Name: efficient differentiation of human pluripotent stem cells into liver cells
Uploaded: 2019-06-11T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells at JoVE.com

אנו מודים בינג Lim לדיונים ומכון סטנפורד עבור ביולוגיה של תאי גזע & רפואה רגנרטיבית לתמיכה בתשתיות. עבודה זו נתמכת על ידי המכון הקליפורני לרפואה רגנרטיבית (DISC2-10679) ואת סטנפורד-UC ברקלי מכון תאי גזע של המכון (ל L.T.A. ו K.M.L.) ואת סטנפורד בקמן המרכז לרפואה מולקולרית וגנטית, כמו גם אנונימי, משפחות בקסטר ודיג'נובה (ל-K.M.L.).

1. הכנת בידול מדיה
הערה: עיין בטבלה של חומרים לקבלת מידע אודות היצרן בנוגע לחומרים וריאגנטים בשימוש.
<ol><li>
הכנת מדיה בסיסית המוגדרת כימית (CDM) הערה: CDM2, CDM3, CDM4 ו-CDM5 הם מדיה המוגדרים כימית המשמשים כאמצעי הבסיס להבדיל בין hPSCs תאי הכבד בשלבים שונים. הרכ...

<ol>
	<li>Bernal, W., Wendon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Liver+Failure.">Acute Liver Failure.</a> New England Journal of Medicine. 369, 2525-2534 (2013).</li><li>Ang, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Roadmap+for+Human+Liver+Differentiation+from+Pluripotent+Stem+Cells.">A Roadmap for Human Liver Differentiation from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Reports. 22, 2190-2205 (2018).</li><li>Fisher, R. A., Strom, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Hepatocyte+Transplantation:+Worldwide+Results.">Human Hepatocyte Transplantation: Worldwide Results.</a> Transplantation. 82, 441-449 (2006).</li><li>Dhawan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+human+hepatocyte+transplantation:+Current+status+and+challenges.">Clinical human hepatocyte transplantation: Current status and challenges.</a> Liver transplantation. 21, S39-S44 (2015).</li><li>Salama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+Hematopoietic+Stem+Cell+Transplantation+in+48+Patients+with+End-Stage+Chronic+Liver+Diseases.">Autologous Hematopoietic Stem Cell Transplantation in 48 Patients with End-Stage Chronic Liver Diseases.</a> Cell Transplantation. 19, 1475-1486 (2017).</li><li>Tan, A. K. Y., Loh, K. M., Ang, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+regenerative+potential+and+functionality+of+human+liver+cells+in+mice.">Evaluating the regenerative potential and functionality of human liver cells in mice.</a> Differentiation. 98, 25-34 (2017).</li><li>Loh, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Endoderm+Induction+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+by+Logically+Directing+Signals+Controlling+Lineage+Bifurcations.">Efficient Endoderm Induction from Human Pluripotent Stem Cells by Logically Directing Signals Controlling Lineage Bifurcations.</a> Cell Stem Cell. 14, 237-252 (2014).</li><li>Loh, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+Pairwise+Choices+Leading+from+Pluripotency+to+Human+Bone,+Heart,+and+Other+Mesoderm+Cell+Types.">Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types.</a> Cell. , 451-467 (2016).</li><li>Zhao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+the+efficient+metabolic+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+hepatocytes+by+correcting+specification+defects.">Promotion of the efficient metabolic maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes by correcting specification defects.</a> Cell Research. 23, 157-161 (2012).</li><li>Si Tayeb, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+generation+of+human+hepatocyte-like+cells+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells.</a> Hepatology. 51, 297-305 (2010).</li><li>Carpentier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+in+miniaturized+format+suitable+for+high-throughput+screen.">Hepatic differentiation of human pluripotent stem cells in miniaturized format suitable for high-throughput screen.</a> Stem Cell Research. 16, 640-650 (2016).</li><li>Avior, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial-derived+lithocholic+acid+and+vitamin+K2+drive+the+metabolic+maturation+of+pluripotent+stem+cells-derived+and+fetal+hepatocytes.">Microbial-derived lithocholic acid and vitamin K2 drive the metabolic maturation of pluripotent stem cells-derived and fetal hepatocytes.</a> Hepatology. 62, 265-278 (2015).</li><li>Ogawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+and+cAMP+signaling+promote+the+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+hepatocytes.">Three-dimensional culture and cAMP signaling promote the maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes.</a> Development. 140, 3285-3296 (2013).</li><li>Rostovskaya, M., Bredenkamp, N., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+consistent+generation+of+pancreatic+lineage+progenitors+from+human+pluripotent+stem+cells.">Towards consistent generation of pancreatic lineage progenitors from human pluripotent stem cells.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 370, 20140365 (2015).</li><li>Haridass, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repopulation+Efficiencies+of+Adult+Hepatocytes,+Fetal+Liver+Progenitor+Cells,+and+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Hepatic+Cells+in+Albumin-Promoter-Enhancer+Urokinase-Type+Plasminogen+Activator+Mice.">Repopulation Efficiencies of Adult Hepatocytes, Fetal Liver Progenitor Cells, and Embryonic Stem Cell-Derived Hepatic Cells in Albumin-Promoter-Enhancer Urokinase-Type Plasminogen Activator Mice.</a> The American Journal of Pathology. 175, 1483-1492 (2009).</li></ol>

