Name: quantitative examination of antibiotic susceptibility of neisseria gonorrhoeae aggregates using atp-utilization commercial assays and live/dead staining
Uploaded: 2019-02-08T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining at Jo

Ce travail a été soutenu par une subvention du National Institute of Health D.E.C. et W.S. AI123340. L.-C.W., J.W., A.C., et E.N. appuyés en partie/participer au programme « La première année l’Innovation & recherche expérience » financé par l’Université du Maryland. Les bailleurs de fonds n’avaient aucun rôle dans l’étude de conception, collecte de données et l’analyse, de décision de publier, ou de la préparation du manuscrit. Nous reconnaissons l’UMD CBMG Imaging Core pour toutes les expériences de microscopie.

1. entretien général des souches de GC
<ol><li>Les souches de N. gonorrhoeae -ensemencer sur une gélose GCK avec 1 % Kellogg complète18 (tableau 1, tableau 2) provenant des stocks du congélateur et incuber à 37 ° C, avec 5 % CO2 pendant 16 à 18 h. utilisation MS11 exprimant phase variable Opa (MS11Opa +), aucune Opa (MS11ΔOpa), ou a LOS tronqué (MS11ΔLgtE).</li>
	<li>Prélever soigneusement des pili négatif (colonie sans bordure sombre) ou colonie...

