Name: efficient differentiation of human pluripotent stem cells into liver cells
Uploaded: 2019-06-11T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells at JoVE.com

Biz tartışmalar için Bing Lim için teşekkür ederiz ve Stanford kök hücre Biyoloji Enstitüsü & rejeneratif tıp altyapı desteği için. Bu çalışma California Enstitüsü rejeneratif tıp (DISC2-10679) ve Stanford-UC Berkeley Siebel kök hücre Enstitüsü (L.T.A. ve K.M.L.) ve Stanford Beckman merkezi moleküler ve genetik tıp yanı sıra Anonymous tarafından desteklenmektedir Baxter ve DiGenova aileleri (K.M.L.).

1. farklılaşma ortamının hazırlanması
Not: Kullanılan malzemeler ve reaktifler ile ilgili üretici bilgileri için malzeme tablosuna bakın.
<ol><li>
Baz kimyasal olarak tanımlanan medyanın hazırlanması (CDM) Not: CDM2, CDM3, CDM4 ve CDM5 çeşitli aşamalarında karaciğer hücreleri Için hPSCs ayırt etmek için temel Medias kullanılan kimyasal olarak tanımlanır ortam. Bu Medias bileşimi Tablo 1' de bulu...

<ol>
	<li>Bernal, W., Wendon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Liver+Failure.">Acute Liver Failure.</a> New England Journal of Medicine. 369, 2525-2534 (2013).</li><li>Ang, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Roadmap+for+Human+Liver+Differentiation+from+Pluripotent+Stem+Cells.">A Roadmap for Human Liver Differentiation from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Reports. 22, 2190-2205 (2018).</li><li>Fisher, R. A., Strom, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Hepatocyte+Transplantation:+Worldwide+Results.">Human Hepatocyte Transplantation: Worldwide Results.</a> Transplantation. 82, 441-449 (2006).</li><li>Dhawan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+human+hepatocyte+transplantation:+Current+status+and+challenges.">Clinical human hepatocyte transplantation: Current status and challenges.</a> Liver transplantation. 21, S39-S44 (2015).</li><li>Salama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+Hematopoietic+Stem+Cell+Transplantation+in+48+Patients+with+End-Stage+Chronic+Liver+Diseases.">Autologous Hematopoietic Stem Cell Transplantation in 48 Patients with End-Stage Chronic Liver Diseases.</a> Cell Transplantation. 19, 1475-1486 (2017).</li><li>Tan, A. K. Y., Loh, K. M., Ang, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+regenerative+potential+and+functionality+of+human+liver+cells+in+mice.">Evaluating the regenerative potential and functionality of human liver cells in mice.</a> Differentiation. 98, 25-34 (2017).</li><li>Loh, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Endoderm+Induction+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+by+Logically+Directing+Signals+Controlling+Lineage+Bifurcations.">Efficient Endoderm Induction from Human Pluripotent Stem Cells by Logically Directing Signals Controlling Lineage Bifurcations.</a> Cell Stem Cell. 14, 237-252 (2014).</li><li>Loh, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+Pairwise+Choices+Leading+from+Pluripotency+to+Human+Bone,+Heart,+and+Other+Mesoderm+Cell+Types.">Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types.</a> Cell. , 451-467 (2016).</li><li>Zhao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+the+efficient+metabolic+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+hepatocytes+by+correcting+specification+defects.">Promotion of the efficient metabolic maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes by correcting specification defects.</a> Cell Research. 23, 157-161 (2012).</li><li>Si Tayeb, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+generation+of+human+hepatocyte-like+cells+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells.</a> Hepatology. 51, 297-305 (2010).</li><li>Carpentier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+in+miniaturized+format+suitable+for+high-throughput+screen.">Hepatic differentiation of human pluripotent stem cells in miniaturized format suitable for high-throughput screen.</a> Stem Cell Research. 16, 640-650 (2016).</li><li>Avior, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial-derived+lithocholic+acid+and+vitamin+K2+drive+the+metabolic+maturation+of+pluripotent+stem+cells-derived+and+fetal+hepatocytes.">Microbial-derived lithocholic acid and vitamin K2 drive the metabolic maturation of pluripotent stem cells-derived and fetal hepatocytes.</a> Hepatology. 62, 265-278 (2015).</li><li>Ogawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+and+cAMP+signaling+promote+the+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+hepatocytes.">Three-dimensional culture and cAMP signaling promote the maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes.</a> Development. 140, 3285-3296 (2013).</li><li>Rostovskaya, M., Bredenkamp, N., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+consistent+generation+of+pancreatic+lineage+progenitors+from+human+pluripotent+stem+cells.">Towards consistent generation of pancreatic lineage progenitors from human pluripotent stem cells.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 370, 20140365 (2015).</li><li>Haridass, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repopulation+Efficiencies+of+Adult+Hepatocytes,+Fetal+Liver+Progenitor+Cells,+and+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Hepatic+Cells+in+Albumin-Promoter-Enhancer+Urokinase-Type+Plasminogen+Activator+Mice.">Repopulation Efficiencies of Adult Hepatocytes, Fetal Liver Progenitor Cells, and Embryonic Stem Cell-Derived Hepatic Cells in Albumin-Promoter-Enhancer Urokinase-Type Plasminogen Activator Mice.</a> The American Journal of Pathology. 175, 1483-1492 (2009).</li></ol>

