Name: efficient differentiation of human pluripotent stem cells into liver cells
Uploaded: 2019-06-11T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells at JoVE.com

Vi tackar Bing lim för diskussioner och Stanford Institutet för stamcellsbiologi & regenerativ medicin för infrastrukturstöd. Detta arbete stöddes av California Institute for Regenerative Medicine (DISK2-10679) och Stanford-UC Berkeley Siebel Stem cell Institute (till L.T.A. och K.M.L.) och Stanford Beckman Center för molekylär och genetisk medicin samt den anonyma, Baxter och DiGenova familjer (till K.M.L.).

1. beredning av differentierings medier
Anmärkning: Se tabellen med material för tillverkarens information om de material och reagenser som används.
<ol><li>
Beredning av bas kemiskt definierade medier (CDM) Anmärkning: CDM2, CDM3, CDM4 och CDM5 är kemiskt definierade medier som används som bas medier för att differentiera hPSCs till leverceller i olika stadier. Sammansättningen av dessa medier finns i tabell 1.<o...

<ol>
	<li>Bernal, W., Wendon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Liver+Failure.">Acute Liver Failure.</a> New England Journal of Medicine. 369, 2525-2534 (2013).</li><li>Ang, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Roadmap+for+Human+Liver+Differentiation+from+Pluripotent+Stem+Cells.">A Roadmap for Human Liver Differentiation from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Reports. 22, 2190-2205 (2018).</li><li>Fisher, R. A., Strom, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Hepatocyte+Transplantation:+Worldwide+Results.">Human Hepatocyte Transplantation: Worldwide Results.</a> Transplantation. 82, 441-449 (2006).</li><li>Dhawan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+human+hepatocyte+transplantation:+Current+status+and+challenges.">Clinical human hepatocyte transplantation: Current status and challenges.</a> Liver transplantation. 21, S39-S44 (2015).</li><li>Salama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+Hematopoietic+Stem+Cell+Transplantation+in+48+Patients+with+End-Stage+Chronic+Liver+Diseases.">Autologous Hematopoietic Stem Cell Transplantation in 48 Patients with End-Stage Chronic Liver Diseases.</a> Cell Transplantation. 19, 1475-1486 (2017).</li><li>Tan, A. K. Y., Loh, K. M., Ang, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+regenerative+potential+and+functionality+of+human+liver+cells+in+mice.">Evaluating the regenerative potential and functionality of human liver cells in mice.</a> Differentiation. 98, 25-34 (2017).</li><li>Loh, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Endoderm+Induction+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+by+Logically+Directing+Signals+Controlling+Lineage+Bifurcations.">Efficient Endoderm Induction from Human Pluripotent Stem Cells by Logically Directing Signals Controlling Lineage Bifurcations.</a> Cell Stem Cell. 14, 237-252 (2014).</li><li>Loh, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+Pairwise+Choices+Leading+from+Pluripotency+to+Human+Bone,+Heart,+and+Other+Mesoderm+Cell+Types.">Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types.</a> Cell. , 451-467 (2016).</li><li>Zhao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+the+efficient+metabolic+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+hepatocytes+by+correcting+specification+defects.">Promotion of the efficient metabolic maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes by correcting specification defects.</a> Cell Research. 23, 157-161 (2012).</li><li>Si Tayeb, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+generation+of+human+hepatocyte-like+cells+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells.</a> Hepatology. 51, 297-305 (2010).</li><li>Carpentier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+in+miniaturized+format+suitable+for+high-throughput+screen.">Hepatic differentiation of human pluripotent stem cells in miniaturized format suitable for high-throughput screen.</a> Stem Cell Research. 16, 640-650 (2016).</li><li>Avior, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial-derived+lithocholic+acid+and+vitamin+K2+drive+the+metabolic+maturation+of+pluripotent+stem+cells-derived+and+fetal+hepatocytes.">Microbial-derived lithocholic acid and vitamin K2 drive the metabolic maturation of pluripotent stem cells-derived and fetal hepatocytes.</a> Hepatology. 62, 265-278 (2015).</li><li>Ogawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+and+cAMP+signaling+promote+the+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+hepatocytes.">Three-dimensional culture and cAMP signaling promote the maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes.</a> Development. 140, 3285-3296 (2013).</li><li>Rostovskaya, M., Bredenkamp, N., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+consistent+generation+of+pancreatic+lineage+progenitors+from+human+pluripotent+stem+cells.">Towards consistent generation of pancreatic lineage progenitors from human pluripotent stem cells.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 370, 20140365 (2015).</li><li>Haridass, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repopulation+Efficiencies+of+Adult+Hepatocytes,+Fetal+Liver+Progenitor+Cells,+and+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Hepatic+Cells+in+Albumin-Promoter-Enhancer+Urokinase-Type+Plasminogen+Activator+Mice.">Repopulation Efficiencies of Adult Hepatocytes, Fetal Liver Progenitor Cells, and Embryonic Stem Cell-Derived Hepatic Cells in Albumin-Promoter-Enhancer Urokinase-Type Plasminogen Activator Mice.</a> The American Journal of Pathology. 175, 1483-1492 (2009).</li></ol>

