Name: quantitative examination of antibiotic susceptibility of neisseria gonorrhoeae aggregates using atp-utilization commercial assays and live/dead staining
Uploaded: 2019-02-08T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining at Jo

Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra National Institute of Health D.C.S. og WS AI123340. L.-C.W., J.W., A.C., og E.N. blev støttet i del/deltage i "Den første års Innovation & forskning Experience" program finansieret af University of Maryland. Finansieringskilderne spillede ingen rolle i undersøgelse design, dataindsamling og analyse, beslutningen om at offentliggøre eller forberedelse af manuskriptet. Vi anerkender UMD CBMG Imaging kernen for alle mikroskopi eksperimenter.

1. generel vedligeholdelse af GC stammer
<ol><li>Streak N. gonorrhoeae stammer på GCK agar med 1% Kellogg kosttilskud18 (tabel 1, tabel 2) fra fryseren bestande og inkuberes 37 ° C med 5% CO2 til 16-18 h. Brug MS11 udtrykker fase-variabel Opa (MS11Opa +), ingen Opa (MS11ΔOpa), eller en afkortet LOS (MS11ΔLgtE).</li>
	<li>Omhyggeligt vælge pili negative (koloni uden mørk kant) eller positiv (koloni med mørk kant) kolonier fra hver stamme baseret på kol...