Bu yöntem, karaciğer tomurcuk progenitors zenginleştirilmiş nüfus üretimi sağlar ve daha sonra hepatosit benzeri hücreler, hPSCs dan. İnsan karaciğer hücrelerinin zenginleştirilmiş nüfus oluşturmak için yeteneği bu tür hücrelerin pratik kullanımı için önemlidir. Önceki yöntemler hPSCs gelen hepatositler üretmek için karaciğer ve non-karaciğer hücreleri hem de içeren ezik hücre nüfus sağladı, kemirgenler içine transplantasyon üzerine, karaciğer dokusu ek olarak kemik ve kıkırdak ver...

Bu protokol amacı verimli insan pluripotent kök hücreleri ayırt etmektir (hpscs) karaciğer tomurcuk ataları ve hepatosit benzeri hücrelerin zenginleştirilmiş nüfus2. İnsan karaciğer ataları ve hepatosit benzeri hücreler hazır bir tedarik erişim karaciğer fonksiyon ve hastalık araştırmak için çabaları hızlandıracak ve karaciğer yetmezliği için yeni hücresel transplantasyon terapileri olanaklı hale gelebilir3,4, 5' i yapın. Bu hPSCs beri geçmişte zorlu kanıtlanmış (hangi embriyonik ve indüklenen pluripotent kök hücreleri dahil) insan vücudunun tüm hücre türlerine ayırt edebilirsiniz; Sonuç olarak, onları sadece tek bir hücre tipi saf bir nüfus içine ayırt etmek zor olmuştur, karaciğer hücreleri gibi6.
HPSCs 'i karaciğer hücrelerine tam olarak ayırt etmek için, ilk olarak karaciğer hücrelerinin sadece nasıl belirlenmesini değil, karaciğer hücresi türlerinin nasıl geliştiği de anlaşılması önemlidir. Nasıl non-karaciğer hücrelerinin geliştirmek bilgi mantıksal olarak farklılaşma sırasında karaciğer olmayan sırların oluşumunu bastırmak için önemlidir, böylece sadece bir karaciğer kader2doğru hpscs rehberlik. İkincisi, hPSCs bir karaciğer kaderi ayırt hangi aracılığıyla birden fazla gelişimsel adımları tanımlamak için esastır. Bu hpscs sırayla ilkel çizgi (APS), kesin endoderm (de), posterior foregut (PFG) ve karaciğer tomurcuk ataları (lb) olarak bilinen birden çok hücre türleri farklılaştırarak hepatosit benzeri hücreler (hep) şekillendirmeden önce bilinmektedir. Önceki çalışma, karaciğer kaderi ve diğer non-karaciğer hücre türleri (mide, pankreatik ve bağırsak progenitors dahil) oluşumunu bastırdı sinyalleri belirterek sinyalleri ortaya her gelişimsel soy seçim2, 7 , 8' den itibaren.
Toplu olarak, bu Öngörüler ilkel çizgi, kesin endoderm, posterior foregut, karaciğer tomurcuk ataları ve son olarak, hepatosit benzeri hücreler2hpscs ayırt etmek için bir serum-ücretsiz, tek tabakalı yöntemi yükselmişti. Genel yöntem, uygun bir yoğunlukta bir tek tabakalı hpscs tohumlama içerir, farklılaşma medya altı kokteyl hazırlanıyor (büyüme faktörleri ve çeşitli gelişimsel sinyalizasyon yollarını düzenleyen küçük molekülleri içeren), ve ardışık olarak 18 gün boyunca farklılaşma neden bu medyayı ekleyerek. Süreç boyunca, hücrelerin hiçbir geçiş gereklidir. Not, çünkü bu yöntem açıkça olmayan karaciğer hücre türleri oluşumunu bastırmak sinyalleri içerir, bu farklılaşma yaklaşımı1 daha verimli karaciğer ataları ve hepatosit gibi hücreler genişletici karşılaştırıldığında üretir farklılaşma yöntemleri2,9,10,11,12. Ayrıca, bu metinde açıklanan protokol, hepatik transkripsiyon faktörleri ve enzimlerin diğer protokoller tarafından üretilenden daha yüksek seviyelerde olduğunu ifade eden hepatositlerin daha hızlı oluşumunu sağlar9,10 , 11 ' i , 12' ye kadar.
Burada açıklanan protokol mevcut farklılaşma protokolleri üzerinde bazı avantajları vardır. İlk olarak, üç boyutlu farklılaşma yöntemleri ile karşılaştırıldığında Teknik olarak daha basit olan hpscs Tek tabakalı farklılaşma gerektirir, gibi embriyoid organları güvenenler gibi13. İkinci olarak, bu yöntem son bir avans bu nedenle kesin endoderm hücreleri (karaciğer hücrelerine erken bir ön) verimli ve hızlı bir şekilde 2 gün içinde HPSC farklılaşma2,7içinde oluşturulan olabilir, böylece sonraki etkinleştirme artan saflık ile hepatosit üretimi. Üçüncü olarak, yan yana karşılaştırmalar, bu yöntem tarafından üretilen hepatosit benzeri hücreler2 daha fazla albumin üretmek ve hepatik transkripsiyon faktörleri ve enzimlerin diğer yöntemlerle üretilen hepatositlere kıyasla daha yüksek düzeyde ifade10, 11,12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >&#160;Geltrex</td>
			<td >Thermofisher Scientific</td>
			<td >A1569601</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1:1 DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.2&#160;&#956;m pore membrane filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GTTP02500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mTeSR1</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thiazovivin</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>3845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >&#160;Accutase</td>
			<td>Gibco or Millipore&#160;</td>
			<td>Gibco A11105, Millipore&#160; SCR005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >IMDM, GlutaMAX&#8482; Supplement</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>31980030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ham&#39;s F-12 Nutrient Mix, GlutaMAX&#8482; Supplement</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>31765035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >KOSR, Knockout serum replacement</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly(vinyl alcohol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;&#160;</td>
			<td>P8136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Transferrin&#160;</td>
			<td >Sigma-Aldrich&#160;&#160;</td>
			<td >10652202001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chemically Defined Lipid Concentrate</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td >11905031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >human Activin</td>
			<td >R&#38;D</td>
			<td>338-AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CHIR99201</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>4423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PI103</td>
			<td >Tocris</td>
			<td >2930/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >human FGF2</td>
			<td >R&#38;D</td>
			<td>233-FB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DM3189</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>6053/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >A83-01</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>2939/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Human BMP4</td>
			<td >R&#38;D</td>
			<td>314-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C59</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>5148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TTNPB</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>0761/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Forskolin</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>1099/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Oncostatin M</td>
			<td >R&#38;D</td>
			<td>295-OM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dexamethasone</td>
			<td >Tocris</td>
			<td>1126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ro4929097</td>
			<td >Selleck Chem</td>
			<td>S1575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AA2P</td>
			<td>Cayman chemicals</td>
			<td>16457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >human recombinant Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;&#160;</td>
			<td>11061-68-0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient differentiation of human pluripotent stem cells into liver cells

