Name: efficient differentiation of human pluripotent stem cells into liver cells
Uploaded: 2019-06-11T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells at JoVE.com

Vi takker Bing lim for diskusjoner og Stanford Institute for Stem Cell Biology & regenererende medisin for infrastruktur støtte. Dette arbeidet ble støttet av California Institute for regenererende Medicine (DISC2-10679) og Stanford-UC Berkeley Siebel Stem Cell Institute (til L.T.A. og K.M.L.) og Stanford Beckman Center for Molecular og genetisk Medicine samt anonym, Baxter og DiGenova familier (til K.M.L.).

1. utarbeidelse av differensiering Media
Merk: Se tabellen over materialer for produsent informasjon om materialer og reagenser som brukes.
<ol><li>
Tilberedning av basis kjemisk definerte medier (CDM) Merk: CDM2, CDM3, CDM4 og CDM5 er kjemisk definerte medier som brukes som base medier for å skille hPSCs til leverceller på ulike stadier. Sammensetningen av disse mediene finnes i tabell 1.<ol>
<li>For å gjøre CDM2 ell...

<ol>
	<li>Bernal, W., Wendon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Liver+Failure.">Acute Liver Failure.</a> New England Journal of Medicine. 369, 2525-2534 (2013).</li><li>Ang, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Roadmap+for+Human+Liver+Differentiation+from+Pluripotent+Stem+Cells.">A Roadmap for Human Liver Differentiation from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Reports. 22, 2190-2205 (2018).</li><li>Fisher, R. A., Strom, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Hepatocyte+Transplantation:+Worldwide+Results.">Human Hepatocyte Transplantation: Worldwide Results.</a> Transplantation. 82, 441-449 (2006).</li><li>Dhawan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+human+hepatocyte+transplantation:+Current+status+and+challenges.">Clinical human hepatocyte transplantation: Current status and challenges.</a> Liver transplantation. 21, S39-S44 (2015).</li><li>Salama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+Hematopoietic+Stem+Cell+Transplantation+in+48+Patients+with+End-Stage+Chronic+Liver+Diseases.">Autologous Hematopoietic Stem Cell Transplantation in 48 Patients with End-Stage Chronic Liver Diseases.</a> Cell Transplantation. 19, 1475-1486 (2017).</li><li>Tan, A. K. Y., Loh, K. M., Ang, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+regenerative+potential+and+functionality+of+human+liver+cells+in+mice.">Evaluating the regenerative potential and functionality of human liver cells in mice.</a> Differentiation. 98, 25-34 (2017).</li><li>Loh, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Endoderm+Induction+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+by+Logically+Directing+Signals+Controlling+Lineage+Bifurcations.">Efficient Endoderm Induction from Human Pluripotent Stem Cells by Logically Directing Signals Controlling Lineage Bifurcations.</a> Cell Stem Cell. 14, 237-252 (2014).</li><li>Loh, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+Pairwise+Choices+Leading+from+Pluripotency+to+Human+Bone,+Heart,+and+Other+Mesoderm+Cell+Types.">Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types.</a> Cell. , 451-467 (2016).</li><li>Zhao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+the+efficient+metabolic+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+hepatocytes+by+correcting+specification+defects.">Promotion of the efficient metabolic maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes by correcting specification defects.</a> Cell Research. 23, 157-161 (2012).</li><li>Si Tayeb, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+generation+of+human+hepatocyte-like+cells+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells.</a> Hepatology. 51, 297-305 (2010).</li><li>Carpentier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+in+miniaturized+format+suitable+for+high-throughput+screen.">Hepatic differentiation of human pluripotent stem cells in miniaturized format suitable for high-throughput screen.</a> Stem Cell Research. 16, 640-650 (2016).</li><li>Avior, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial-derived+lithocholic+acid+and+vitamin+K2+drive+the+metabolic+maturation+of+pluripotent+stem+cells-derived+and+fetal+hepatocytes.">Microbial-derived lithocholic acid and vitamin K2 drive the metabolic maturation of pluripotent stem cells-derived and fetal hepatocytes.</a> Hepatology. 62, 265-278 (2015).</li><li>Ogawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+and+cAMP+signaling+promote+the+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+hepatocytes.">Three-dimensional culture and cAMP signaling promote the maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes.</a> Development. 140, 3285-3296 (2013).</li><li>Rostovskaya, M., Bredenkamp, N., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+consistent+generation+of+pancreatic+lineage+progenitors+from+human+pluripotent+stem+cells.">Towards consistent generation of pancreatic lineage progenitors from human pluripotent stem cells.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 370, 20140365 (2015).</li><li>Haridass, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repopulation+Efficiencies+of+Adult+Hepatocytes,+Fetal+Liver+Progenitor+Cells,+and+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Hepatic+Cells+in+Albumin-Promoter-Enhancer+Urokinase-Type+Plasminogen+Activator+Mice.">Repopulation Efficiencies of Adult Hepatocytes, Fetal Liver Progenitor Cells, and Embryonic Stem Cell-Derived Hepatic Cells in Albumin-Promoter-Enhancer Urokinase-Type Plasminogen Activator Mice.</a> The American Journal of Pathology. 175, 1483-1492 (2009).</li></ol>

