Name: efficient differentiation of human pluripotent stem cells into liver cells
Uploaded: 2019-06-11T13:30:00
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Ringraziamo Bing Lim per le discussioni e lo Stanford Institute for Stem Cell Biology & Regenerative Medicine per il supporto infrastrutturale. Questo lavoro è stato sostenuto dal California Institute for Regenerative Medicine (DISC2-10679) e dallo Stanford-UC Berkeley Siebel Stem Cell Institute (a L.T.A. e K.M.L.) e dallo Stanford Beckman Center for Molecular and Genetic Medicine, nonché dall'Anonymous, baxter e DiGenova (a K.M.L.).

1. Preparazione dei mezzi di differenziazione
 NOT:</</c0> Fare riferimento alla Tabella dei materiali per informazioni sul produttore relative ai materiali e ai reagenti utilizzati.
<ol><li>
Preparazione di supporti definiti chimicamente di base (CDM) NOTA: CDM2, CDM3, CDM4 e CDM5 sono supporti definiti chimicamente che vengono utilizzati come supporti di base per differenziare gli hPSC alle cellule epatiche in varie fasi. La composizion...

<ol>
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Questo metodo consente la generazione di popolazioni arricchite di progenitori di germogli di fegato, e successivamente cellule simili a epatociti, da hPSCs. La capacità di generare popolazioni arricchite di cellule epatiche umane è importante per l'utilizzo pratico di tali cellule. I metodi precedenti per generare epatociti da hPSC hanno prodotto popolazioni di cellule impure contenenti cellule epatiche e non epatiche che, dopo il trapianto in roditori, hanno prodotto ossa e cartilagine oltre al tessuto epatico<sup cl...