Denna metod möjliggör generering av anrikade populationer av lever bud progenitorer, och därefter hepatocyte-liknande celler, från hPSCs. Förmågan att generera berikade populationer av mänskliga leverceller är viktigt för den praktiska användningen av sådana celler. Tidigare metoder för att generera hepatocyter från hPSCs gav oren cellpopulationer som innehåller både lever och icke-leverceller som, vid transplantation till gnagare, gav Ben och brosk förutom levervävnad15. Därför...

Syftet med detta protokoll är att effektivt differentiera humana pluripotenta stamceller (hPSCs) till anrikade populationer av lever buds stamledare och hepatocyte-liknande celler2. Tillgång till en färdig försörjning av mänskliga leverprogenitorer och hepatocyte-liknande celler kommer att påskynda arbetet med att undersöka leverfunktion och sjukdom och kan möjliggöra nya cellulära transplantations terapier för leversvikt3,4, 5. Detta har visat sig utmanande tidigare eftersom hPSCs (som omfattar embryonala och inducerade pluripotenta stamceller) kan differentiera till alla cell-typer av människokroppen; Följaktligen har det varit svårt att uteslutande särskilja dem till en ren population av en enda cell-typ, såsom leverceller6.
För att exakt differentiera hPSCs till leverceller, först är det viktigt att förstå inte bara hur leverceller specificeras utan också hur icke-lever cell-typer utvecklas. Kunskap om hur icke-leverceller utvecklas är viktigt att logiskt undertrycka bildandet av icke-lever linjer under differentiering, därmed uteslutande vägleda hPSCs mot en lever öde2. För det andra är det viktigt att avgränsa de flera utvecklings steg genom vilka hPSCs differentierar mot ett lever öde. Det är känt att hpscs sekventiellt differentieras till flera cell-typer som kallas primitiva Streak (APS), definitiva endoderm (de), posterior framtarmen (PFG) och lever bud progenitorer (lb) innan de bildar hepatocyte-liknande celler (HEP). Tidigare arbete avslöjade de signaler som specificerar levern öde och de signaler som undertryckt bildandet av alternativa icke-lever cell-typer (inklusive mage, bukspottkörtel, och intestinal progenitorer) vid varje utvecklingsmässiga Lineage val2, 7 , 8.
Kollektivt, dessa insikter har gett upphov till en serum-fri, enskiktslager metod för att differentiera hpscs mot primitiv strimma, definitiv endoderm, posterior foregut, lever bud progenitorer och slutligen, hepatocyte-liknande celler2. Sammantaget metoden innebär sådd av hpscs i en enskiktslager på en lämplig densitet, förbereda sex cocktails av differentiering media (som innehåller tillväxtfaktorer och små molekyler som reglerar olika utvecklings-signalering vägar), och sekventiellt lägga dessa medier för att inducera differentiering under loppet av 18 dagar. Under processen behövs ingen passaging av celler. Notera, eftersom denna metod uttryckligen omfattar signaler som hämmar bildandet av icke-lever cell-typer, denna differentiering metod1 mer effektivt genererar lever stamceller och hepatocyte-liknande celler i jämförelse med bevarade differentierings metoder2,9,10,11,12. Dessutom möjliggör det protokoll som beskrivs i denna text snabbare generering av hepatocyter som i slutändan uttrycker högre nivåer av levertranskriptionsfaktorer och enzymer än de som produceras av andra protokoll9,10 , elva , 12.
Det protokoll som beskrivs här har vissa fördelar jämfört med aktuella differentierings protokoll. För det första innebär det enskiktslager differentiering av hpscs, vilket är tekniskt enklare jämfört med tredimensionella differentiering metoder, såsom de som förlitar sig på embryoid organ13. För det andra utnyttjar denna metod ett senare förskott varigenom definitiva endoderm-celler (en tidig föregångare till leverceller) effektivt och snabbt kan genereras inom 2 dagar efter hpsc-differentiering på2,7, vilket möjliggör efterföljande produktion av hepatocyter med ökad renhet. För det tredje, i Side-by-side jämförelser, de hepatocyte-liknande celler som produceras av denna metod2 producerar mer albumin och uttrycker högre nivåer av levertranskriptionsfaktorer och enzymer jämfört med hepatocyter som produceras på andra metoder10, 11,12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >&#160;Geltrex</td>
			<td >Thermofisher Scientific</td>
			<td >A1569601</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1:1 DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.2&#160;&#956;m pore membrane filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GTTP02500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mTeSR1</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thiazovivin</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>3845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >&#160;Accutase</td>
			<td>Gibco or Millipore&#160;</td>
			<td>Gibco A11105, Millipore&#160; SCR005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >IMDM, GlutaMAX&#8482; Supplement</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>31980030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ham&#39;s F-12 Nutrient Mix, GlutaMAX&#8482; Supplement</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>31765035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >KOSR, Knockout serum replacement</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly(vinyl alcohol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;&#160;</td>
			<td>P8136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Transferrin&#160;</td>
			<td >Sigma-Aldrich&#160;&#160;</td>
			<td >10652202001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chemically Defined Lipid Concentrate</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td >11905031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >human Activin</td>
			<td >R&#38;D</td>
			<td>338-AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CHIR99201</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>4423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PI103</td>
			<td >Tocris</td>
			<td >2930/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >human FGF2</td>
			<td >R&#38;D</td>
			<td>233-FB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DM3189</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>6053/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >A83-01</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>2939/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Human BMP4</td>
			<td >R&#38;D</td>
			<td>314-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C59</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>5148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TTNPB</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>0761/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Forskolin</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>1099/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Oncostatin M</td>
			<td >R&#38;D</td>
			<td>295-OM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dexamethasone</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>1126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ro4929097</td>
			<td >Selleck Chem</td>
			<td>S1575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AA2P</td>
			<td>Cayman chemicals</td>
			<td>16457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >human recombinant Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;&#160;</td>
			<td>11061-68-0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient differentiation of human pluripotent stem cells into liver cells

