Name: efficient differentiation of human pluripotent stem cells into liver cells
Uploaded: 2019-06-11T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells at JoVE.com

우리는 토론과 줄기 세포 생물학 & 인프라 지원을위한 재생 의학에 대한 스탠포드 연구소 빙 림 에게 감사드립니다. 이 작품은 재생 의학에 대한 캘리포니아 연구소에 의해 지원되었다 (DISC2-10679) 스탠포드 - UC 버클리 시벨 줄기 세포 연구소 (L.T.A. 및 K.M.L.에) 분자 및 유전 의학뿐만 아니라 익명에 대한 스탠포드 베크만 센터, 박스터와 디제노바 가족 (K.M.L.에).

1. 차별화 매체 준비
참고: 사용되는 재료 및 시약에 대한 제조업체 정보는 재료 표를 참조하십시오.
<ol><li>
염기 화학적으로 정의된 매체(CDM)의 준비 참고: CDM2, CDM3, CDM4 및 CDM5는 다양한 단계에서 hPSCs를 간 세포로 분화하기 위한 기본 매체로 사용되는 화학적으로 정의된 매체입니다. 이러한 매체의 구성은 표 1에서찾을 수 ...

<ol>
	<li>Bernal, W., Wendon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Liver+Failure.">Acute Liver Failure.</a> New England Journal of Medicine. 369, 2525-2534 (2013).</li><li>Ang, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Roadmap+for+Human+Liver+Differentiation+from+Pluripotent+Stem+Cells.">A Roadmap for Human Liver Differentiation from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Reports. 22, 2190-2205 (2018).</li><li>Fisher, R. A., Strom, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Hepatocyte+Transplantation:+Worldwide+Results.">Human Hepatocyte Transplantation: Worldwide Results.</a> Transplantation. 82, 441-449 (2006).</li><li>Dhawan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+human+hepatocyte+transplantation:+Current+status+and+challenges.">Clinical human hepatocyte transplantation: Current status and challenges.</a> Liver transplantation. 21, S39-S44 (2015).</li><li>Salama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+Hematopoietic+Stem+Cell+Transplantation+in+48+Patients+with+End-Stage+Chronic+Liver+Diseases.">Autologous Hematopoietic Stem Cell Transplantation in 48 Patients with End-Stage Chronic Liver Diseases.</a> Cell Transplantation. 19, 1475-1486 (2017).</li><li>Tan, A. K. Y., Loh, K. M., Ang, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+regenerative+potential+and+functionality+of+human+liver+cells+in+mice.">Evaluating the regenerative potential and functionality of human liver cells in mice.</a> Differentiation. 98, 25-34 (2017).</li><li>Loh, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Endoderm+Induction+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+by+Logically+Directing+Signals+Controlling+Lineage+Bifurcations.">Efficient Endoderm Induction from Human Pluripotent Stem Cells by Logically Directing Signals Controlling Lineage Bifurcations.</a> Cell Stem Cell. 14, 237-252 (2014).</li><li>Loh, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+Pairwise+Choices+Leading+from+Pluripotency+to+Human+Bone,+Heart,+and+Other+Mesoderm+Cell+Types.">Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types.</a> Cell. , 451-467 (2016).</li><li>Zhao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+the+efficient+metabolic+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+hepatocytes+by+correcting+specification+defects.">Promotion of the efficient metabolic maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes by correcting specification defects.</a> Cell Research. 23, 157-161 (2012).</li><li>Si Tayeb, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+generation+of+human+hepatocyte-like+cells+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells.</a> Hepatology. 51, 297-305 (2010).</li><li>Carpentier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+in+miniaturized+format+suitable+for+high-throughput+screen.">Hepatic differentiation of human pluripotent stem cells in miniaturized format suitable for high-throughput screen.</a> Stem Cell Research. 16, 640-650 (2016).</li><li>Avior, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial-derived+lithocholic+acid+and+vitamin+K2+drive+the+metabolic+maturation+of+pluripotent+stem+cells-derived+and+fetal+hepatocytes.">Microbial-derived lithocholic acid and vitamin K2 drive the metabolic maturation of pluripotent stem cells-derived and fetal hepatocytes.</a> Hepatology. 62, 265-278 (2015).</li><li>Ogawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+and+cAMP+signaling+promote+the+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+hepatocytes.">Three-dimensional culture and cAMP signaling promote the maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes.</a> Development. 140, 3285-3296 (2013).</li><li>Rostovskaya, M., Bredenkamp, N., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+consistent+generation+of+pancreatic+lineage+progenitors+from+human+pluripotent+stem+cells.">Towards consistent generation of pancreatic lineage progenitors from human pluripotent stem cells.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 370, 20140365 (2015).</li><li>Haridass, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repopulation+Efficiencies+of+Adult+Hepatocytes,+Fetal+Liver+Progenitor+Cells,+and+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Hepatic+Cells+in+Albumin-Promoter-Enhancer+Urokinase-Type+Plasminogen+Activator+Mice.">Repopulation Efficiencies of Adult Hepatocytes, Fetal Liver Progenitor Cells, and Embryonic Stem Cell-Derived Hepatic Cells in Albumin-Promoter-Enhancer Urokinase-Type Plasminogen Activator Mice.</a> The American Journal of Pathology. 175, 1483-1492 (2009).</li></ol>