Karaciğer zararlı maddeleri detoxifies, hayati proteinleri salgıları ve önemli metabolik faaliyetleri yürütür, böylece yaşam sürdürüyor. Sonuç olarak, karaciğer yetmezliği-kronik alkol alımı, Hepatit, akut zehirlenme veya diğer hakaret neden olabilir-kanama, sarılık, koma ve sonunda ölüm sonuçlanabilir ciddi bir durumdur. Ancak, karaciğer yetmezliği tedavisinde yaklaşımlar, yanı sıra karaciğer fonksiyon ve hastalığın çalışmaları, insan karaciğer hücrelerinin bol tedarik eksikliği kısmen stymied olmuştur. Bu amaçla, bu protokol insan pluripotent kök hücrelerinin (hPSCs), karaciğer kaderi altı ardışık farklılaşma adımları boyunca nasıl belirtildiğini açıklayan bir gelişimsel yol haritası tarafından yönlendirilen hepatosit benzeri hücrelere verimli farklılaşma ayrıntıları. Karaciğer farklılaşma teşvik ve açıkça istenmeyen hücre kaderlerinin oluşumunu bastırmak için gelişimsel sinyal yolları manipüle ederek, bu yöntem verimli insan karaciğer tomurcuk ataları ve hepatosit benzeri hücrelerin nüfusu üretir gün 6 ve 18 PSC farklılaşma, sırasıyla. Bu, küçük moleküller ve büyüme faktörleri tarafından serum içermeyen bir kültür ortamında uygulanan, gelişimsel sinyalizasyon yollarının geçici olarak hassas kontrolü yoluyla elde edilir. Bu sistemde farklılaşma monolayers oluşur ve karakteristik hepatosit enzimleri ifade ve kronik karaciğer yetmezliği bir fare modeli erit yeteneğine sahip hepatosit benzeri hücreler verir. Verimli bir şekilde insan karaciğer hücrelerinin çok sayıda üretmek için yetenek karaciğer yetmezliği tedavisi için etkileri vardır, ilaç taraması için, ve karaciğer hastalığının mekanik çalışmalar için.

APS farklılaşma 24 h sonra, koloniler genellikle hPSC kolonileri circumscribes parlak sınır kaybı ile uyumlu farklılaşmış koloniler daha farklı bir morfoloji benimsemeye olacaktır. Morfolojik, ilkel çizgi hücreleri genellikle düzensiz sınırları var ve daha Spread ve hPSCs daha az kompakt-bu pluripotent epiblast hücreleri ayırt ve ilkel içine giriþ olarak epitelyal-mesenkimal geçiş uyarılıdır çizgi in vivo. Farklılaşma öncesinde hPSCs kolonisi boyutu çok büy...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells at JoVE.com

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Bu protokol, 18 gün içinde insan pluripotent kök hücrelerinden (hPSCs) hepatosit benzeri hücreleri verimli bir şekilde üretmek için bir monolayer, serum içermeyen bir yöntem ayrıntıları. Bu hpscs sırayla ilkel çizgi, kesin endoderm, posterior foregut ve karaciğer tomurcuk ataları hepatosit benzeri hücreler oluşturmadan önce gibi ara hücre türlerine ayırt olarak altı adım gerektirir.