Denne metoden gjør det mulig generering av beriket bestander av lever knopp forfedre, og senere hepatocytter celler, fra hPSCs. Evnen til å generere beriket bestander av menneskelig leverceller er viktig for praktisk utnyttelse av slike celler. Tidligere metoder for å generere hepatocytter fra hPSCs gitt uren celle populasjoner som inneholder både lever og ikke-leverceller som, ved transplantasjon til gnagere, gitt bein og brusk i tillegg til leveren vev15. Derav eksplisitt undertrykkelse av i...

Formålet med denne protokollen er å effektivt differensiere menneskelige Pluripotent stamceller (hPSCs) i beriket bestander av lever knopp forfedre og hepatocytter celler2. Tilgang til en klar tilførsel av menneskelig leveren forfedre og hepatocytter-lignende celler vil akselerere arbeidet med å undersøke leveren funksjon og sykdom og kan aktivere nye cellulære transplantasjon terapi for leversvikt3,4, fempå. Dette har vist seg utfordrende i det siste siden hPSCs (som inkluderer embryonale og indusert Pluripotent stamceller) kan differensiere til alle celle-typer av menneskekroppen; Følgelig har det vært vanskelig å bare differensiere dem til en ren befolkning av en enkelt celle-type, for eksempel leverceller6.
For å nøyaktig differensiere hPSCs til leverceller, først er det avgjørende å forstå ikke bare hvordan leverceller er spesifisert, men også hvordan ikke-leveren celle-typer utvikle. Kunnskap om hvordan ikke-leverceller utvikler er viktig å logisk undertrykke dannelsen av ikke-leveren linjene under differensiering, og dermed utelukkende guiding hPSCs mot en lever skjebne2. For det andre er det viktig å avgrense flere utviklingsmessige trinn der hPSCs skille mot en lever skjebne. Det er kjent at hPSCs sekvensielt differensiere til flere celle-typer kjent som primitive strek (APS), definitive endoderm (DE), bakre foregut (PFG) og lever knopp forfedre (LB) før forming hepatocytter celler (HEP). Tidligere arbeid avslørte signalene spesifiserer leveren skjebne og signalene som undertrykte dannelsen av alternative ikke-leveren celle-typer (inkludert mage, bukspyttkjertel, og intestinal forfedre) på hver utviklingsmessige avstamning valg2, 7 andre er , 8i den.
Kollektivt, har disse innsikt gitt opphav til en serum-fri, monolag metode for å differensiere hPSCs mot primitive strek, definitive endoderm, bakre foregut, lever knopp forfedre og til slutt, hepatocytter-lignende celler2. Samlet metoden innebærer seeding i hPSCs i en monolag på en passende tetthet, forbereder seks cocktails differensiering Media (som inneholder vekstfaktorer og små molekyler som regulerer ulike utviklingsmessige signalering trasé), og legge til disse mediene sekvensielt for å indusere differensiering i løpet av 18 dager. Under prosessen er det ikke nødvendig med passaging av celler. Av notatet, fordi denne metoden eksplisitt inkluderer signaler som undertrykker dannelsen av ikke-leveren celle-typer, denne differensiering tilnærming1 mer effektivt genererer leveren forfedre og hepatocytter-lignende celler ved sammenligning til bevarte differensiering metoder2,9, 10,11,12. Videre gjør protokollen som er beskrevet i denne teksten, raskere generering av hepatocytter som til slutt uttrykker høyere nivåer av hepatic transkripsjon faktorer og enzymer enn de som er produsert av andre protokoller9,10 , 11 flere , Det er 12.
Protokollen er beskrevet her har visse fordeler fremfor dagens differensiering protokoller. Først innebærer det monolag differensiering av hPSCs, som er teknisk enklere i forhold til tredimensjonale differensiering metoder, slik som de som er avhengige av embryoid organer13. For det andre utnytter denne metoden en fersk forhånd der definitive endoderm celler (en tidlig forløper til leverceller) kan være effektivt og raskt generert innen 2 dager hPSC differensiering2,7, og dermed aktivere den påfølgende produksjon av hepatocytter med økt renhet. Tredje, i sidestilte sammenligninger, den hepatocytter-lignende celler produsert av denne metoden2 produsere mer ALBUMIN og uttrykke høyere nivåer av hepatic transkripsjon faktorer og enzymer i forhold til hepatocytter produsert i andre metoder10, 11,12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >&#160;Geltrex</td>
			<td >Thermofisher Scientific</td>
			<td >A1569601</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1:1 DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.2&#160;&#956;m pore membrane filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GTTP02500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mTeSR1</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thiazovivin</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>3845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >&#160;Accutase</td>
			<td>Gibco or Millipore&#160;</td>
			<td>Gibco A11105, Millipore&#160; SCR005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >IMDM, GlutaMAX&#8482; Supplement</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>31980030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ham&#39;s F-12 Nutrient Mix, GlutaMAX&#8482; Supplement</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>31765035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >KOSR, Knockout serum replacement</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly(vinyl alcohol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;&#160;</td>
			<td>P8136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Transferrin&#160;</td>
			<td >Sigma-Aldrich&#160;&#160;</td>
			<td >10652202001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chemically Defined Lipid Concentrate</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td >11905031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >human Activin</td>
			<td >R&#38;D</td>
			<td>338-AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CHIR99201</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>4423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PI103</td>
			<td >Tocris</td>
			<td >2930/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >human FGF2</td>
			<td >R&#38;D</td>
			<td>233-FB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DM3189</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>6053/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >A83-01</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>2939/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Human BMP4</td>
			<td >R&#38;D</td>
			<td>314-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C59</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>5148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TTNPB</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>0761/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Forskolin</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>1099/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Oncostatin M</td>
			<td >R&#38;D</td>
			<td>295-OM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dexamethasone</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>1126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ro4929097</td>
			<td >Selleck Chem</td>
			<td>S1575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AA2P</td>
			<td>Cayman chemicals</td>
			<td>16457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >human recombinant Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;&#160;</td>
			<td>11061-68-0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient differentiation of human pluripotent stem cells into liver cells