이 방법은 hPSCs에서 간 꽃 봉오리 선조, 그리고 이후에 간세포 와 같은 세포의 농축 된 집단의 생성을 가능하게합니다. 인간 간 세포의 풍부한 인구를 생성 하는 능력은 이러한 세포의 실제적인 활용에 대 한 중요 하다. hPSCs로부터 간세포를 생성하는 이전 방법은 설치류로 이식시, 간 조직15이외에 뼈와 연골을 산출하는 간 및 비간 세포를 모두 포함하는 불순한 세포 집단을 산출?...

이 프로토콜의 목적은 인간 다능성 줄기 세포(hPSCs)를 간 싹 선조 및 간세포 유사 세포의 농축된 집단으로 효율적으로 분화하는 것입니다 2. 인간의 간 전구체와 간세포 같은 세포의 준비 공급에 대한 액세스는 간 기능 과 질병을 조사하기위한 노력을 가속화하고 간부전을위한 새로운 세포 이식 치료를 가능하게 할 수 3,4, 5. 이것은 hPSCs (배아 및 유도 만능 줄기 세포를 포함하는)가 인체의 모든 세포 유형으로 분화 할 수 있기 때문에 과거에 도전적인 것으로 입증되었습니다. 결과적으로, 간세포6과같은 단일 세포형의 순수한 집단으로 이들을 독점적으로 분화하는 것이 어려웠다.
hPSCs를 간 세포로 정확하게 분화하려면 먼저 간 세포가 지정되는 방법뿐만 아니라 비 간 세포 유형이 어떻게 발달하는지 이해하는 것이 중요합니다. 비간 세포가 어떻게 발달하는지에 대한 지식은 분화 동안 비 간 혈통의 형성을 논리적으로 억제하는 것이중요하며, 따라서 독점적으로 간 운명을 향한 hPSCs를 유도2. 둘째, hPSC가 간 운명을 향해 차별화되는 다중 발달 단계를 묘사하는 것이 필수적입니다. hPSC는 간세포 유사 세포(HEP)를 형성하기 전에 원시적 줄무늬(APS), 최종 내배엽(DE), 후방 포구트(PFG) 및 간 꽃봉오리 전구(LB)로 알려진 여러 세포 유형으로 순차적으로 분화하는 것으로 알려져 있습니다. 이전 작품은 각 발달 혈통 선택 2에서 간 운명을 지정하는 신호와 대체 비 간 세포 유형 (위, 췌장 및 장 전구체 포함)의 형성을 억제한 신호를 밝혀냈습니다2. 7명 , 8.
전체적으로, 이러한 통찰력은 원시적 인 줄무늬, 최종 내배엽, 후방 포레트, 간 싹 선조 및 마지막으로, 간 세포형 세포2를 향해 hPSCs를분화하는 무혈청, 단층 방법을 초래하였다. 전반적으로 방법은 적절한 밀도에서 단층에서 hPSCs의 시드를 포함, 분화 매체의 여섯 칵테일을 준비 (다양한 발달 신호 경로를 조절 성장 인자와 작은 분자를 포함), 순차적으로 이들 매체를 첨가하여 18일의 과정을 통해 분화를 유도한다. 이 과정에서 세포를 통과하지 못했습니다. 참고로, 이 방법은 비간 세포 유형의 형성을 억제하는 신호를 명시적으로 포함하기 때문에, 이 분화 접근법1은 현존하는 세포에 비해 간 전구체및 간세포 유사 세포를 보다 효율적으로 생성합니다. 차별화 방법2,9,10,11,12. 더욱이, 이 본문에 기술된 프로토콜은 궁극적으로 다른 프로토콜 9,10에 의해 생성된 것보다 더 높은 수준의 간 전사 인자와 효소를 발현하는 간세포의 빠른 생성을 가능하게한다. , 11세 , 12.
여기에 설명된 프로토콜은 현재 의분화 프로토콜에 비해 특정 한 장점이 있습니다. 첫째, hPSCs의 단층 분화는 배아체(13)에 의존하는 것과 같은 3차원 분화 방법에 비해 기술적으로더 간단하다. 둘째, 이 방법은 최근 진행된 사전을 통해 최종 내배엽 세포(간 세포의 초기 전구체)가 hPSC 분화2,7일이내에 효율적이고 빠르게 생성될 수 있어 후속 세포가 가능하도록 한다. 순도가 증가한 간세포 의 생산. 셋째, 나란히 비교에서, 이 방법에 의해 생성된 간세포형 세포2는 다른 방법에서 생성된 간세포에 비해 더 많은 ALBUMIN을 생성하고 더 높은 수준의 간 전사 인자와 효소를 발현한다10, 11,12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >&#160;Geltrex</td>
			<td >Thermofisher Scientific</td>
			<td >A1569601</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1:1 DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.2&#160;&#956;m pore membrane filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GTTP02500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mTeSR1</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thiazovivin</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>3845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >&#160;Accutase</td>
			<td>Gibco or Millipore&#160;</td>
			<td>Gibco A11105, Millipore&#160; SCR005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >IMDM, GlutaMAX&#8482; Supplement</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>31980030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ham&#39;s F-12 Nutrient Mix, GlutaMAX&#8482; Supplement</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>31765035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >KOSR, Knockout serum replacement</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly(vinyl alcohol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;&#160;</td>
			<td>P8136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Transferrin&#160;</td>
			<td >Sigma-Aldrich&#160;&#160;</td>
			<td >10652202001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chemically Defined Lipid Concentrate</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td >11905031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >human Activin</td>
			<td >R&#38;D</td>
			<td>338-AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CHIR99201</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>4423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PI103</td>
			<td >Tocris</td>
			<td >2930/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >human FGF2</td>
			<td >R&#38;D</td>
			<td>233-FB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DM3189</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>6053/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >A83-01</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>2939/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Human BMP4</td>
			<td >R&#38;D</td>
			<td>314-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C59</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>5148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TTNPB</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>0761/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Forskolin</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>1099/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Oncostatin M</td>
			<td >R&#38;D</td>
			<td>295-OM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dexamethasone</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>1126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ro4929097</td>
			<td >Selleck Chem</td>
			<td>S1575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AA2P</td>
			<td>Cayman chemicals</td>
			<td>16457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >human recombinant Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;&#160;</td>
			<td>11061-68-0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient differentiation of human pluripotent stem cells into liver cells