Lo scopo di questo protocollo è quello di differenziare in modo efficiente le cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) in popolazioni arricchite di progenitori di gemme del fegato e cellule simili a epatociti2. L'accesso a una fornitura pronta di progenitori epatici umani e cellule simili a epatociti accelererà gli sforzi per indagare sulla funzione epatica e sulla malattia e potrebbe consentire nuove terapie di trapianto di cellule per l'insufficienza epatica3,4, 5. Ciò si è dimostrato impegnativo in passato poiché gli hPSC (che includono cellule staminali pluripotenti embrionali e indotte) possono differenziarsi in tutti i tipi di cellule del corpo umano; di conseguenza, è stato difficile differenziarli esclusivamente in una popolazione pura di un tipo a singola cellula, come le cellule epatiche6.
Per differenziare con precisione gli hPSC in cellule epatiche, in primo luogo è fondamentale capire non solo come vengono specificate le cellule epatiche, ma anche come si sviluppano i tipi di cellule non epatiche. La conoscenza di come si sviluppano le cellule non epatiche è importante per sopprimere logicamente la formazione di lignaggi non epatici durante la differenziazione, guidando così esclusivamente hPSC verso un destino epatico2. In secondo luogo, è essenziale delineare i molteplici passaggi di sviluppo attraverso i quali gli hPSCs si differenziano verso un destino epatico. È noto che gli hPSC si differenziano in sequenza in più tipi di cellule note come striscia primitiva (APS), endodermi definitivo (DE), foregut posteriore (PFG) e progenitori di gemme epatiche (LB) prima di formare cellule simili a epatociti (HEP). I lavori precedenti hanno rivelato i segnali che specificano il destino del fegato e i segnali che sopprimevano la formazione di tipi alternativi di cellule non epatiche (compresi i progenitori di stomaco, pancreatici e intestinali) ad ogni scelta di lignaggio dello sviluppo2, 7 (in questo stato , 8.
Collettivamente, queste intuizioni hanno dato origine a un metodo monostrato privo di siero per differenziare gli hPSC verso la striscia primitiva, l'endoderma definitivo, il foregut posteriore, i progenitori delle gemme del fegato e, infine, le cellule simili a epatociti2. Nel complesso il metodo prevede la seeding di hPSC in un monostrato ad una densità appropriata, preparando sei cocktail di supporti di differenziazione (contenenti fattori di crescita e piccole molecole che regolano varie vie di segnalazione dello sviluppo), e l'aggiunta sequenziale di questi mezzi di comunicazione per indurre la differenziazione nel corso di 18 giorni. Durante il processo, non è necessario passare le cellule. Da notare, poiché questo metodo include esplicitamente segnali che sopprimono la formazione di tipi di cellule non epatiche, questo approccio di differenziazione1 genera in modo più efficiente progenitori epatici e cellule simili a epatociti rispetto a quelli esistenti metodi di differenziazione2,9,10,11,12. Inoltre, il protocollo descritto in questo testo consente la generazione più rapida di epatociti che in ultima analisi esprimono livelli più elevati di fattori ed enzimi di trascrizione epatica rispetto a quelli prodotti da altri protocolli9,10 , 11 Del sistema di , 12.
Il protocollo qui descritto presenta alcuni vantaggi rispetto agli attuali protocolli di differenziazione. In primo luogo, comporta la differenziazione del monostrato degli hPSC, che è tecnicamente più semplice rispetto ai metodi di differenziazione tridimensionali, come quelli che si basano su corpi embrionali13. In secondo luogo, questo metodo sfrutta un recente progresso in base al quale le cellule endodermiche definitive (un precursore precoce delle cellule epatiche) possono essere generate in modo efficiente e rapido entro 2 giorni dalla differenziazione hPSC2,7, consentendo così la successiva produzione di epatociti con maggiore purezza. In terzo luogo, nei confronti affiancati, le cellule simili agli epatociti prodotte da questo metodo2 producono più ALBUMIN ed esprimono livelli più elevati di fattori di trascrizione epatica ed enzimi rispetto agli epatociti prodotti in altri metodi10, 11,12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >&#160;Geltrex</td>
			<td >Thermofisher Scientific</td>
			<td >A1569601</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1:1 DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.2&#160;&#956;m pore membrane filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GTTP02500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mTeSR1</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thiazovivin</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>3845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >&#160;Accutase</td>
			<td>Gibco or Millipore&#160;</td>
			<td>Gibco A11105, Millipore&#160; SCR005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >IMDM, GlutaMAX&#8482; Supplement</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>31980030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ham&#39;s F-12 Nutrient Mix, GlutaMAX&#8482; Supplement</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>31765035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >KOSR, Knockout serum replacement</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly(vinyl alcohol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;&#160;</td>
			<td>P8136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Transferrin&#160;</td>
			<td >Sigma-Aldrich&#160;&#160;</td>
			<td >10652202001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chemically Defined Lipid Concentrate</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td >11905031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >human Activin</td>
			<td >R&#38;D</td>
			<td>338-AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CHIR99201</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>4423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PI103</td>
			<td >Tocris</td>
			<td >2930/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >human FGF2</td>
			<td >R&#38;D</td>
			<td>233-FB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DM3189</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>6053/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >A83-01</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>2939/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Human BMP4</td>
			<td >R&#38;D</td>
			<td>314-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C59</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>5148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TTNPB</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>0761/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Forskolin</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>1099/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Oncostatin M</td>
			<td >R&#38;D</td>
			<td>295-OM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dexamethasone</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>1126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ro4929097</td>
			<td >Selleck Chem</td>
			<td>S1575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AA2P</td>
			<td>Cayman chemicals</td>
			<td>16457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >human recombinant Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;&#160;</td>
			<td>11061-68-0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient differentiation of human pluripotent stem cells into liver cells

Il fegato disintossica le sostanze nocive, secerne proteine vitali ed esegue attività metaboliche chiave, sostenendo così la vita. Di conseguenza, l'insufficienza epatica, che può essere causata dall'assunzione cronica di alcol, dall'epatite, dall'avvelenamento acuto o da altri insulti, è una condizione grave che può culminare nel sanguinamento, nell'itterizia, nel coma e infine nella morte. Tuttavia, approcci per trattare l'insufficienza epatica, così come gli studi di funzione epatica e malattia, sono stati ostacolati in parte dalla mancanza di un abbondante apporto di cellule epatiche umane. A tal fine, questo protocollo descrive in dettaglio l'efficiente differenziazione delle cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) in cellule simili agli eatociti, guidate da una roadmap di sviluppo che descrive come il destino del fegato è specificato attraverso sei fasi di differenziazione consecutive. Manipolando i percorsi di segnalazione dello sviluppo per promuovere la differenziazione del fegato e per sopprimere esplicitamente la formazione di destini cellulari indesiderati, questo metodo genera in modo efficiente popolazioni di progenitori di germogli di fegato umani e cellule simili a epatociti entro i giorni 6 e 18 della differenziazione PSC, rispettivamente. Ciò si ottiene attraverso il controllo temporale preciso dei percorsi di segnalazione dello sviluppo, esercitati da piccole molecole e fattori di crescita in un mezzo di coltura senza siero. La differenziazione in questo sistema si verifica nei monostrati e produce cellule simili a epatociti che esprimono enzimi epaticiti caratteristici e hanno la capacità di innestare un modello murino di insufficienza epatica cronica. La capacità di generare in modo efficiente un gran numero di cellule epatiche umane in vitro ha ramificazioni per il trattamento dell'insufficienza epatica, per lo screening farmacologico e per gli studi meccanicistici delle malattie epatiche.