Insan pluripotent kök hücrelerinin karaciğer hücrelerine verimli farklılaşma

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Bu yöntem, yüksek saflıkta insan karaciğer tomurcuk ataları ve hepatosit benzeri hücrelerin çok sayıda nesil sağlar. Yeteneği bu karaciğer hücreleri oluşturmak için rejeneratif tıp ve diğer alanlar için önemli olabilir. Karaciğer farklılaşmasını teşvik etmek ve istenmeyen hücre tiplerinin oluşumunu bastırmak için gelişimsel sinyal yollarını kontrol ederek, bu yöntem insan karaciğer tomurcuk ataları ve hepatosit benzeri hücrelerin verimli bir şekilde altı ve 18 gün farklılaşma ile lenmesini sağlar.Bu tekniğin en büyük avantajı üretilen insan karaciğer hücrelerinin yüksek saflıkta olmasıdır. Bu yordam olmak için, bir karıştırma çubuğu içeren konik bir şişe için IMDM 50 mililitre ekleyin. Orta sıcaklığı 50 dereceye ısıtın ve mililitre başına 10 miligram konsantrasyonda pva stoku hazırlamak için sürekli karıştırarak 0,5 gram PVA ekleyin.Bundan sonra, PVA çözeltisini ısıtma yastığından çıkarın ve oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. Çözelti soğuduktan sonra steril, 0,2 mikrometrefiltreden geçirin. Filtre uygulanmış PVA'yı metin protokolünden birinci tabloda belirtildiği gibi diğer reaktiflerle birleştirerek CDM2 ve CDM3'ü hazırlayın.Tüm ortamları filtrelemek için steril, 0,2 mikrometre filtre kullanın. Ardından, metin protokolünün tablo birinci tablosunda belirtildiği gibi kalan temel ortamı, CDM4 ve CDM5'i hazırlayın. Farklılaşma ortamını hazırlamak için önce donmuş küçük molekülleri ve/veya büyüme faktörlerini oda sıcaklığında eritin.Aliquot gerekli miktarda baz orta dışarı ve uygun konsantrasyonlarda baz orta belirtilen küçük moleküller ve büyüme faktörleri ekleyin. Kullanımdan bir gün önce matrisi dört santigrat derecede eritin. Ertesi gün, 50 mililitre soğuk DMEM'e 500 mikrolitre matris ekleyerek matrisi 1'den 100'e kadar seyreltin.Pipet kuyu yüzeyini kapsayacak kadar çözelti hacmi kullanarak kuyuların gerekli sayıda içine seyreltilmiş matris. Matris kaplı plakayı en az 60 dakika boyunca 37 derecede bir kuvöze aktarın. Tohumlamadan hemen önce, kaplamalı kuyulardan kalan matris çözeltisini aspire edin.Daha sonra, büyük ölçüde confluent hPSC kültür plakası orta aspire ve ticari olarak satın ayrışma ajanı ekleyin, hücrelerin büyümekte olduğu yüzeyi kapsayacak kadar kullandığınızdan emin olun. Ayrıştırma ajanındaki hPSC'leri 5 dakika veya bazı koloniler ayrışmaya başlayana kadar 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Ardından, dissosiasyon aracısını seyreltmek için DMEM ve F-12 ekleyin.Kuyunun yüzeyindeki tüm hücreleri yıkamak için yavaşça yukarı ve aşağı birden çok kez pipet için beş mililitrelik serolojik pipet kullanın. 50 mililitrelik konik bir tüp içinde resuspended tek hücreleri toplamak ve gerektiğinde DMEM ve F-12 ile seyreltin. 