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TTNPB</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>0761/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Forskolin</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>1099/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Oncostatin M</td>
			<td >R&#38;D</td>
			<td>295-OM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dexamethasone</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>1126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ro4929097</td>
			<td >Selleck Chem</td>
			<td>S1575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AA2P</td>
			<td>Cayman chemicals</td>
			<td>16457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >human recombinant Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;&#160;</td>
			<td>11061-68-0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient differentiation of human pluripotent stem cells into liver cells

De lever ontgift schadelijke stoffen, scheidt vitale eiwitten, en voert belangrijke metabole activiteiten, dus behoud van leven. Dientengevolge, leverfalen-die kan worden veroorzaakt door chronische alcohol inname, hepatitis, acute vergiftiging, of andere beledigingen-is een ernstige aandoening die kan uitmonden in bloeden, geelzucht, Coma, en uiteindelijk de dood. Echter, benaderingen voor de behandeling van leverfalen, evenals studies van de leverfunctie en ziekte, zijn gedeeltelijk gestoneerd door het ontbreken van een overvloedig aanbod van menselijke levercellen. Hiertoe beschrijft dit protocol de efficiënte differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) in hepatocyten achtige cellen, geleid door een ontwikkelings roadmap waarin wordt beschreven hoe lever lotgevallen worden gespecificeerd in zes opeenvolgende differentiatie stappen. Door het manipuleren van ontwikkelings signalerings trajecten ter bevordering van de lever differentiatie en expliciet onderdrukken van de vorming van ongewenste cel Fates, deze methode genereert efficiënt populaties van menselijke lever Bud voor ouders en hepatocyte-achtige cellen door dagen 6 respectievelijk 18 van de PSC-differentiatie. Dit wordt bereikt door de tijdelijk nauwkeurige controle van ontwikkelings signalerings trajecten, uitgeoefend door kleine moleculen en groeifactoren in een serumvrij kweekmedium. Differentiatie in dit systeem vindt plaats in monolagen en levert hepatocyten achtige cellen die karakteristieke hepatocyte enzymen uitdrukken en de mogelijkheid hebben om een muismodel van chronisch leverfalen te graveren. De mogelijkheid om efficiënt te genereren grote aantallen menselijke levercellen in vitro heeft vertakkingen voor de behandeling van leverfalen, voor drug screening, en voor mechanistische studies van leverziekte.

Na 24 h van APS-differentiatie, zullen kolonies over het algemeen een verschillende morfologie aannemen dan ongedifferentieerde kolonies die gelijktijdig met een verlies van de heldere grens zijn, die meestal hPSC-kolonies beschrijven. Morfologisch, primitieve streak cellen hebben over het algemeen een onregelmatige grenzen en zijn meer verspreid en minder compact dan hPSCs-dit is suggestief van een epitheliale-naar-mesenchymale overgang als pluripotente epiblast cellen differentiëren en...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells at JoVE.com

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Dit protocol Details een monolayer, serum-vrije methode voor het efficiënt genereren van hepatocyte-achtige cellen van menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) in 18 dagen. Dit omvat zes stappen als hpscs sequentieel differentiëren in tussenliggende celtypen zoals de primitieve streak, definitieve endoderm, posterieure foregut en lever Bud voor ouders voor het vormen van hepatocyte-achtige cellen.

Efficiënte differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen in levercellen