<ol>
	<li>den Heijer, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+overview+of+urogenital,+anorectal+and+oropharyngeal+Neisseria+gonorrhoeae+testing+and+diagnoses+among+different+STI+care+providers:+a+cross-sectional+study.">A comprehensive overview of urogenital, anorectal and oropharyngeal Neisseria gonorrhoeae testing and diagnoses among different STI care providers: a cross-sectional study.</a> BMC Infectious Diseases. 17 (1), (2017).</li><li>Hein, K., Marks, A., Cohen, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymptomatic+gonorrhea:+prevalence+in+a+population+of+urban+adolescents.">Asymptomatic gonorrhea: prevalence in a population of urban adolescents.</a> The Journal of Pediatrics. 90 (4), 634-635 (1977).</li><li>Hananta, I. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gonorrhea+in+Indonesia:+High+Prevalence+of+Asymptomatic+Urogenital+Gonorrhea+but+No+Circulating+Extended+Spectrum+Cephalosporins-Resistant+Neisseria+gonorrhoeae+Strains+in+Jakarta,+Yogyakarta,+and+Denpasar,+Indonesia.">Gonorrhea in Indonesia: High Prevalence of Asymptomatic Urogenital Gonorrhea but No Circulating Extended Spectrum Cephalosporins-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strains in Jakarta, Yogyakarta, and Denpasar, Indonesia.</a> Sexually Transmitted Diseases. 43 (10), 608-616 (2016).</li><li>Chlamydia, W. H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlamydia+trachomatis,+Neisseria+gonorrhoeae,+syphilis+and+Trichomonas+vaginalis.+Methods+and+results+used+by+WHO+to+generate+2005+estimates.+World+Health+Organisation,+2011.+Prevalence+and+incidence+of+selected+sexually+transmitted+infections.">Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, syphilis and Trichomonas vaginalis. Methods and results used by WHO to generate 2005 estimates. World Health Organisation, 2011. Prevalence and incidence of selected sexually transmitted infections.</a> World Health Organisation. , (2011).</li><li>Mayor, M. T., Roett, M. A., Uduhiri, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+management+of+gonococcal+infections.">Diagnosis and management of gonococcal infections.</a> American Family Physician. 86 (10), 931-938 (2012).</li><li>Alirol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidrug-resistant+gonorrhea:+A+research+and+development+roadmap+to+discover+new+medicines.">Multidrug-resistant gonorrhea: A research and development roadmap to discover new medicines.</a> PLOS Medicine. 14 (7), (2017).</li><li>Workowski, K. A., Bolan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexually+transmitted+diseases+treatment+guidelines,+2015.">Sexually transmitted diseases treatment guidelines, 2015.</a> MMWR Recommendations and Reports. 64, 1-137 (2015).</li><li>Lahra, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+Recognition+of+Internationally+Disseminated+Ceftriaxone-Resistant+Neisseria+gonorrhoeae+Strain.">Cooperative Recognition of Internationally Disseminated Ceftriaxone-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strain.</a> Emerging Infectious Diseases. 24 (4), (2018).</li><li>Wi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+resistance+in+Neisseria+gonorrhoeae:+Global+surveillance+and+a+call+for+international+collaborative+action.">Antimicrobial resistance in Neisseria gonorrhoeae: Global surveillance and a call for international collaborative action.</a> PLOS Medicine. 14 (7), 1002344 (2017).</li><li>Singh, S., Singh, S. K., Chowdhury, I., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+Mechanism+of+Bacterial+Biofilms+Resistance+to+Antimicrobial+Agents.">Understanding the Mechanism of Bacterial Biofilms Resistance to Antimicrobial Agents.</a> Open Microbiology Journal. 11, 53-62 (2017).</li><li>Greiner, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+Formation+by+Neisseria+gonorrhoeae.">Biofilm Formation by Neisseria gonorrhoeae.</a> Infection and Immunity. 73 (4), 1964-1970 (2005).</li><li>Zollner, R., Oldewurtel, E. R., Kouzel, N., Maier, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+and+antigenic+variation+govern+competition+dynamics+through+positioning+in+bacterial+colonies.">Phase and antigenic variation govern competition dynamics through positioning in bacterial colonies.</a> Scientific Reports. 7 (1), (2017).</li><li>Stein, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Opacity+Proteins+Interferes+with+the+Transmigration+of+Neisseria+gonorrhoeae.+across+Polarized+Epithelial+Cells.">Expression of Opacity Proteins Interferes with the Transmigration of Neisseria gonorrhoeae. across Polarized Epithelial Cells.</a> PLoS One. 10 (8), 0134342 (2015).</li><li>LeVan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+a+derivative+of+Neisseria+gonorrhoeae+strain+MS11+devoid+of+all+opa+genes.">Construction and characterization of a derivative of Neisseria gonorrhoeae strain MS11 devoid of all opa genes.</a> Journal of Bacteriology. 194 (23), 6468-6478 (2012).</li><li>Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+and+analyzing+static+biofilms.">Growing and analyzing static biofilms.</a> Curr Protoc Microbiol. , (2005).</li><li>Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+multiple+methods+for+quantification+of+microbial+biofilms+grown+in+microtiter+plates.">Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates.</a> Journal of Microbiological Methods. 72 (2), 157-165 (2008).</li><li>White, L. A., Kellogg, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neisseria+Gonorrhoeae+Identification+in+Direct+Smears+by+a+Fluorescent+Antibody-Counterstain+Method.">Neisseria Gonorrhoeae Identification in Direct Smears by a Fluorescent Antibody-Counterstain Method.</a> Journal of Applied Microbiology. 13, 171-174 (1965).</li><li>Swanson, J., Kraus, S. J., Gotschlich, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+gonococcus+infection.+I.+Pili+and+zones+of+adhesion:+their+relation+to+gonococcal+growth+patterns.">Studies on gonococcus infection. I. Pili and zones of adhesion: their relation to gonococcal growth patterns.</a> Journal of Experimental Medicine. 134 (4), 886-906 (1971).</li><li>Herten, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+in+Vitro+Quantification+of+S.+aureus+Biofilms+on+Vascular+Graft+Surfaces.">Rapid in Vitro Quantification of S. aureus Biofilms on Vascular Graft Surfaces.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 2333 (2017).</li><li>Gracia, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+development+of+Staphylococcus+aureus+biofilms+using+slime-producing+variants+and+ATP-bioluminescence+for+automated+bacterial+quantification.">In vitro development of Staphylococcus aureus biofilms using slime-producing variants and ATP-bioluminescence for automated bacterial quantification.</a> Luminescence. 14 (1), 23-31 (1999).</li><li>Webb, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+development.">Cell death in Pseudomonas aeruginosa biofilm development.</a> Journal of Bacteriology. 185 (15), 4585-4592 (2003).</li><li>Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+biofilm+formation+in+an+8-well+chamber+slide.">In vitro biofilm formation in an 8-well chamber slide.</a> Journal of visualized experiments. (47), (2011).</li><li>Wang, L. C., Litwin, M., Sahiholnasab, Z., Song, W., Stein, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neisseria+gonorrhoeae+Aggregation+Reduces+Its+Ceftriaxone+Susceptibility.">Neisseria gonorrhoeae Aggregation Reduces Its Ceftriaxone Susceptibility.</a> Antibiotics (Basel). 7 (2), (2018).</li><li>Lebeaux, D., Ghigo, J. M., Beloin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm-related+infections:+bridging+the+gap+between+clinical+management+and+fundamental+aspects+of+recalcitrance+toward+antibiotics.">Biofilm-related infections: bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 510-543 (2014).</li><li>Hall-Stoodley, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+diagnostic+guidelines+for+biofilm-associated+infections.">Towards diagnostic guidelines for biofilm-associated infections.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 65 (2), 127-145 (2012).</li></ol>