350 kez g ve dört derece santigrat üç dakika boyunca hücreleri pelet toplanan hPSCs bu tüp santrifüj.Santrifüj beklerken, hPSC'lerin tohumlaşacağı plakadan matrisi aspire edin. Alıcı kuyularına bunları kapsayacak kadar yeterli miktarda mTeSR ortam ekleyin. Santrifüj tamamlandığında, konik tüpün altında peletli hPSC'ler bırakarak, dikkatle supernatant aspire.MTeSR hücre pelet resuspend ticari elde Tiyazzovivin bir mikromolar ile takviye. P1000 pipet kullanarak, hücre peletini tek bir hücre süspansiyonuna eşit olarak yeniden askıya almak için 2-3 kez hafifçe triturate. Hemen pipet 10 mikrolitre hücre süspansiyonu hemositometreye ve hücre sayısını sayar.Kaplama için istenilen hücre konsantrasyonuna ulaşmak için Thiazovivin destekli mTeSR ile yeniden askıya alınan hPSC'lerin hacmini ayarlayın. Daha sonra, hücrelerin eşit olarak dağıtıldıkemin için bir çapraz desen plaka birkaç kez sallayın. HPSC'ler en az 24 saat boyunca kaplandıktan sonra, kaplanmış hPSC kolonilerinin çapına özel önem vererek hücrelerin morfolojisini kontrol etmek için faz kontrastmikroskobu kullanın.Ardından, metin protokolünün ikinci tablosunda belirtildiği gibi, birinci gün APS farklılaştırma ortamını hazırlayın. Tohumlamadan bir gün sonra, kaplamalı hPSC'lerden Thiazovivin destekli mTeSR'yi aspire edin ve kısaca IMDM ortamla yıkayın. Bundan sonra, hPSCs için gün bir orta ekleyin.Zamanı kaydedin ve hücreleri 37 derecede kuvöze geri yerleştirin. Gerekli farklılaşma ortamını hazırlayarak ve günün aynı saatinde farklılaşmanın ilgili günlerinde hücrelere ekleyerek sonraki farklılaşma adımlarına devam edin. Bu çalışmada, karaciğer tomurcuk atalarının zenginleştirilmiş popülasyonları ve daha sonra hepatosit benzeri hücreler hPSC'lerden üretilmiştir.Farklılaşmanın ikinci gününde, ilkel çizgi hücreleri ikinci güne kesin endoderm hücrelerine farklılaşmıştır. Bu hücrelerin büyük çoğunluğu SOX17 ve FOXA2 ifade. Diferansiyasyonun üçüncü gününde, endoderm hücreleri çokgen şeklinde görünen foregut atalarına dönüşmüştür.Daha sonra, altıncı gün, foregut ataları karaciğer tomurcuk ataları içine farklılaşmış. Bu karaciğer tomurcuk ataları AFP ifade, TPX3, ve HNF4alpha. Üç hPSC hatları arasında, Bu yöntem yaklaşık% 89 bir verimlilikle gün altı AFP-pozitif karaciğer ataları oluşturur Son olarak, hPSCs karaciğer farklılaşması 18 gün sonra, albumin-pozitif hepatosit benzeri hücreler görünür.Morfolojik olarak, bu hücreler epitel görünür, safra canaliculi anımsatan parlak sınırları oluşturan. Bu aşamada, günün sitoplazması 18 hPSC kaynaklı hepatositler çekirdekten daha koyu görünür. Diferansiye için insan pluripotent kök hücreleri tohumlama zaman, doğru yoğunlukta tohum ve aynı zamanda plaka sallayarak kuyu boyunca dağıtmak için zorunludur.İnsan hepatositleri in vitro üretme yeteneği, bilim adamlarının karaciğer gelişiminin altında yatan mekanizmaları araştırmalarına olanak tanıyan bir teknolojidir. Bu yöntem, karaciğer fonksiyon unu ve hastalığı araştırmak ve sonunda karaciğer yetmezliği için yeni tedaviler sağlamak için kullanılabilecek in vitro insan hepatositleri çok sayıda üretir.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