간은 유해 물질을 해독하고, 중요한 단백질을 분비하며, 주요 대사 활동을 실행하여 생명을 유지합니다. 따라서 만성 알코올 섭취, 간염, 급성 중독 또는 기타 모욕으로 인해 발생할 수 있는 간 부전은 출혈, 황달, 혼수 상태 및 결국 사망에 이르는 심각한 상태입니다. 그러나, 간 기능 및 질병의 연구 뿐만 아니라 간 부전을 치료 하는 접근, 인간의 간 세포의 풍부한 공급의 부족에 의해 부분적으로 stymied 되었습니다. 이를 위해 이 프로토콜은 인간 다능성 줄기 세포(hPSCs)를 간세포와 같은 세포로 효율적으로 분화하는 것을 상세히 설명하며, 6개의 연속적인 분화 단계에 걸쳐 간 운명이 어떻게 지정되는지를 설명하는 개발 로드맵에 의해 안내된다. 간 분화를 촉진하고 원치 않는 세포 운명의 형성을 명시적으로 억제하기 위해 발달 신호 경로를 조작함으로써,이 방법은 효율적으로 일 6에 의해 인간의 간 꽃 봉오리 선조와 간세포 같은 세포의 인구를 생성 PSC 차별화의 18. 이것은 혈청이 없는 배양 매체에 있는 작은 분자 그리고 성장 인자에 의해 발휘된 발달 신호 통로의 시간적으로 정확한 통제를 통해 달성됩니다. 이 시스템의 분화는 단층에서 발생하고 특징적인 간세포 효소를 발현하고 만성 간 기능 부전의 마우스 모델을 생착시키는 능력을 가진 간세포와 같은 세포를 산출합니다. 효율적으로 생체 외에서 인간의 간 세포의 큰 숫자를 생성 하는 능력은 간 부전의 치료에 대 한 파급 효과, 약물 검사에 대 한, 그리고 간 질환의 기계론 연구에 대 한.

APS 분화의 24 시간 후에, 식민지는 일반적으로 hPSC 식민지를 할례하는 밝은 경계의 손실과 수반되는 미분화 콜로니와는 다른 형태를 채택할 것입니다. 형태학적으로, 원시 줄무늬 세포는 일반적으로 비정형 테두리를 가지고 있으며 hPSCs보다 더 많이 퍼지고 덜 컴팩트합니다 -이것은 다능성 epiblast 세포가 원형으로 분화하고 침투함에 따라 상피 - 중간엽 전이를 연상시킵니?...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells at JoVE.com

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

이 프로토콜은 18일 만에 인간 만능 줄기 세포(hPSCs)로부터 간세포 유사 세포를 효율적으로 생성하는 단층, 무혈청 방법을 상세히 기술한다. 이것은 hPSCs가 간세포 같이 세포를 형성하기 전에 원시적인 선미, 결정적인 내배엽, 후방 포인및 간 싹 선조와 같은 중간 세포 모형으로 순차적으로 분화하는 것과 같이 6단계를 수반합니다.