Bakterier kan danne biofilm under infektion af det menneskelige legeme. Traditionelle MIC test kan ikke afspejle den koncentration, der er nødvendige for at udrydde bakterier i en biofilm. For at teste antimikrobielle virkninger på en biofilm, kan metoder baseret på biofilm biomasse samt plating CFUs være forkert på grund af virkningen af biofilm struktur. For eksempel, virker plating metode kun hvis biofilm kan være afbrudt. Derfor, CFU fremstillet kan være lavere end det faktiske antal levedygtige bakterier. Vis...

Gonoré er et fælles seksuelt overført infektion (TSI)1. Neisseria gonorrhoeae (GC), en Gram-negative diplococcal bakterie, er den udløsende agens af denne sygdom. Symptomerne på genital infektion kan resultere i smerter under vandladning, generaliseret genital smerte og urethrae udledning. Infektionen er ofte asymptomatisk2,3,4,5, og dette giver mulighed for udvidede kolonisering. Disse ubehandlede infektioner er en større sundhedsmæssig bekymring, som de har potentiale til at lette transmission af organismen, og dette kan føre til komplikationer såsom bækkenbetændelse (PID) og formidlet gonococcal infektion (DGI)6. Antibiotikaresistente gonoré er en større folkesundhedskrise og en øget samfundsøkonomisk byrde7. Reduceret følsomhed over for cefalosporiner har resulteret i behandling Régimen ændring fra et enkelt antibiotikum dual therapy, som kombinerer azithromycin eller doxycyklin med ceftriaxon8. Ceftriaxon og azithromycin9,10, i kombination med asymptomatiske infektioner, øget fiasko understreger behovet for forståelse gonoré behandling fiaskoer.
Den mindste hæmmende koncentration (MIC) test, herunder agar fortynding og disc diffusion tests, har været brugt som standard medicinsk test for at identificere resistens over for et antibiotikum. Det er dog uklart, om MIC test afspejler bakteriel antibiotikaresistens in vivo. Dannelsen af bakterielle biofilm bidrager til overlevelse af bakterier i nærværelse af bakteriedræbende koncentrationer af antibiotikum: mikrofon test er i stand til at opdage denne effekt11. Fordi GC kan danner biofilm på slimhindeinfektioner12, vi hypotesen, at antibiotikum modtagelighed i aggregater ville være forskellige fra, ses i enkelte GC. Desuden, har undersøgelser vist at trefaset variable overflade molekyler, Pili, opacitet-forbundet protein (Opa), og lipooligosaccharides (LOS), at regulerer Inter bakterie interaktioner, føre til forskellige størrelse aggregater13, 14 , 15. bidrag af disse komponenter til antibiotikaresistens er ikke blevet undersøgt på grund af manglen på ordentlig metoder.
I øjeblikket, er der flere metoder til at måle biofilm udryddelse. Den mest udbredte kvantitative metode er ved at måle ændringer i biomasse ved hjælp af krystalviolet farvning16. Metoden kræver imidlertid betydelig eksperimentelle manipulation, der potentielt kan generere fejl i eksperimentet gentager17. Live/døde farvnings-metoden bruges her giver mulighed for visualisering af levende og døde bakterier og deres fordeling i biofilm. Dog kan biofilm struktur optræde som en fysisk barriere, der reducerer farvestof penetration. Derfor, for at kvantificere live/døde bakterier inden for en gruppe, farvning er begrænset til små biofilm eller dens forløber-microcolonies eller sammenlægninger. Andre metoder, herunder agar fortynding og disc diffusion-testene er ikke i stand til at måle virkningerne af sammenlægning. At undersøge GC modtagelighed inden for sammenlægning efter antibiotisk eksponering, en ideel metode ville har brug for at have både en kvantitativ analyse, der kan måle live bakterier og visualisere deres distribution.
Proceduren beskrevet her kombinerer en ATP-udnyttelse måling og en live/døde farvning assay til kvantitativt og visuelt undersøge GC modtagelighed i aggregater under tilstedeværelse af antibiotika.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:837px;" width="837">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">100x Kellogg&#39;s supplement</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Agar</td>
			<td style="width:229px;">United States Biological</td>
			<td style="width:119px;">A0930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">BacTiter Assay&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">G8232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Ceftriaxone</td>
			<td style="width:229px;">TCI</td>
			<td style="width:119px;">C2226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Difco GC medium base&#160;</td>
			<td style="width:229px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">228950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ferric nitrate, nonahydrate&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">254223-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td style="width:229px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP350-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine Crystalline Powder</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP379-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BacLight live/dead staining</td>
			<td style="width:229px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">L7012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MS11 Neisseria gonorrhoeae strain</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>kindly provided by Dr. Herman Schneider, Walter Reed Army Institute for Research</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:323px;">Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P290-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP329-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteose Peptone&#160;</td>
			<td style="width:229px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">211693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S671-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Soluble Starch</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S9765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thiamine pyrophosphate</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C8754-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Equipment</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Petri Dishes</td>
			<td style="width:229px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">25384-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">8-well coverslip-bottom chamber&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">155411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well tissue culture plates&#160;</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td style="width:119px;">3370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:323px;">Biosafety Cabinet (NU-425-600 Class II, A2 Laminar Flow Biohazard Hood)</td>
			<td style="width:229px;">Nuaire</td>
			<td style="width:119px;">32776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:323px;">CO2 Incubator</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">&#160;Model 3530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:323px;">Confocal microscope equipped with live imaging chamber</td>
			<td style="width:229px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">SP5X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning&#160; 96 Well Black Polystyrene Microplate&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Glomax Illuminator&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Pipette tips (0.1-10 &#181;L)</td>
			<td style="width:229px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-717-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipette tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:119px;">83007-382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Pipette tips (200 &#181;L)</td>
			<td style="width:229px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">53509-007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectrophotometer Ultrospec 2000 UV</td>
			<td style="width:229px;">Pharmacia Biotech</td>
			<td style="width:119px;">80-2106-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Sterile 15 ml conical tubes</td>
			<td style="width:229px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">21008-216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Sterile Microcentrifuge Tubes (1.7 mL)</td>
			<td style="width:229px;">Sorenson BioScience</td>
			<td style="width:119px;">16070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile polyester-tipped applicators</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:323px;">Sonicator</td>
			<td style="width:229px;">Kontes</td>
			<td style="width:119px;">Equivelent to 9110001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative examination of antibiotic susceptibility of neisseria gonorrhoeae aggregates using atp-utilization commercial assays and live/dead staining