İlkel ve kesin hematopoetik ataları insan Pluripotent kök hücrelerden farklılaşma yönetmen

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Pluripotent Verimli Farklılaşma NKX6-1 için Kök Hücreler<sup&gt; +</sup&gt; Pankreas Progenitörler

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Insan pluripotent İn Vitro Farklılaşma Trofoblastik Hücreleri içine Kök Hücreler

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Protocol for the Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mixed Cultures of Neurons and Glia for Neurotoxicity Testing

Nörotoksisite Testi İçin İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Nöronlar ve Glia Karışık Kültürlerine Ayrıştırılması Protokolü

Human pluripotent stem cells can differentiate into various cell types that can be applied to human-based in vitro toxicity assays. One major advantage is ...

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

Vitro İnsan Mezenkimal Kök hücre farklılaşma fonksiyonel Cardiomyocyte benzeri hücre içine

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Hızlı, yönlendirilmiş farklılaşma insan embriyonik veya İndüklenmiş Pluripotent kök hücrelerinden retina Pigment epitel hücrelerinin

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Verimli ve ölçeklenebilir yönlendirilmiş farklılaşma klinik olarak uyumlu kornea Limbal epitel kök hücrelerden insan Pluripotent kök hücreler

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Somite türevleri indüklenen insan nesil Vitro Pluripotent kök hücreler

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation

Insan pluripotent kök hücrelerinin DMSO ile geçici tedavisi farklılaşma teşvik etmek

Despite the growing use of pluripotent stem cells (PSCs), challenges in efficiently differentiating embryonic and induced pluripotent stem cells (ESCs and ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinin Tek Hücre Kültürünü Kullanarak Etkin Nöral Farklılaşma

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...