שיטה זו מאפשרת את הדור של אוכלוסיות מועשר של ושלתי הכבד ניצן, ולאחר מכן התאים של hepatocyte, מ hPSCs. היכולת ליצור אוכלוסיות מועשר של תאי כבד אנושיים חשובה לניצול מעשי של תאים כאלה. השיטות הקודמות להפקת hepatocytes מ hPSCs הניבו אוכלוסיות תאים טמא המכיל הן הכבד והן תאים שאינם בכבד, על השתלת לתוך מכרסמים, הנ?...

המטרה של פרוטוקול זה היא להבדיל ביעילות בתאי גזע בעלי עוצמה אנושית (hPSCs) לתוך אוכלוסיות מועשר של הכבד ניצן ושלתי ו hepatocyte תאים2. גישה לאספקת מוכן של הכבד האנושי ושלתי ו hepatocyte תאים להאיץ את המאמצים לחקור את תפקוד הכבד ואת המחלות יכול לאפשר טיפולים חדשים השתלת תאים לכשל בכבד3,4, 5. המשך זה הוכיח מאתגרת בעבר מאז hPSCs (אשר כוללים מעובריים והמושרה תאים גזע pluripotent יכול להבדיל לכל תא-סוגי הגוף האנושי; כתוצאה מכך, היה קשה להבדיל באופן בלעדי לאוכלוסיה טהורה של סוג תא אחד, כגון תאי כבד6.
כדי להבדיל בדיוק hPSCs לתוך תאי הכבד, הראשון הוא קריטי להבין לא רק איך תאי הכבד מצוינים אלא גם איך התאים שאינם בתוך הכבד להתפתח. הידע של איך לפתח את התאים שאינם בכבד חשוב לדכא באופן הגיוני את היווצרות של שאינם בכבד במהלך הבידול, ובכך בלעדית המנחה hPSCs לעבר גורל הכבד2. שנית, חיוני להתוות את הצעדים ההתפתחותיים שדרכם hPSCs להבדיל לקראת גורל כבד. ידוע כי hPSCs ברציפות להבדיל לתוך תא מרובים סוגים הידועים כרצף פרימיטיבי (APS), אנדופפיל מוחלט (DE), האחורי הקדמי (PFG) ואת הכבד ניצן ושלתי (LB) לפני יצירת התאים האלה כמו החציט (הפטיטיס). בתחילת העבודה חשף את האותות המציינים את גורל הכבד ואת האותות שדיכא את היווצרות של התאים החלופיים שאינם בכבד (כולל הקיבה, הלבלב, ואת המעיים ושלתי) בכל בחירה התפתחותית השושלת2, מיכל סבן , שמונה.
באופן קולקטיבי, תובנות אלה העניק עלייה ללא סרום, שיטה מונאולייר להבדיל hPSCs לכיוון הרצף הפרימיטיבי, אנדופעור מוחלט, האחורי הקדמי, הכבד ניצן ושלתי ולבסוף, hepatocyte כמו תאים2. באופן כללי השיטה כרוכה בזריעת hPSCs במונאולייר בצפיפות מתאימה, הכנת שישה קוקטיילים של בידול מדיה (המכיל גורמי גדילה ומולקולות קטנות המתוסתים שיטות איתות התפתחותיות שונות), ו ברציפות הוספת מדיה אלה כדי לגרום לבידול במהלך 18 ימים. במהלך התהליך, אין צורך בשלב ההתיישנות של תאים. של הערה, כי שיטה זו כוללת במפורש אותות לדכא את היווצרות סוגי תאים שאינם של הכבד, גישה זו בידול1 ביתר יעילות יוצר ושלתי כבד ותאים hepatocyte בהשוואה למצב הנמצא בידול שיטות2,9,10,11,12. יתר על כן, הפרוטוקול המתואר בטקסט זה מאפשר את הדור מהר יותר של hepatocytes כי בסופו של דבר לבטא רמות גבוהות יותר של מקדמי שעתוק הכבד ואנזימים מאלה המיוצרים על ידי פרוטוקולים אחרים9,10 , מיכל בן 11 , . שתיים עשרה
לפרוטוקול המתואר כאן יש יתרונות מסוימים בנוגע לפרוטוקולי הבידול הנוכחיים. ראשית, היא כרוכה בבידול מונאולייר של hPSCs, שהוא מבחינה טכנית פשוטה יותר לעומת שיטות בידול תלת ממדיות, כגון אלה המסתמכים על גופים embryoid13. שנית, שיטה זו מנצלת מראש לאחרונה לפיה התאים הניתנים לעור מוחלט (מקודמן מוקדם לתאי הכבד) יכול להיות ביעילות ובמהירות שנוצר בתוך 2 ימים של hpsc בידול2,7, ובכך מאפשר את הבאים ייצור הפטוציטים בטוהר מוגבר. שלישית, בהשוואות זה לצד זה, התאים האחרים המיוצרים על-ידי שיטה זו2 יוצרים אלבומין נוסף ומבטאים רמות גבוהות יותר של גורמי שעתוק בכבד ואנזימים לעומת hepatocyte המיוצרים בשיטות אחרות10, 11,12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >&#160;Geltrex</td>
			<td >Thermofisher Scientific</td>
			<td >A1569601</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1:1 DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.2&#160;&#956;m pore membrane filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GTTP02500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mTeSR1</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thiazovivin</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>3845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >&#160;Accutase</td>
			<td>Gibco or Millipore&#160;</td>
			<td>Gibco A11105, Millipore&#160; SCR005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >IMDM, GlutaMAX&#8482; Supplement</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>31980030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ham&#39;s F-12 Nutrient Mix, GlutaMAX&#8482; Supplement</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>31765035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >KOSR, Knockout serum replacement</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly(vinyl alcohol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;&#160;</td>
			<td>P8136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Transferrin&#160;</td>
			<td >Sigma-Aldrich&#160;&#160;</td>
			<td >10652202001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chemically Defined Lipid Concentrate</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td >11905031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >human Activin</td>
			<td >R&#38;D</td>
			<td>338-AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CHIR99201</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>4423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PI103</td>
			<td >Tocris</td>
			<td >2930/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >human FGF2</td>
			<td >R&#38;D</td>
			<td>233-FB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DM3189</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>6053/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >A83-01</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>2939/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Human BMP4</td>
			<td >R&#38;D</td>
			<td>314-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C59</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>5148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TTNPB</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>0761/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Forskolin</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>1099/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Oncostatin M</td>
			<td >R&#38;D</td>
			<td>295-OM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dexamethasone</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>1126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ro4929097</td>
			<td >Selleck Chem</td>
			<td>S1575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AA2P</td>
			<td>Cayman chemicals</td>
			<td>16457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >human recombinant Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;&#160;</td>
			<td>11061-68-0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient differentiation of human pluripotent stem cells into liver cells