인간 다능성 줄기 세포를 간 세포로 효율적으로 분화

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

이 방법은 높은 순도인간 간싹 선조및 간세포 같이 세포의 다수의 생성을 가능하게 합니다. 이 간 세포를 생성하는 기능은 재생 의학 및 그밖 필드에 중요할 수 있었습니다. 간 분화를 촉진하고 원치 않는 세포 유형의 형성을 억제하기 위해 발달 신호 경로를 제어함으로써,이 방법은 각각 분화의 6 및 18 일에 의해 인간 간 새싹 선조및 간세포 와 같은 세포의 효율적인 생성을 가능하게한다.이 기술의 주요 장점은 생성 된 인간 간 세포의 높은 순도이다. 이 절차이기 위해 교반 바가 들어 있는 원추형 플라스크에 50밀리리터의 IMDM을 추가합니다. 중간 을 섭씨 50도까지 가열하고 0.5 그램의 PVA를 추가하면서 지속적으로 교반하여 밀리리터 당 10 밀리그램의 농도로 PVA 스톡을 준비합니다.그런 다음 가열 패드에서 PVA 용액을 제거하고 실온으로 냉각할 수 있습니다. 용액이 냉각되면 멸균, 0.2 마이크로미터 필터를 통해 필터링합니다. 텍스처 프로토콜 중 하나에 설명된 대로 필터링된 PVA와 다른 시약을 결합하여 CDM2 및 CDM3를 준비합니다.멸균, 0.2 마이크로미터 필터를 사용하여 모든 미디어를 필터링합니다. 그런 다음 표에 설명된 대로 나머지 기본 미디어인 CDM4 및 CDM5를 텍스트 프로토콜 중 하나에 준비합니다. 분화 매체를 준비하려면 먼저 실온에서 냉동 된 작은 분자 및 / 또는 성장 인자를 해동하십시오.Aliquot는 필요한 양의 염기 배지를 내분하고 지정된 소분자 및 성장 인자를 적절한 농도에서 기저 배지에 첨가한다. 사용하기 전날, 섭씨 4도에서 매트릭스를 해동하십시오. 다음 날, 500 마이크로리터의 매트릭스를 콜드 DMEM 50 밀리리터에 추가하여 1대 100의 비율로 매트릭스를 희석시하십시오.희석된 매트릭스를 우물 표면을 덮기 위해 충분한 양의 용액을 사용하여 필요한 수의 우물로 파이펫을 넣습니다. 매트릭스 코팅 플레이트를 섭씨 37도에서 인큐베이터로 최소 60분간 옮김합니다. 파종 직전에 코팅된 우물에서 나머지 매트릭스 용액을 흡인합니다.그런 다음, 크게 수렴 hPSC 배양 플레이트에서 배지를 흡인하고 상업적으로 구입 한 해리제를 추가하여 세포가 성장하는 표면을 덮기 위해 충분히 사용해야합니다. 해리 에이전트에서 hPSC를 5분 동안 섭씨 37도에서 또는 일부 식민지가 분리되기 시작할 때까지 hPSC를 배양합니다. 다음으로 DMEM 및 F-12를 추가하여 해리제를 희석시합니다.5 밀리리터 세로지오니컬 파이펫을 사용하여 여러 번 부드럽게 파이펫을 사용하여 우물 표면에서 모든 세포를 씻어냅니다. 50 밀리리터 원옥 튜브에서 다시 중단된 단일 세포를 수집하고 필요에 따라 DMEM 및 F-12로 희석하십시오. 수집된 hPSC의 이 튜브는 350배, 섭씨 4도에서 3분간 세포를 펠릿으로 처리합니다.