Levern avgiftar skadliga ämnen, utsöndrar vitala proteiner, och utför viktiga metaboliska aktiviteter, vilket upprätthåller livet. Följaktligen, leversvikt — som kan orsakas av kronisk alkoholintag, hepatit, akut förgiftning, eller andra förolämpningar — är ett allvarligt tillstånd som kan kulminera i blödning, gulsot, koma, och så småningom döden. Emellertid, metoder för att behandla leversvikt, samt studier av leverfunktion och sjukdom, har varit omintetgörs delvis av avsaknaden av ett rikligt utbud av mänskliga leverceller. Detta protokoll specificerar därför en effektiv differentiering av humana pluripotenta stamceller (hPSCs) i hepatocyte-liknande celler, vägledda av en utvecklingsplan som beskriver hur lever ödet specificeras i sex på varandra följande differentierings steg. Genom att manipulera utvecklingsmässiga signalering vägar för att främja levern differentiering och att uttryckligen undertrycka bildandet av oönskade cell öden, denna metod genererar effektivt populationer av mänskliga leverbud stamceller och hepatocyte-liknande celler av dagar 6 respektive 18 i PSC-differentiering. Detta uppnås genom en temporally-exakt kontroll av utvecklingsmässiga signaleringsvägar, som utövas av små molekyler och tillväxtfaktorer i ett serumfritt odlingsmedium. Differentiering i detta system sker i enskiktslager och ger hepatocyte-liknande celler som uttrycker karakteristiska hepatocyte enzymer och har förmågan att att en musmodell av kronisk leversvikt. Förmågan att effektivt generera ett stort antal humana leverceller in vitro har förgreningar för behandling av leversvikt, för läkemedels screening, och för mekanistiska studier av leversjukdom.