הכבד מטהר חומרים מזיקים, מפריש חלבונים חיוניים, ומבצע פעילויות מטבולית מפתח, ובכך לקיים חיים. כתוצאה מכך, אי ספיקת כבד-אשר יכול להיגרם על ידי צריכת אלכוהול כרונית, צהבת, הרעלה חריפה, או עלבונות אחרים-הוא מצב חמור שיכול להגיע לדימום, צהבת, תרדמת, ובסופו של דבר מוות. עם זאת, גישות לטיפול בכישלון בכבד, כמו גם מחקרים של תפקוד הכבד ומחלות, היו מעטים בחלקם על ידי חוסר אספקה בשפע של תאי הכבד האנושיים. למטרה זו, פרוטוקול זה מפרט את הבידול היעיל של תאי גזע בעלי עוצמה אנושית (hPSCs) לתוך תאים של hepatocyte, מונחה על ידי מפת דרכים התפתחותית המתארת כיצד מצוין גורל הכבד על פני שישה צעדי בידול רצופים. על ידי מניפולציה מסלולים התפתחותיים איתות כדי לקדם בידול הכבד, כדי לדכא במפורש את היווצרות של גורלות תא בלתי רצויים, שיטה זו מפיקה ביעילות אוכלוסיות של ושלתי הכבד האנושי ניצן ו hepatocyte-תאים כמו יום 6 ו -18 של PSC בידול, בהתאמה. הדבר מושג באמצעות שליטה מדויקת באופן זמני של משעולים אותות התפתחותיים, המופעל על ידי מולקולות קטנות וגורמי גדילה במדיום תרבות ללא סרום. הבידול במערכת זו מתרחשת במונאולאיירס ומניב תאים הירופציט המבטאים אנזימים מאפיינים מאופיינים ובעלי יכולת לעבור מודל עכבר של אי ספיקת כבד כרונית. היכולת לייצר ביעילות מספר גדול של תאי כבד אנושיים בתוך מבחנה יש השלכות לטיפול בכשל בכבד, לסינון תרופות, ולמחקרים מכניסטיים של מחלות כבד.

לאחר 24 שעות של בידול APS, המושבות בדרך כלל לאמץ מורפולוגיה שונה מאשר מושבות מובחן במקביל עם אובדן של גבול בהיר כי בדרך כלל להקיף המושבות hPSC. מורפולוגית, בתאי פס פרימיטיבי בדרך כלל יש גבולות משונן והם התפשטה יותר ופחות קומפקטי מ hPSCs-זה מעורר המעבר אפיתל-to-mesenchal כמו בתאי הפיצוץ...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells at JoVE.com

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

פרוטוקול זה מפרט מונאולייר, שיטה נטולת סרום להפקת ביעילות תאים של hepatocyte מתאי גזע בעלי עוצמה מרבית (hPSCs) בתוך 18 ימים. זה כרוך שישה שלבים כמו hPSCs ברציפות להבדיל לתוך תא ביניים-סוגים כגון הרצף הפרימיטיבי, אנדופעיים מוחלט, האחורי הקדמי ואת ניצן הכבד ושלתי לפני היווצרות תאים hepatocyte כמו.