Dopo 24 h di differenziazione APS, le colonie adotteranno generalmente una morfologia diversa da quella delle colonie indifferenziate concomitanti con una perdita del confine luminoso che tipicamente circoscrive le colonie hPSC. Morphologically, le cellule di streak primitive hanno generalmente bordi irregolari e sono più diffuse e meno compatte rispetto agli hPSCs - questo evoca una transizione epiteliale-mesenchymica, poiché le cellule epiblaste pluripotenti differenziano e si inleggo...

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Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Questo protocollo descrive in dettaglio un metodo monostrato e privo di siero-per generare in modo efficiente cellule simili a epatociti da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) in 18 giorni. Ciò comporta sei passaggi in quanto gli hPSC si differenziano in sequenza in tipi di cellule intermedie come la striscia primitiva, l'endoderma definitivo, il foregut posteriore e i progenitori del germoglio epatico prima di formare cellule simili a epatociti.

Differenziazione efficiente delle cellule staminali pluripotenti umane nelle cellule del fegato

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Questo metodo consente la generazione di un gran numero di progenitori di gemme epatiche umane e cellule simili a epatociti con elevata purezza. La capacità di generare queste cellule del fegato potrebbe essere importante per la medicina rigenerativa e altri campi. Controllando le vie di segnalazione dello sviluppo per promuovere la differenziazione epatica e sopprimere la formazione di tipi di cellule indesiderate, questo metodo consente una generazione efficiente di progenitori di gemme epatiche umane e cellule simili a epatociti rispettivamente di sei e 18 giorni di differenziazione.Il principale vantaggio di questa tecnica è l'elevata purezza delle cellule epatiche umane generate. Per essere questa procedura, aggiungere 50 millilitri di IMDM a un pallone conico contenente una barra di agitazione. Riscaldare il mezzo a 50 gradi Celsius e aggiungere 0,5 grammi di PVA mescolando continuamente per preparare uno stock di PVA a una concentrazione di 10 milligrammi per millilitro.Successivamente, rimuovere la soluzione di PVA dalla pastiglia di riscaldamento e consentirgli di raffreddarsi a temperatura ambiente. Una volta raffreddata la soluzione, filtrarla attraverso un filtro sterile da 0,2 micrometri. Preparare cdm2 e CDM3 combinando il PVA filtrato con altri reagenti come descritto nella tabella uno del protocollo di testo.Utilizzare un filtro sterile da 0,2 micrometri per filtrare tutti i supporti. Quindi, preparare i supporti di base rimanenti, CDM4 e CDM5, come descritto nella tabella uno del protocollo di testo. Per preparare il mezzo di differenziazione, scongelare prima le piccole molecole congelate e/o i fattori di crescita a temperatura ambiente.Aliquota la quantità richiesta di mezzo di base e aggiungi le piccole molecole e i fattori di crescita specificati al mezzo di base alle concentrazioni appropriate. Il giorno prima dell'uso, scongelare la matrice a quattro gradi Celsius. Il giorno dopo, diluire la matrice con un rapporto tra uno e 100 aggiungendo 500 microlitri di matrice in 50 millilitri di DMEM freddo.Pipettare la matrice diluita nel numero richiesto di pozzi utilizzando un volume di soluzione sufficiente a coprire la superficie del pozzo. Trasferire la piastra rivestita a matrice in un incubatore a 37 gradi Celsius per almeno 60 minuti. Immediatamente prima della semina, aspirare la soluzione a matrice rimanente dai pozzi rivestiti.Quindi, aspirare il mezzo da una piastra di coltura hPSC in gran parte confluente e aggiungere agente di dissociazione acquistato commercialmente, assicurandosi di utilizzare quanto basta per coprire la superficie su cui le cellule stanno crescendo. Incubare gli hPSC nell'agente di dissociazione a 37 gradi Celsius per cinque minuti o fino a quando alcune colonie iniziano a staccarsi. Aggiungere quindi DMEM e F-12 per diluire l'agente di dissociazione.Utilizzare una pipetta sierologica a cinque millilitri per pipettare delicatamente su e giù più volte per lavare via tutte le cellule dalla superficie del pozzo. Raccogliere le singole celle rimorsiate in un tubo conico da 50 millilitri e diluire con DMEM e F-12 in base alle esigenze. Centrifugare questo tubo di hPSC raccolti a 350 volte g e a quattro gradi Celsius per tre minuti per pellettare le cellule.In attesa della centrifugazione, aspirare la matrice dalla