Efter 24 h av APS differentiering, kolonier kommer i allmänhet att anta en annan morfologi än odifferentierade kolonier samtidigt med en förlust av den ljusa gränsen som typiskt uppställer hpsc kolonier. Morfologiskt, primitiva strimma celler har i allmänhet trasiga gränser och är mer spridda och mindre kompakta än hPSCs-detta är suggestivt av en epitelial-till-mesenkymala övergång som pluripotenta epiblast celler differentierar och tränger in i den primitiva streck in vivo. ...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells at JoVE.com

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Detta protokoll specificerar en monolayer, serum fri metod för att effektivt generera hepatocyte-liknande celler från humana pluripotenta stamceller (hPSCs) i 18 dagar. Detta innebär sex steg som hpscs sekventiellt differentieras till mellanliggande cell-typer såsom primitiva strimma, definitiva endoderm, posterior framtarmen och lever bud stamceller innan de bildar hepatocyte-liknande celler.

Effektiv differentiering av humana pluripotenta stamceller till leverceller

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Denna metod möjliggör generering av ett stort antal mänskliga levern bud progenitors och hepatocyte-liknande celler med hög renhet. Förmågan att generera dessa leverceller kan vara viktigt för regenerativ medicin och andra områden. Genom att kontrollera utvecklingsmässiga signalering vägar för att främja lever differentiering och undertrycka bildandet av oönskade celltyper, möjliggör denna metod effektiv generering av mänskliga leverns bud progenitors och hepatocyte-liknande celler med sex och 18 dagars differentiering respektive.Den största fördelen med denna teknik är den höga renheten hos de mänskliga leverceller som genereras. Till att vara detta förfarande, tillsätt 50 milliliter IMDM till en konisk kolv som innehåller en stir bar. Värm medium till 50 grader Celsius och tillsätt 0,5 gram PVA samtidigt kontinuerligt omrörning för att förbereda en PVA lager vid en koncentration av 10 milligram per milliliter.Efter detta tar du bort PVA-lösningen från värmedynan och låter den svalna till rumstemperatur. När lösningen är avkyld, filtrera den genom ett sterilt, 0,2 mikrometerfilter. Förbered CDM2 och CDM3 genom att kombinera den filtrerade PVA med andra reagenser som skisseras i tabell ett av textprotokollet.Använd ett sterilt, 0,2 mikrometerfilter för att filtrera alla medier. Sedan förbereder du återstående basmedia, CDM4 och CDM5, enligt skiss i tabell ett av textprotokollet. För att förbereda differentieringsmediet tina först de frusna små molekylerna och/eller tillväxtfaktorerna vid rumstemperatur.Alikvotera ut den erforderliga mängden basmedium och tillsätt de angivna små molekylerna och tillväxtfaktorerna till basmediet vid lämpliga koncentrationer. Dagen före användning, tina matrisen vid fyra grader Celsius. Nästa dag, späd matrisen vid ett förhållande av ett till 100 genom att lägga till 500 mikroliter matris i 50 milliliter kall DMEM.Pipettera den utspädda matrisen i erforderligt antal brunnar med hjälp av lagom volym lösning för att täcka ytan av brunnen. Överför den matrixbelagda plattan till en inkubator vid 37 grader Celsius i minst 60 minuter. Omedelbart före sådd aspirerar du den återstående matrislösningen från de belagda brunnarna.Sedan aspirera mediet från en till stor del sammanflytande hPSC kulturplatta och tillsätt kommersiellt köpt dissociation agent, se till att använda precis tillräckligt för att täcka den yta som cellerna växer. Inkubera hPSCs i dissociationmedlet vid 37 grader Celsius i fem minuter eller tills vissa kolonier börjar lossna. Därefter lägger du till DMEM och F-12 för att späda ut dissociationmedlet.Använd en fem milliliter serologisk pipet för att försiktigt pipettera upp och ner flera gånger för att tvätta bort alla celler från ytan av brunnen. Samla upp de återanvända enstaka cellerna i ett koniskt rör på 50 milliliter och späd ut med DMEM och F-12 efter behov. Centrifugera detta rör av insamlade hPSCs vid 350 gånger g och vid fyra grader Celsius i tre minuter för att pellet cellerna.I väntan på centrifugeringen aspirera du matrisen från plattan där hPSCs kommer att seedas. Lägg till en tillräcklig mängd mTeSR-media till mottagarväldarna för att täcka dem. När centrifugeringen är klar aspirera du noggrant supernatanten, och lämna de pelleterade hPSC:erna i botten av koniska röret.Resuspend cellpelleten i mTeSR som kompletteras med en mikromolar av kommersiellt-erhållas Thiazovivin. Med hjälp av en P1000-pipett triturteras försiktigt två till tre gånger för att jämnt återanvända cellpelleten till en enda cellupphängning. Omedelbart pipetter 10 mikroliter av cellupphängningen till en hemocytometer och räkna antalet celler.Justera volymen av de återanvända hPSCs med Thiazovivin-kompletterade mTeSR för att uppnå den önskade cellkoncentrationen för plätering. Sedan ska du skaka plattan i ett korsmönster flera gånger för att se till att cellerna är jämnt fördelade. Efter att hPSCs har varit pläterade i minst 24 timmar, använd ett faskontrastmikroskop för att kontrollera cellernas morfologi med specifik betoning på diametern på pläterade hPSC-kolonier.Därefter förbereder dag ett APS differentiering medium som beskrivs i tabell två i textprotokollet. En dag efter seedning, aspirera den Thiazovivin-kompletterade mTeSR från den pläterade hPSCs och kort tvätta dem med IMDM media. Efter detta, lägg dag ett medium till hPSCs.Spela in tiden och placera cellerna tillbaka in i inkubatorn vid 37 grader Celsius. Fortsätt med de efterföljande differentieringsstegen genom att förbereda det nödvändiga differentieringsmediet och lägga till det i cellerna på respektive differentieringsdagar runt samma tid på dagen. I denna studie, berikade populationer av levern bud progenitors och därefter hepatocyte-liknande celler genereras från hPSCs.Vid dag två av differentiering, primitiva strimma celler har differentierat till dag två definitiva endoderm celler. De allra flesta av dessa celler uttrycker SOX17 och FOXA2. Vid dag tre av differentiering har endodermcellerna differentierat in i foregut progenitors som syns polygonal i formar.Senare, vid dag sex, har de foregut progenitors differentieras till lever bud föregångare. Dessa lever bud progenitors uttrycka AFP, TPX3 och HNF4alpha. Över tre hPSC linjer, genererar denna metod dag sex AFP-positiva lever föregångare vid en effektivitet på cirka 89%Slutligen, efter 18 dagar av lever differentiering från HPSCs, albumin-positiva hepatocyte-liknande celler visas.Morfologiskt, dessa celler visas epitelial, bildar ljusa gränser som påminner om galla canaliculi. I detta skede, cytoplasman av dagen 18 hPSC-härledda hepatocyter verkar mörkare än kärnan. När sådd mänskliga pluripotenta stamceller för differentiering, är det absolut nödvändigt att så dem vid rätt densitet och även att fördela dem över brunnen genom att skaka plattan.Förmågan att producera mänskliga hepatocyter in vitro är en möjliggörande teknik som gör det möjligt för forskare att undersöka mekanismer som ligger bakom leverutveckling. Denna metod producerar ett stort antal mänskliga hepatocyter in vitro som skulle kunna användas för att undersöka leverfunktion och sjukdom och att så småningom möjliggöra nya terapier för leversvikt.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Regisserad differentiering av primitiv och slutgiltig hematopoetiska progenitorceller från mänskliga pluripotenta stamceller