Leveren detoxifies skadelige stoffer, utskiller vitale proteiner, og utfører viktige metabolske aktiviteter, og dermed opprettholde livet. Følgelig leversvikt-som kan være forårsaket av kronisk alkoholinntak, hepatitt, akutt forgiftning, eller andre fornærmelser-er en alvorlig tilstand som kan kulminere i blødning, gulsott, koma, og til slutt død. Men tilnærminger til behandling leversvikt, samt studier av leverfunksjon og sykdom, har vært stymied delvis av mangelen på en rikelig tilførsel av menneskelig leverceller. For dette formål, denne protokollen detaljer effektiv differensiering av menneskelige Pluripotent stamceller (hPSCs) i hepatocytter celler, guidet av en utviklingsmessige veikart som beskriver hvordan leveren skjebne er angitt over seks påfølgende differensiering trinn. Ved å manipulere utviklingsmessige signalering veier for å fremme leveren differensiering og eksplisitt undertrykke dannelsen av uønsket celle skjebne, denne metoden genererer effektivt bestander av menneskelig lever knopp forfedre og hepatocytter-lignende celler ved dager 6 og 18 av PSC differensiering, henholdsvis. Dette oppnås gjennom den timelig-presise kontrollen av de utviklingsmessige signal banene, som utøves av små molekyler og vekstfaktorer i et serum fritt kultur medium. Differensiering i dette systemet oppstår i monolagere og gir hepatocytter-lignende celler som uttrykker karakteristiske hepatocytter enzymer og har evnen til å engraft en mus modell av kronisk leversvikt. Evnen til å effektivt generere et stort antall menneskelige leverceller in vitro har forgreninger for behandling av leversvikt, for narkotika screening, og for mekanistisk studier av leversykdom.