Fremkomsten af antibiotika-resistente Neisseria gonorrhoeae (GC) er et verdensomspændende sundhedstrussel og fremhæver behovet for at identificere personer, der ikke behandling. Denne Gram-negative bakterier forårsager gonoré udelukkende hos mennesker. Under infektion er den købedygtig form aggregater og/eller biofilm. Den mindste hæmmende koncentration (MIC) test bruges til at bestemme følsomhed over for antibiotika og fastlægge passende behandling. Mekanismen af udryddelse in vivo og dens forhold til laboratorieresultaterne kendes dog ikke. Blev udviklet en metode, der undersøger hvordan GC sammenlægning påvirker antibiotikaresistens og viser forholdet mellem samlede størrelse og antibiotikaresistens. Når GC aggregat, de er mere resistente over for antibiotika drab, overlevende med bakterier i midten ceftriaxon behandling bedre end i periferien. Dataene angiver, at N. gonorrhoeae sammenlægning kan reducere dets modtagelighed for ceftriaxon, hvilket ikke afspejles ved hjælp af standard agar plade-baserede MIC metoder. Metoden i denne undersøgelse giver forskere til at teste bakteriel følsomhed under klinisk relevante forhold.

To metoder var ansat: en ATP udnyttelse analyse og en live/døde farvning assay. Resultaterne kan enten være kombineret eller individuelt bruges til at undersøge bakteriel overlevelse inden for tilslagsmaterialer efter behandling med antibiotika. ATP udnyttelse analysen har vist at måle præcist levedygtige bakterier i S. aureus biofilm20,21. Her, blev MS11Opa + Pil + stamme brugt til at undersøge rollen, som GC samme...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining at Jo

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

En simpel måling af ATP assay og live/døde farvning metode blev brugt til at kvantificere og visualisere Neisseria gonorrhoeae overlevelse efter behandling med ceftriaxon. Denne protokol kan udvides til at undersøge enhver antibiotikum antimikrobielle virkninger og kan bruges til at definere den minimale hæmmende koncentration af antibiotika i bakterielle biofilm.