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Effektiv Differentiering av pluripotenta stamceller till NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; Pankreasstamfäder

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In vitro-differentiering av mänskliga pluripotenta stamceller till trophoblastic celler

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Protocol for the Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mixed Cultures of Neurons and Glia for Neurotoxicity Testing

Protokoll för differentieringen av humant inducerade plöripotenta stamceller i blandade kulturer av neuroner och Glia för neurotoxicitetstestning

Human pluripotent stem cells can differentiate into various cell types that can be applied to human-based in vitro toxicity assays. One major advantage is ...

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

In Vitro Differentiering av humana mesenkymala stamceller till funktionella hjärtmuskelcellen-liknande celler

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Snabb, regisserad differentiering av Retinal Pigment epitelial celler från mänskliga embryonala eller inducerade pluripotenta stamceller

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Effektiv och skalbar riktad differentiering av kliniskt kompatibel korneal limbala epitelial stamceller från mänskliga pluripotenta stamceller

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro Generation av Somite derivat från mänskliga inducerade stamceller pluripotenta

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation

Övergående behandling av humana pluripotenta stamceller med DMSO för att främja differentiering

Despite the growing use of pluripotent stem cells (PSCs), challenges in efficiently differentiating embryonic and induced pluripotent stem cells (ESCs and ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

Effektiv neurala differentiering med hjälp av Single-cell kultur av mänskliga embryonala stamceller

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...