יעיל הבידול של תאים האדם Pluriפוטנטי לתוך תאי הכבד

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

שיטה זו מאפשרת ליצור מספר גדול של בני ניצני כבד אנושיים ותאים דמויי hepatocyte עם טוהר גבוה. היכולת ליצור את תאי הכבד האלה יכולה להיות חשובה לרפואה רגנרטיבית ולתחומים אחרים. על ידי שליטה במסלולי האיתות ההתפתחותיים לקידום בידול הכבד ודיכוי היווצרותם של סוגי תאים לא רצויים, שיטה זו מאפשרת ייצור יעיל של בני ניצני כבד אנושיים ותאים דמויי hepatocyte על ידי שישה ו -18 ימים של בידול בהתאמה.היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הטוהר הגבוה של תאי הכבד האנושיים הנוצרים. כדי להיות הליך זה, להוסיף 50 מיליליטר של IMDM לבקבוק חרוט המכיל בר ערבוב. מחממים את המדיום עד 50 מעלות צלזיוס ומוסיפים 0.5 גרם של PVA תוך ערבוב רציף להכנת מלאי PVA בריכוז של 10 מיליגרם למיליליטר.לאחר מכן, להסיר את פתרון PVA משטח החימום ולאפשר לו להתקרר לטמפרטורת החדר. לאחר שהפתרון מקורר, מסננים אותו באמצעות מסנן מיקרומטר סטרילי של 0.2. הכן את ה- CDM2 וה- CDM3 על-ידי שילוב ה- PVA המסונן עם רייגנטים אחרים כמפורט בטבלה אחד מפרוטוקול הטקסט.השתמש במסנן מיקרומטר סטרילי של 0.2 כדי לסנן את כל המדיה. לאחר מכן, הכן את אמצעי ה- Media הבסיסי הנותר, CDM4 ו- CDM5, כמתואר בטבלה אחד מפרוטוקול הטקסט. כדי להכין את מדיום ההידול, הפשר תחילה את המולקולות הקטנות הקפואות ו/או גורמי הגדילה בטמפרטורת החדר.יש להוציא את הכמות הנדרשת של מדיום הבסיס ולהוסיף את המולקולות הקטנות וגורמי הגדילה שצוינו למדיום הבסיס בריכוזים המתאימים. יום לפני השימוש, להפשיר את המטריצה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, לדלל את המטריצה ביחס של 1 עד 100 על ידי הוספת 500 microliters של מטריצה לתוך 50 מיליליטר של DMEM קר.פיפטה מטריצה מדוללת לתוך המספר הנדרש של בארות באמצעות נפח מספיק של פתרון כדי לכסות את פני השטח של באר. מעבירים את הצלחת מצופה המטריצה לאנקובטור ב-37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות לפחות. מיד לפני הזריעה, שאפו את פתרון המטריצה הנותר מה בארות מצופות.לאחר מכן, שאפו את המדיום מצלחת תרבות hPSC קונפלנטית ברובה והוסיפו סוכן דיסוציאציה שנרכש מסחרית, ודאגו להשתמש בדיוק מספיק כדי לכסות את פני השטח שבהם התאים גדלים. הדגירה hPSCs בסוכן דיסוציאציה ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות או עד כמה מושבות להתחיל להתנתק. לאחר מכן, הוסף DMEM ו- F-12 כדי לדלל את סוכן הדיסוציאציה.השתמש פיפטה סרולוגית חמישה מיליליטר בעדינות pipette למעלה ולמטה מספר פעמים כדי לשטוף את כל התאים מפני השטח של באר. לאסוף את התאים הבודדים המתווסכלים בצינור חרוט 50 מיליליטר לדלל עם DMEM ו- F-12 לפי הצורך. צנטריפוגה צינור זה של hPSCs שנאספו ב 350 פעמים g וב ארבע מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות כדי גלולה את התאים.