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Deze methode maakt het mogelijk de generatie van grote aantallen menselijke lever bud voorlopers en hepatocyte-achtige cellen met een hoge zuiverheid. Het vermogen om deze levercellen te genereren kan belangrijk zijn voor regeneratieve geneeskunde en andere gebieden. Door het regelen van de ontwikkelingssignaleringstrajecten om leverdifferentiatie te bevorderen en de vorming van ongewenste celtypen te onderdrukken, maakt deze methode het mogelijk om de menselijke leverknopvererlopers en hepatocyte-achtige cellen met respectievelijk zes en 18 dagen differentiatie efficiënt te genereren.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de hoge zuiverheid van de menselijke levercellen gegenereerd. Om deze procedure, voeg 50 milliliter IMDM aan een conische kolf met een roerstaaf. Verwarm het medium tot 50 graden Celsius en voeg 0,5 gram PVA toe terwijl je continu roert om een PVA-voorraad voor te bereiden met een concentratie van 10 milligram per milliliter.Verwijder hierna de PVA-oplossing uit het verwarmingskussen en laat deze afkoelen tot kamertemperatuur. Zodra de oplossing is gekoeld, filter het door een steriel, 0,2 micrometer filter. Bereid de CDM2 en CDM3 voor door de gefilterde PVA te combineren met andere reagentia zoals beschreven in tabel één van het tekstprotocol.Gebruik een steriel filter van 0,2 micrometer om alle media te filteren. Bereid vervolgens de resterende basismedia, CDM4 en CDM5, zoals beschreven in tabel een van het tekstprotocol. Om het differentiatiemedium voor te bereiden, ontdooit u eerst de bevroren kleine moleculen en/of groeifactoren bij kamertemperatuur.Aliquot uit de vereiste hoeveelheid basismedium en voeg de gespecificeerde kleine moleculen en groeifactoren aan het basismedium bij de aangewezen concentraties toe. De dag voor gebruik ontdooit u de matrix bij vier graden Celsius. De volgende dag, verdun de matrix bij een verhouding van een tot 100 door het toevoegen van 500 microliter matrix in 50 milliliter koude DMEM.Pipette de verdunde matrix in het vereiste aantal putten met behulp van net genoeg volume van de oplossing om het oppervlak van de put te dekken. Breng de matrijsgecoate plaat gedurende ten minste 60 minuten over naar een couveuse bij 37 graden Celsius. Onmiddellijk voor het zaaien, aspirate de resterende matrix oplossing uit de gecoate putten.Dan, aspirate het medium van een grotendeels confluent hPSC cultuurplaat en voeg commercieel gekochte dissociatie agent, ervoor te zorgen dat net genoeg te gebruiken om het oppervlak waarop de cellen groeien te dekken. Broed de hPSC's in het dissociatiemiddel bij 37 graden Celsius gedurende vijf minuten of totdat sommige kolonies beginnen los te maken. Voeg vervolgens DMEM en F-12 toe om het dissociatiemiddel te verdunnen.Gebruik een vijf milliliter serologische pipet om voorzichtig pipette op en neer meerdere keren af te wassen alle cellen van het oppervlak van de put. Verzamel de opnieuw opgespente enkele cellen in een 50 milliliter conische buis en verdun indien nodig met DMEM en F-12. Centrifuge deze buis van verzamelde hPSCs op 350 keer g en bij vier graden Celsius gedurende drie minuten om de cellen pellet.In afwachting van de centrifugatie, aspirate de matrix van de plaat waarin de HPSCs zal worden gezaaid. Voeg een voldoende hoeveelheid mTeSR-media toe aan de ontvangstputten om ze te dekken. Wanneer de centrifugatie is voltooid, zorgvuldig aspirate de supernatant, waardoor de pelleted hPSCs aan de onderkant van de conische buis.Resuspend de celpellet in mTeSR aangevuld met een micromolar van commercieel verkregen Thiazovivin. Met behulp van een P1000 pipet, voorzichtig trituraat twee tot drie keer om gelijkmatig resuspend de cel pellet in een enkele cel suspensie. Onmiddellijk pipette 10 microliters van de cel suspensie in een hemocytometer en tellen het aantal cellen.Pas het volume van de geresuspended hPSCs aan met thiazovivin-aangevulde mTeSR om de gewenste celconcentratie voor beplating te bereiken. Schud vervolgens de plaat meerdere keren in een kruispatroon om ervoor te zorgen dat de cellen gelijkmatig worden verdeeld. Nadat de HPSC's ten minste 24 uur zijn verguld, gebruikt u een fasecontrastmicroscoop om de morfologie van de cellen te controleren met specifieke nadruk op de diameter van vergulde hPSC-kolonies.Bereid vervolgens dag één APS-differentiatiemedium voor, zoals beschreven in tabel twee van het tekstprotocol. Een dag na het zaaien, aspirate de Thiazovivin-aangevuld mTeSR van de vergulde hPSCs en kort wassen met IMDM media. Voeg hierna dag één medium toe aan de hPSC's.Nota van de tijd en plaats de cellen terug in de couveuse op 37 graden Celsius. Ga verder met de volgende differentiatiestappen door het benodigde differentiatiemedium voor te bereiden en toe te voegen aan de cellen op de respectieve dagen van differentiatie rond dezelfde tijd van de dag. In deze studie worden verrijkte populaties van leverknoppen en vervolgens hepatocyte-achtige cellen gegenereerd uit hPSC's.Tegen dag twee van differentiatie, primitieve streep cellen hebben onderscheiden in dag twee definitieve endoderm cellen. De overgrote meerderheid van deze cellen drukt SOX17 en FOXA2 uit. Op dag drie van differentiatie, hebben de endoderm cellen gedifferentieerd in voorlopers die veelhoekige vorm lijken.Later, op dag zes, hebben de voorouders zich onderscheiden tot leverknopverervers. Deze leverknoppen maken AFP, TPX3 en HNF4alpha weer. Over drie hPSC-lijnen genereert deze methode dag zes AFP-positieve leververervers met een efficiëntie van ongeveer 89%Tot slot, na 18 dagen leverdifferentiatie van hPSC's, verschijnen albumine-positieve hepatocyte-achtige cellen.Morfologisch lijken deze cellen epitheliaal en vormen heldere randen die doen denken aan gal canaliculi. In dit stadium lijkt het cytoplasma van dag 18 hPSC-afgeleide hepatocyten donkerder dan de kern. Bij het zaaien van menselijke pluripotente stamcellen voor differentiatie, is het noodzakelijk om ze te zaaien op de juiste dichtheid en ook om ze te verdelen over de put door het schudden van de plaat.De mogelijkheid om menselijke hepatocyten in vitro te produceren is een technologie die wetenschappers in staat stelt om mechanismen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling van de lever te onderzoeken. Deze methode produceert grote aantallen menselijke hepatocyten in vitro die kunnen worden gebruikt om de leverfunctie en ziekte te onderzoeken en om uiteindelijk nieuwe therapieën voor leverfalen mogelijk te maken.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Regie van differentiatie van primitieve en definitieve hematopoietische progenitorcellen van menselijke pluripotente stamcellen