Kvantitativ undersøgelse af antibiotika følsomhed af Neisseria gonorrhoeae aggregater bruger ATP-udnyttelse kommercielle Assays og Live/døde farvning

The emergence of antibiotic resistant Neisseria gonorrhoeae (GC) is a worldwide health threat and highlights the need to identify individuals who fail ...

Denne teknik giver os mulighed for at måle antibiotika følsomhed under mere klinisk relevante betingelser. Teknikken giver os også mulighed for at bestemme den sande antibiotika koncentration, der kan dræbe bakterier i aggregater. Denne teknik kan anvendes til bestemmelse af den koncentration, der er nødvendig for at eliminere GC-aggregater.Metoden kan også anvendes til måling af antimikrobiel følsomhed af eventuelle bakterier, der er i stand til at danne aggregater. Vær meget opmærksom på lysis trin for at sikre lysis er komplet. Ellers vil ATP-måleanalysen undervurdere antallet af levedygtige bakterier.Visualisering af denne metode vil give andre forskere til at følge og kopiere dette eksperiment med konsistens. Begynd med striber Neisseria gonorrhoeae, eller GC stammer, på GCK agar suppleret med 1% Kellogg for en 16 til 18-timers inkubation ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid. Den næste morgen, bruge en lys mikroskop til omhyggeligt at vælge pili-negative kolonier uden mørke kanter eller pili-positive kolonier med mørke kanter fra hver plade, og streak de plukkede kolonier på nye GCK plader til en 16 til 18-timers kultur ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid.Den næste morgen, bruge en steril applikator til at indsamle GC kolonier fra hver plade og resuspendere hver podepind i varm bouillon suppleret med 4,2% natriumbikarbonat og 1% Kellogg opløsning. Den optiske massetæthed måles ved 650 nanometer eller OD650 for at bestemme koncentrationen af de suspenderede bakterier og justere GC-koncentrationen til ca. en gange 10 til de otte kolonidannende enheder pr. milliliter. Dernæst tilsættes 99 mikroliter af GC suspension i individuelle brønde af en 96-brønd plade og lad bakterierne til at samle ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i seks timer.Ved slutningen af inkubationen tilsættes en mikroliter serielt fortyndet ceftriaxon til hver brønd, hvilket efterlader nogle brønde ubehandlet til at fungere som kontrol og returnere pladen til inkubatoren i yderligere 24 timer. Den næste dag, sonikere suspensionen i hver brønd tre gange på 144 watt og 20 kilohertz i fem sekunder pr sonikering og tilføje 100 mikroliter af kommercielt tilgængelige ATP udnyttelse glød reagens til hver brønd. Overfør forsigtigt 150 mikroliter af blandingen fra hver brønd i individuelle brønde af en ny 96-brønd sort mikroplade og mål absorbansen af hver brønd ved 560 nanometer på en pladelæser.Derefter beregne overlevelsesraten ved forholdet mellem læsning opnået efter seriel antibiotikabehandling til læsning fra ubehandlede brønde. For visualisering af levende / døde GC aggregater, bruge en steril applikator til at indsamle GC fra natten kulturperler plader og resuspend GC i forvarmet GCP medium suppleret med 1% Kellogg. OD650 måles ved spektrofotometri, og koncentrationen justeres til ca. en gang 10 til de syv kolonidannende enheder pr. milliliter.Dernæst tilsættes 198 mikroliter af GC suspension i otte-brønd coverslip-bund kamre og inkubere kamrene ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i seks timer. Ved inkubationens afslutning behandles bakterierne med to mikroliter ceftriaxon pr. aggregeringstilstand, og kamrene returneres til inkubatoren i den relevante eksperimentelle inkubationstid. Ved slutningen af inkubationen tilsættes 0,6 mikroliter af levende/døde farvningsopløsning i hver brønd, og kamrene returneres til inkubatoren i yderligere 20 minutter.Brug derefter et konfokalt mikroskop til at hente billeder i z-serien. Til måling af størrelsen af GC-aggregaterne skal du åbne det første billede i ImageJ og vælge frihåndslinjer for at markere området for hver sammenlægning i billedet. Klik på analysér og målér.Størrelsen af aggregaterne angives under områdekolonnen. For kvantificering af fluorescens intensitetsforholdet af den levende til døde farvning i hver samlet, skal du klikke analysere og indstille målinger og kontrollere den integrerede tæthed i popup-vinduet. Klik på OK, og klik på værktøjet Billede, farve og kanaler.Vælg farve og kanal en som fluorescens for døde bakterier farvning. Vælg frihåndslinjer for at markere området for hver sammenlægning, og klik på analysér og mål for at opnå fluorescensintensitetsforholdet for hvert aggregat i den integrerede tæthedskolonne. Vælg kanal to for fluorescens for levende bakteriel farvning og måle fluorescens intensitet i hver samlet som netop påvist.Divider derefter de levende fluorescensintensitetsdata med de døde fluorescensintensitetsdata for at opnå forholdet mellem levende og død fluorescensintensitet. I dette repræsentative eksperiment blev ikke-agggregeret pili positiv, aggregeret pili positiv eller aggregeret og forstyrret pili positive bakterier behandlet med serielle fortyndinger af ceftriaxon før måling af deres ATP-niveauer. Præaggregerede GC viste en signifikant højere overlevelse end ikke-aggregeret eller aggregering forstyrret GC, når de behandles med lige koncentrationer af ceftriaxon eller højere.Pili-positive stammer, der danner større aggregater udstillet de højeste ATP niveauer efter ceftriaxon behandling i forhold til mutant stammer. Uanset stamme testet, levende / døde farvning før antibiotikabehandling afslørede døde bakterier stort set placeret på de ydre lag af kulturen, mens levende GC blev identificeret primært inden for kernen af ceftriaxon-behandlede aggregater. Som forventet dannede pili-positive bakterier de største aggregater, mens pili-negative kulturer dannede de mindste.Især pili-positive aggregater var stadig i live i deres kernelag efter antibiotikabehandling, mens GC i de små, løse mutant aggregater var døde. Baseret på størrelsen og overlevelsen af GC, en korrelation graf kan plottes til at undersøge forholdet mellem aggregering størrelse og antibiotika overlevelse af bakterier. Sonikering er vigtigt for at sikre, at ATP fra hver enkelt bakterie frigives inden for de tæt bundne aggregater.Ellers vil målingerne ikke være konsistente. Det er vigtigt at plade bakterierne, når de har samlet og behandles med antibiotika til at måle både levedygtige og replikation-stand bakterier. Teknikken måler bakterier aggregation indflydelse på antibiotika modtagelighed giver forskerne mulighed for at udvikle bedre lægemidler til behandling af sygdomme.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