Etter 24 h av APS differensiering, vil koloniene generelt vedta en annen morfologi enn udifferensierte kolonier samtidig med et tap av den lyse grensen som typisk omslutter hPSC kolonier. Morfologisk, primitive strek celler generelt har fillete grenser og er mer spredt og mindre kompakt enn hPSCs-dette er stemningsfull av en epitel-til-mesenchymal overgang som pluripotent epiblast celler differensiere og inntrengning i primitive stripe in vivo. Hvis kolonien størrelsen på hPSCs før dif...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells at JoVE.com

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Denne protokollen detaljer en monolag, serum-fri metode for å effektivt generere hepatocytter celler fra humant Pluripotent stamceller (hPSCs) i 18 dager. Dette medfører seks trinn som hPSCs sekvensielt differensiere til mellomliggende celle-typer som primitive strek, definitive endoderm, bakre foregut og lever knopp forfedre før forming hepatocytter celler.

Effektiv differensiering av Human Pluripotent stamceller i leverceller

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Denne metoden gjør det mulig å generasjon av et stort antall menneskelige leverknopp stamfar og hepatocyte-lignende celler med høy renhet. Evnen til å generere disse levercellene kan være viktig for regenerativ medisin og andre felt. Ved å kontrollere utviklingssignalveiene for å fremme leverdilatering og undertrykke dannelsen av uønskede celletyper, muliggjør denne metoden effektiv generering av menneskelige leverknoppstamere og hepatocytelignende celler med henholdsvis seks og 18 dager med differensiering.Den største fordelen med denne teknikken er den høye renheten av de menneskelige levercellene som genereres. For å være denne prosedyren, legg til 50 milliliter IMDM til en konisk kolbe som inneholder en rørestang. Varm mediet til 50 grader Celsius og tilsett 0,5 gram PVA mens du kontinuerlig rører for å forberede en PVA-bestand med en konsentrasjon på 10 milligram per milliliter.Deretter fjerner du PVA-løsningen fra varmeputen og lar den avkjøles til romtemperatur. Når oppløsningen er avkjølt, filtrerer du den gjennom et sterilt, 0,2 mikrometerfilter. Klargjør CDM2 og CDM3 ved å kombinere den filtrerte PVA med andre reagenser som beskrevet i tabell en av tekstprotokollen.Bruk et sterilt 0,2 mikrometerfilter til å filtrere alle medier. Deretter klargjør du de gjenværende basismediene, CDM4 og CDM5, som beskrevet i tabell en av tekstprotokollen. For å forberede differensieringsmediet, tin først de frosne små molekylene og / eller vekstfaktorene ved romtemperatur.Aliquot ut den nødvendige mengden av base medium og legge de angitte små molekyler og vekstfaktorer til basismediet ved de riktige konsentrasjonene. Dagen før bruk, tine matrisen på fire grader Celsius. Neste dag, fortynne matrisen i et forhold på en til 100 ved å legge til 500 mikroliter matrise i 50 milliliter kald DMEM.Pipette den fortynnede matrisen inn i det nødvendige antall brønner ved hjelp av akkurat nok volum av løsning for å dekke overflaten av brønnen. Overfør den matrisebelagte platen til en inkubator ved 37 grader Celsius i minst 60 minutter. Umiddelbart før såing, aspirer den gjenværende matriseløsningen fra de bebelagte brønnene.Deretter aspirerer mediet fra en stort sett sammenføyd hPSC kulturplate og legger til kommersielt kjøpt dissosiasjonsmiddel, og sørg for å bruke akkurat nok til å dekke overflaten som cellene vokser på. Inkuber hPSCene i dissosiasjonsmiddelet ved 37 grader Celsius i fem minutter eller til noen kolonier begynner å løsne. Deretter legger dmem og F-12 til å fortynne dissosiasjonsmiddelet.Bruk en fem milliliter serologisk pipette til å forsiktig pipette opp og ned flere ganger for å vaske av alle celler fra overflaten av brønnen. Samle de gjenbrukte enkeltcellene i et konisk rør på 50 milliliter og fortynne med DMEM og F-12 etter behov. Sentrifuge dette røret av samlet hPSCs på 350 ganger g og ved fire grader Celsius i tre minutter for å pellet cellene.Mens du venter på sentrifugeringen, aspirer matrisen fra platen der hPSCene vil bli sådd. Legg til en tilstrekkelig mengde mTeSR-medier i mottakerbrønner for å dekke dem. Når sentrifugeringen er fullført, aspirerer forsiktig det overnaturante, og etterlater pelleted hPSCene nederst på det koniske røret.Resuspend cellepellet i mTeSR supplert med en mikromos av kommersielt innhentet Thiazovivin. Bruk en P1000 pipette, forsiktig triturate to til tre ganger for å jevnt gjenbruke cellepellet i en enkelt celle suspensjon. Pipette 10 mikroliter av cellefjæringen umiddelbart i et hemocytometer og telle antall celler.Juster volumet av de resuspended hPSCene med Thiazovivin-supplert mTeSR for å oppnå ønsket cellekonsentrasjon for plating. Deretter rister du platen i et kryssmønster flere ganger for å sikre at cellene er jevnt fordelt. Etter at hPSCs har vært belagt i minst 24 timer, bruk et fasekontrastmikroskop for å kontrollere cellenes morfologi med spesifikk vekt på diameteren på belagte hPSC-kolonier.Deretter klargjør du dag én APS-differensieringsmedium som beskrevet i tabell to av tekstprotokollen. En dag etter såing, aspirere Thiazovivin-supplert mTeSR fra belagte hPSCs og kort vaske dem med IMDM media. Etter dette legger du til dag én medium til hPSCene.Registrer tiden og plasser cellene tilbake i inkubatoren ved 37 grader Celsius. Fortsett med de påfølgende differensieringstrinnene ved å forberede det nødvendige differensieringsmediet og legge det til cellene på de respektive differensieringsdagene rundt samme tid på dagen. I denne studien genereres berikede populasjoner av leverknoppstamere og senere hepatocytelignende celler fra hPSCer.Ved dag to av differensiering har primitive strekceller differensiert i dag to definitive endodermceller. De aller fleste av disse cellene uttrykker SOX17 og FOXA2. Ved dag tre av differensiering har endodermcellene differensiert til foregut stamfarer som vises polygonale i form.Senere, på dag seks, har forfedrene differensiert til leverknoppstamere. Disse leverknoppstamene uttrykker AFP, TPX3 og HNF4alpha. På tvers av tre hPSC linjer, denne metoden genererer dag seks AFP-positive leverstamfar med en effektivitet på ca 89%Endelig, etter 18 dager med leverdiensisjon fra HPSCer, albumin-positive hepatocyte-lignende celler vises.Morfologisk, disse cellene vises epitel, danner lyse grenser som minner om galle canaliculi. På dette stadiet vises dagens cytoplasma 18 hPSC-avledede hepatocytter mørkere enn kjernen. Når seeding menneskelige pluripotente stamceller for differensiering, er det viktig å så dem på riktig tetthet og også å distribuere dem over brønnen ved å riste platen.Evnen til å produsere menneskelige hepatocytter in vitro er en aktiveringsteknologi som vil tillate forskere å undersøke mekanismer underliggende leverutvikling. Denne metoden produserer et stort antall humane hepatocytter in vitro som kan brukes til å undersøke leverfunksjon og sykdom og til slutt muliggjøre nye behandlinger for leversvikt.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Rettet differensiering av Primitive og Definitive blodkreft Progenitors fra menneskelige Pluripotent stamceller