원심 분리를 기다리는 동안 hPSC가 시드되는 플레이트에서 행렬을 흡인시합니다. 받는 우물에 충분한 양의 mTeSR 미디어를 추가하여 이를 다룹니다. 원심분리가 완료되면, 상류체를 주의 깊게 흡인하여 원추형 튜브 의 바닥에 펠렛 hPSC를 남깁니다.mTeSR에서 세포 펠릿을 소판하여 상업적으로 획득한 티아조빈의 1마이크로몰라로 보충하였다. P1000 파이펫을 사용하여 2~3회 부드럽게 세살하여 셀 펠릿을 단일 셀 서스펜션으로 균일하게 재보냅니다. 즉시 혈전계로 세포 현탁액의 10 마이크로 리터를 피펫하고 세포의 수를 계산합니다.도금에 대한 원하는 세포 농도를 달성하기 위해 티아조빈 보충 mTeSR로 재부유 된 hPSC의 부피를 조정합니다. 그런 다음, 전지가 균등하게 분포되어 있는지 확인하기 위해 교차 패턴으로 플레이트를 여러 번 흔들어 놓습니다. hPSC가 적어도 24 시간 동안 도금 된 후, 상 대비 현미경을 사용하여 도금 된 hPSC 콜로니의 직경에 특정 중점을 둔 세포의 형태를 확인하십시오.다음으로 텍스트 프로토콜 의 탁 2에 설명된 대로 1일 APS 차별화 매체를 준비합니다. 시드 후 하루, 도금 hPSC에서 티아조빈 보충 mTeSR을 흡인하고 간략하게 IMDM 매체로 씻어. 이 후 hPSC에 하루 1 개의 매체를 추가합니다.시간을 기록하고 세포를 인큐베이터에 다시 넣고 섭씨 37도에서 넣습니다. 필요한 분화 매체를 준비하고 하루 중 같은 시간에 각각분화하는 날에 세포에 추가하여 후속 분화 단계를 계속하십시오. 이 연구에서는, 간 싹 선조와 그 후에 간세포 같이 세포의 풍부한 인구는 hPSCs에서 생성됩니다.분화의 둘째 날까지, 원시 적 줄무늬 세포는 2 일 결정적인 엔데덤 세포로 분화했습니다. 이 세포의 대다수는 SOX17 및 FOXA2를 발현합니다. 분화의 셋째 날까지, 내분 세포는 모양에 다각형을 나타나는 전구선으로 분화했다.나중에, 6 일째에, 전대장 선조는 간 싹 선조로 분화했습니다. 이 간 싹 선조는 AFP, TPX3 및 HNF4alpha를 표현합니다. 3hPSC 라인을 통해, 이 방법은 hPSC에서 간 분화의 18 일 후에, 약 89%의 효율성에 있는 6개의 AFP 양성 간 선조를 생성합니다, 알부민 양성 간세포 같이 세포가 나타납니다.형태학적으로, 이 세포는 담즙 카날리큘리를 연상시키는 밝은 테두리를 형성하는 상피로 나타납니다. 이 단계에서, 18 hPSC 유래 간세포의 세포질은 핵보다는 어둡게 나타납니다. 분화를 위해 인간 만능 줄기 세포를 파종할 때, 올바른 밀도로 그들을 씨앗을 뿌리고 또한 판을 흔들어 우물에 걸쳐 분배하는 것이 필수적입니다.체외에서 인간 간세포를 생성하는 능력은 과학자들이 간 발달의 기전을 조사 할 수있는 가능하게하는 기술입니다. 이 방법은 간 기능 및 질병을 조사하고 결국 간 부전을 위한 새로운 치료를 가능하게 하기 위하여 이용될 수 있던 시험관에서 인간 간세포의 다수를 생성합니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