בזמן ההמתנה לצנטריפוגה, שאפו את המטריצה מהצלחת שבה יזרעו את ה- hPSCs. הוסף כמות מספקת של מדיית mTeSR ל בארות נמען כדי לכסות אותן. כאשר הצנטריפוגה הושלמה, בזהירות שאפו את העל-טבעי, והשאירו את ה- hPSCs המוגלתיים בתחתית הצינור הקונטי.תן מחדש את גלולת התא ב- mTeSR בתוספת מיקרומולר אחד של Thiazovivin המתקבל מסחרית. באמצעות פיפטה P1000, בעדינות triturate פעמיים עד שלוש פעמים כדי להשתמש מחדש באופן שווה את גלולת התא לתוך השעיה תא יחיד. מיד פיפטה 10 microliters של ההשעיה התא לתוך hemocytometer ולספר את מספר התאים.כוונן את עוצמת הקול של hPSCs לשימוש חוזר עם mTeSR בתוספת Thiazovivin כדי להשיג את ריכוז התא הרצוי עבור ציפוי. לאחר מכן, לנער את הצלחת בתבנית צלב מספר פעמים כדי לוודא כי התאים מופצים באופן שווה. לאחר hPSCs כבר מצופה לפחות 24 שעות, להשתמש במיקרוסקופ ניגוד פאזה כדי לבדוק את המורפולוגיה של התאים עם דגש ספציפי על הקוטר של מושבות hPSC מצופה.לאחר מכן, הכן את אמצעי ההתברות של APS ביום הראשון כמפורט בטבלה 2 של פרוטוקול הטקסט. יום אחד לאחר הזריעה, שאפו את ה-mTeSR בתוספת תיאזוביבין מה-hPSCs המצופים ושטפו אותם בקצרה עם מדיית IMDM. לאחר מכן, הוסף מדיום יום אחד ל- hPSCs.תקליטו את הזמן ותמקם את התאים בחזרה באינקובטור ב-37 מעלות צלזיוס. המשך עם שלבי ההידול הבאים על ידי הכנת מדיום ההתברמות הדרוש והוספתו לתאים בימים המתאימים של ההתברנות בערך באותה שעה ביום. במחקר זה, אוכלוסיות מועשרות של בני ניצני כבד ותאים דמויי hepatocyte לאחר מכן נוצרים hPSCs.ביום השני של ההבחנה, תאי פס פרימיטיביים הבדילו ליום שני תאי אנדודרמה מוחלטים. הרוב המכריע של תאים אלה מבטאים SOX17 ו FOXA2. ביום השלישי של ההבחנה, תאי האנדודרמה הבדילו לאוהי המצומדים המופיעים בצורת מצולע.מאוחר יותר, ביום השישי, בני ה-foregut הבדילו לאבי ניצני הכבד. אלה ניצן הכבד progenitors להביע AFP, TPX3, ו HNF4alpha. על פני שלושה קווי hPSC, שיטה זו מייצרת יום שישה AFP חיובית בכבד progenitors ביעילות של כ 89%לבסוף, לאחר 18 ימים של התברות בכבד מ hPSCs, תאים דמויי hepatocyte חיובי אלבומין מופיעים.מבחינה מורפולוגית, תאים אלה מופיעים אפיתל, ויוצרים גבולות בהירים המזכירים canaliculi מרה. בשלב זה, הציטופלסמה של היום 18 hepatocytes נגזר hPSC נראה כהה יותר מאשר הגרעין. כאשר זורעים תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים להתבולל, חובה לזרוע אותם בצפיפות הנכונה וגם להפיץ אותם על פני באר על ידי טלטול הצלחת.היכולת לייצר hepatocytes אנושי במבחנה היא טכנולוגיה המאפשרת שיאפשר למדענים לחקור מנגנונים שבבסיס התפתחות הכבד. שיטה זו מייצרת מספר רב של hepatocytes אנושי במבחנה אשר יכול לשמש כדי לחקור את תפקוד הכבד ומחלות ובסופו של דבר לאפשר טיפולים חדשים לאי ספיקת כבד.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