piastra in cui verranno seminati gli hPSC. Aggiungere una quantità sufficiente di supporti mTeSR ai pozzi destinatari per coprirli. Quando la centrifugazione è completa, aspirare con cura il supernatante, lasciando gli hPSC pelletati nella parte inferiore del tubo conico.Resuspend il pellet cellulare in mTeSR integrato con un micromolare di Tiazovivin ottenuto commercialmente. Utilizzando una pipetta P1000, triturare delicatamente da due a tre volte per rimescolare uniformemente il pellet cellulare in una singola sospensione cellulare. Pipettare immediatamente 10 microlitri della sospensione cellulare in un emocitometro e contare il numero di cellule.Regolare il volume degli hPSC rimorsi con mTeSR integrato con Thiazovivin per ottenere la concentrazione cellulare desiderata per la placcatura. Quindi, agitare la piastra in un motivo incrociato più volte per assicurarsi che le cellule siano distribuite uniformemente. Dopo che gli hPSC sono stati placcati per almeno 24 ore, utilizzare un microscopio a contrasto di fase per controllare la morfologia delle cellule con particolare enfasi sul diametro delle colonie hPSC placcate.Preparare quindi il primo mezzo di differenziazione APS del primo giorno, come indicato nella tabella due del protocollo di testo. Un giorno dopo la semina, aspirare il mTeSR integrato con Thiazovivin dagli hPSC placcati e lavarli brevemente con supporti IMDM. Successivamente, aggiungere il primo giorno di supporto agli hPSC.Registrare il tempo e riposizionare le cellule nell'incubatrice a 37 gradi Celsius. Continua con i successivi passaggi di differenziazione preparando il mezzo di differenziazione necessario e aggiungendolo alle cellule nei rispettivi giorni di differenziazione intorno alla stessa ora del giorno. In questo studio, popolazioni arricchite di progenitori di gemme epatiche e successivamente cellule simili a epatociti sono generate da hPSC.Al secondo giorno di differenziazione, le cellule striate primitive si sono differenziate in cellule endodermiche definitive al secondo giorno. La stragrande maggioranza di queste cellule esprime SOX17 e FOXA2. Al terzo giorno di differenziazione, le cellule endodermiche si sono differenziate in progenitori di foregut che appaiono di forma poligonale.Più tardi, al sesto giorno, i progenitori del progenitore del mento si sono differenziati in progenitori del bocciolo epatico. Questi progenitori di gemme epatiche esprimono AFP, TPX3 e HNF4alpha. Attraverso tre linee hPSC, questo metodo genera il sesto giorno di progenitori epatici positivi all'AFP con un'efficienza di circa l'89%Infine, dopo 18 giorni di differenziazione epatica dagli hPSC, compaiono cellule epatocite positive all'albumina.Morfologicamente, queste cellule appaiono epiteliali, formando bordi luminosi che ricordano i canaliculi biliari. In questa fase, il citoplasma degli epatociti derivati da hPSC del giorno appare più scuro del nucleo. Quando si seminano cellule staminali pluripotenti umane per la differenziazione, è imperativo seminarle alla giusta densità e anche distribuirle attraverso il pozzo scuotendo la piastra.La capacità di produrre epatociti umani in vitro è una tecnologia abilitante che consentirà agli scienziati di studiare i meccanismi alla base dello sviluppo epatico. Questo metodo produce un gran numero di epatociti umani in vitro che potrebbero essere utilizzati per studiare la funzionalità e la malattia epatica e per consentire infine nuove terapie per l'insufficienza epatica.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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Regia di differenziazione dei progenitori ematopoietici primitivi e definitivo da cellule staminali pluripotenti umane

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Ricerca

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In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generazione in Vitro di Somite derivati da umani indotta da cellule staminali pluripotenti indotte

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation

Trattamento transitorio delle cellule staminali pluripotenti umane con DMSO per promuovere la differenziazione

Despite the growing use of pluripotent stem cells (PSCs), challenges in efficiently differentiating embryonic and induced pluripotent stem cells (ESCs and ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

Differenziazione neurale efficiente utilizzando la coltura a cella singola di cellule staminali embrionali umane

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...