기본 및 확실 한 조 혈 창시자 인간 만능 줄기 세포에서의 감독

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

연구

발생학

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

능성의 효율적인 분화 NKX6-1에 줄기 세포<sup&gt; +</sup&gt; 췌장 전구 세포

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

인간 다 능성의 체외 분화에서 융모 세포로 줄기 세포

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Protocol for the Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mixed Cultures of Neurons and Glia for Neurotoxicity Testing

인간 독성 Pluripotent 줄기 세포의 신경 독성 테스트를위한 뉴런과 Glia의 혼합 문화로의 분화를위한 프로토콜

Human pluripotent stem cells can differentiate into various cell types that can be applied to human-based in vitro toxicity assays. One major advantage is ...

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

생체 외에서 기능 Cardiomyocyte-같은 세포로 인간 중간 엽 줄기 세포의 분화

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

인간의 배아 또는 유도 만능 줄기 세포에서 망막 안료 상피 세포의 급속 한, 감독 차별화

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

임상 호환 막 Limbal 상피 줄기 세포 인간 만능 줄기 세포에서의 효율적이 고 확장 가능한 감독된 차별화

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

인간 유도에서 Somite 파생 상품의 체 외 발생에서 만능 줄기 세포

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation

분화를 촉진하기 위해 DMSO를 사용하여 인간 다능성 줄기 세포의 일시적인 치료

Despite the growing use of pluripotent stem cells (PSCs), challenges in efficiently differentiating embryonic and induced pluripotent stem cells (ESCs and ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

인간 배아 줄기 세포의 단세포 배양을 이용한 효율적인 신경 분화

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...