ביים הבידול של אבות Hematopoietic פרימיטיבי, מהווים הסופית מתאי גזע Pluripotent אנושי

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

בידול יעיל של pluripotent בתאי גזע כדי NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; אבות הלבלב

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

במבחנה בידול של האדם pluripotent בתאי גזע לתאי Trophoblastic

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Protocol for the Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mixed Cultures of Neurons and Glia for Neurotoxicity Testing

Protocol עבור הבחנה של תאים גזעיים Pluripotent Indoced האדם לתוך תרבויות מעורבות של נוירונים וגליה עבור בדיקה נוירוטוקסיות

Human pluripotent stem cells can differentiate into various cell types that can be applied to human-based in vitro toxicity assays. One major advantage is ...

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

במבחנה הבידול של גזע Mesenchymal אנושי לתוך תאים דמויי Cardiomyocyte תפקודית

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

הבידול מהירה, מכוונת של תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית מתאי גזע Pluripotent האנושי עובריים או מושרה

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

יעיל ומדרגי הבידול בבימויו של קלינית הקרנית Limbal אפיתל תאי גזע מתאימים מתאי גזע Pluripotent אנושי

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

בדור חוץ גופית של Somite נגזרים מן האדם המושרה בתאי גזע Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation

הטיפול הארעי של תאי גזע בעלי עוצמה אנושית עם DMSO כדי לקדם בידול

Despite the growing use of pluripotent stem cells (PSCs), challenges in efficiently differentiating embryonic and induced pluripotent stem cells (ESCs and ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

בידול עצבי יעיל באמצעות התרבות תא יחיד של תאי גזע האדם העובריים

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...