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficiënte Differentiatie van pluripotente stamcellen tot NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; Pancreatic Progenitors

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In vitro differentiatie van humane pluripotente stamcellen in trofoblastcellen

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Protocol for the Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mixed Cultures of Neurons and Glia for Neurotoxicity Testing

Protocol voor de differentiatie van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen in gemengde culturen van neuronen en glia voor het testen van neurotoxiciteit

Human pluripotent stem cells can differentiate into various cell types that can be applied to human-based in vitro toxicity assays. One major advantage is ...

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

In Vitro Differentiatie van menselijke mesenchymale stamcellen in functionele Cardiomyocyte-achtige cellen

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Snelle, gerichte differentiatie van de epitheliale cellen van de retinale Pigment van menselijke embryonale of geïnduceerde pluripotente stamcellen

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Efficiënt en schaalbare gestuurde differentiatie van klinisch hoornvlies Limbal epitheliale cellen van de stam van menselijke pluripotente stamcellen

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In Vitro generatie van Somiet derivaten uit menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen-cellen

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation

Voorbijgaande behandeling van menselijke pluripotente stamcellen met DMSO om differentiatie te bevorderen

Despite the growing use of pluripotent stem cells (PSCs), challenges in efficiently differentiating embryonic and induced pluripotent stem cells (ESCs and ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

Efficiënte Neurale differentiatie met behulp van eencellige cultuur van menselijke embryonale stamcellen

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...