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Effektiv Differensiering av pluripotent stamceller til å NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; bukspyttkjertelen stamfedre

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differensiering av menneskelige pluripotent stamceller til trophoblastic Cells

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Protocol for the Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mixed Cultures of Neurons and Glia for Neurotoxicity Testing

Protokol for differensiering av humane inducerte pluripotente stamceller i blandede kulturer av neuroner og glia for test av neurotoxicitet

Human pluripotent stem cells can differentiate into various cell types that can be applied to human-based in vitro toxicity assays. One major advantage is ...

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

In Vitro Differensiering av menneskelige stamceller i funksjonelle Cardiomyocyte-lignende celler

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Rask, rettet differensiering av netthinnens Pigment epitelceller fra menneskelige embryonale eller indusert Pluripotent stamceller

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Effektiv og skalerbar rettet differensiering av klinisk kompatibel hornhinnen Limbal epitel stamceller fra menneskelige Pluripotent stamceller

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro generasjon av Somite derivater fra menneske indusert stamceller Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation

Transient behandling av humant Pluripotent stamceller med DMSO å fremme differensiering

Despite the growing use of pluripotent stem cells (PSCs), challenges in efficiently differentiating embryonic and induced pluripotent stem cells (ESCs and ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

Effektiv neural differensiering bruker single-Cell kultur av Human embryonale stamceller

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...