The telomere G-overhang structure has been identified in many eukaryotes including yeast, vertebrates, and Trypanosoma brucei. It serves as the substrate ...

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &alpha;-actinin by Confocal Imaging

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human ÃƒÅ½Ã‚Â±-actinin by Confocal Imaging

The Opc protein of Neisseria meningitidis (Nm, meningococcus) is a surface-expressed integral outer membrane protein, which can act as an adhesin and an ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

Undersøgelse af tymisk positiv og negativ selektion ved flowcytometri

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign  antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the  T cell ...

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Fremstilling af en blodkultur Pellet til hurtig bakteriel identifikation og antibiotikaresistens undersøgelserne

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Kvalitative og kvantitative Analyser for påvisning og karakterisering af Protein Antimikrobielle stoffer

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Målretning Biofilm Associated<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Brug Resazurin Baseret Drug-modtagelighed Assay

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority ...

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

Undersøgelse af Host fænotyper i<em&gt; Gambusia affinis</em&gt; Efter behandling med antibiotika

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host ...

Quantitative Polymerase Chain Reaction-based Analyses of Murine Intestinal Microbiota After Oral Antibiotic Treatment

Kvantitative Polymerase Chain Reaction-baserede analyser af Murine tarmens mikrobiota efter peroral antibiotisk behandling

The gut microbiota has a central influence on human health. Microbial dysbiosis is associated with many common immunopathologies such as inflammatory ...

Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform

Antibiotika-Dereplication ved hjælp af antibiotikaresistens platformen

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this ...