<ol>
	<li>den Heijer, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+overview+of+urogenital,+anorectal+and+oropharyngeal+Neisseria+gonorrhoeae+testing+and+diagnoses+among+different+STI+care+providers:+a+cross-sectional+study.">A comprehensive overview of urogenital, anorectal and oropharyngeal Neisseria gonorrhoeae testing and diagnoses among different STI care providers: a cross-sectional study.</a> BMC Infectious Diseases. 17 (1), (2017).</li><li>Hein, K., Marks, A., Cohen, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymptomatic+gonorrhea:+prevalence+in+a+population+of+urban+adolescents.">Asymptomatic gonorrhea: prevalence in a population of urban adolescents.</a> The Journal of Pediatrics. 90 (4), 634-635 (1977).</li><li>Hananta, I. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gonorrhea+in+Indonesia:+High+Prevalence+of+Asymptomatic+Urogenital+Gonorrhea+but+No+Circulating+Extended+Spectrum+Cephalosporins-Resistant+Neisseria+gonorrhoeae+Strains+in+Jakarta,+Yogyakarta,+and+Denpasar,+Indonesia.">Gonorrhea in Indonesia: High Prevalence of Asymptomatic Urogenital Gonorrhea but No Circulating Extended Spectrum Cephalosporins-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strains in Jakarta, Yogyakarta, and Denpasar, Indonesia.</a> Sexually Transmitted Diseases. 43 (10), 608-616 (2016).</li><li>Chlamydia, W. H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlamydia+trachomatis,+Neisseria+gonorrhoeae,+syphilis+and+Trichomonas+vaginalis.+Methods+and+results+used+by+WHO+to+generate+2005+estimates.+World+Health+Organisation,+2011.+Prevalence+and+incidence+of+selected+sexually+transmitted+infections.">Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, syphilis and Trichomonas vaginalis. Methods and results used by WHO to generate 2005 estimates. World Health Organisation, 2011. Prevalence and incidence of selected sexually transmitted infections.</a> World Health Organisation. , (2011).</li><li>Mayor, M. T., Roett, M. A., Uduhiri, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+management+of+gonococcal+infections.">Diagnosis and management of gonococcal infections.</a> American Family Physician. 86 (10), 931-938 (2012).</li><li>Alirol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidrug-resistant+gonorrhea:+A+research+and+development+roadmap+to+discover+new+medicines.">Multidrug-resistant gonorrhea: A research and development roadmap to discover new medicines.</a> PLOS Medicine. 14 (7), (2017).</li><li>Workowski, K. A., Bolan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexually+transmitted+diseases+treatment+guidelines,+2015.">Sexually transmitted diseases treatment guidelines, 2015.</a> MMWR Recommendations and Reports. 64, 1-137 (2015).</li><li>Lahra, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+Recognition+of+Internationally+Disseminated+Ceftriaxone-Resistant+Neisseria+gonorrhoeae+Strain.">Cooperative Recognition of Internationally Disseminated Ceftriaxone-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strain.</a> Emerging Infectious Diseases. 24 (4), (2018).</li><li>Wi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+resistance+in+Neisseria+gonorrhoeae:+Global+surveillance+and+a+call+for+international+collaborative+action.">Antimicrobial resistance in Neisseria gonorrhoeae: Global surveillance and a call for international collaborative action.</a> PLOS Medicine. 14 (7), 1002344 (2017).</li><li>Singh, S., Singh, S. K., Chowdhury, I., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+Mechanism+of+Bacterial+Biofilms+Resistance+to+Antimicrobial+Agents.">Understanding the Mechanism of Bacterial Biofilms Resistance to Antimicrobial Agents.</a> Open Microbiology Journal. 11, 53-62 (2017).</li><li>Greiner, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+Formation+by+Neisseria+gonorrhoeae.">Biofilm Formation by Neisseria gonorrhoeae.</a> Infection and Immunity. 73 (4), 1964-1970 (2005).</li><li>Zollner, R., Oldewurtel, E. R., Kouzel, N., Maier, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+and+antigenic+variation+govern+competition+dynamics+through+positioning+in+bacterial+colonies.">Phase and antigenic variation govern competition dynamics through positioning in bacterial colonies.</a> Scientific Reports. 7 (1), (2017).</li><li>Stein, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Opacity+Proteins+Interferes+with+the+Transmigration+of+Neisseria+gonorrhoeae.+across+Polarized+Epithelial+Cells.">Expression of Opacity Proteins Interferes with the Transmigration of Neisseria gonorrhoeae. across Polarized Epithelial Cells.</a> PLoS One. 10 (8), 0134342 (2015).</li><li>LeVan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+a+derivative+of+Neisseria+gonorrhoeae+strain+MS11+devoid+of+all+opa+genes.">Construction and characterization of a derivative of Neisseria gonorrhoeae strain MS11 devoid of all opa genes.</a> Journal of Bacteriology. 194 (23), 6468-6478 (2012).</li><li>Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+and+analyzing+static+biofilms.">Growing and analyzing static biofilms.</a> Curr Protoc Microbiol. , (2005).</li><li>Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+multiple+methods+for+quantification+of+microbial+biofilms+grown+in+microtiter+plates.">Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates.</a> Journal of Microbiological Methods. 72 (2), 157-165 (2008).</li><li>White, L. A., Kellogg, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neisseria+Gonorrhoeae+Identification+in+Direct+Smears+by+a+Fluorescent+Antibody-Counterstain+Method.">Neisseria Gonorrhoeae Identification in Direct Smears by a Fluorescent Antibody-Counterstain Method.</a> Journal of Applied Microbiology. 13, 171-174 (1965).</li><li>Swanson, J., Kraus, S. J., Gotschlich, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+gonococcus+infection.+I.+Pili+and+zones+of+adhesion:+their+relation+to+gonococcal+growth+patterns.">Studies on gonococcus infection. I. Pili and zones of adhesion: their relation to gonococcal growth patterns.</a> Journal of Experimental Medicine. 134 (4), 886-906 (1971).</li><li>Herten, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+in+Vitro+Quantification+of+S.+aureus+Biofilms+on+Vascular+Graft+Surfaces.">Rapid in Vitro Quantification of S. aureus Biofilms on Vascular Graft Surfaces.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 2333 (2017).</li><li>Gracia, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+development+of+Staphylococcus+aureus+biofilms+using+slime-producing+variants+and+ATP-bioluminescence+for+automated+bacterial+quantification.">In vitro development of Staphylococcus aureus biofilms using slime-producing variants and ATP-bioluminescence for automated bacterial quantification.</a> Luminescence. 14 (1), 23-31 (1999).</li><li>Webb, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+development.">Cell death in Pseudomonas aeruginosa biofilm development.</a> Journal of Bacteriology. 185 (15), 4585-4592 (2003).</li><li>Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+biofilm+formation+in+an+8-well+chamber+slide.">In vitro biofilm formation in an 8-well chamber slide.</a> Journal of visualized experiments. (47), (2011).</li><li>Wang, L. C., Litwin, M., Sahiholnasab, Z., Song, W., Stein, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neisseria+gonorrhoeae+Aggregation+Reduces+Its+Ceftriaxone+Susceptibility.">Neisseria gonorrhoeae Aggregation Reduces Its Ceftriaxone Susceptibility.</a> Antibiotics (Basel). 7 (2), (2018).</li><li>Lebeaux, D., Ghigo, J. M., Beloin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm-related+infections:+bridging+the+gap+between+clinical+management+and+fundamental+aspects+of+recalcitrance+toward+antibiotics.">Biofilm-related infections: bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 510-543 (2014).</li><li>Hall-Stoodley, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+diagnostic+guidelines+for+biofilm-associated+infections.">Towards diagnostic guidelines for biofilm-associated infections.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 65 (2), 127-145 (2012).</li></ol>

Les bactéries peuvent former des biofilms au cours de l’infection du corps humain. Traditionnel MIC test peut-être ne pas refléter la concentration nécessaire pour éradiquer les biofilms bactériens. Pour tester les effets antimicrobiens sur un biofilm, méthodes basées sur la biomasse biofilm ainsi qu’UFC de placage peuvent être erronées en raison de l’impact de la structure des biofilms. Par exemple, la méthode de placage ne fonctionne que si le biofilm peut être perturbé. Par conséquent, l’UFC a ob...

La gonorrhée est qu'une commune transmises sexuellement (MTS)1. Neisseria gonorrhoeae (GC), une bactérie Gram-négative de diplococcal, est l’agent causal de cette maladie. Symptômes de l’infection génitale peuvent entraîner des douleurs pendant la miction, douleurs génitales généralisée et urétral. L’infection est souvent asymptomatique2,3,4,5, et cela permet à la longue colonisation. Ces infections non traitées sont un sujet de préoccupation majeur pour la santé, car ils sont susceptibles de faciliter la transmission de l’organisme et cela peut conduire à des complications telles que la maladie inflammatoire pelvienne (MIP) et diffusé l’infection gonococcique (DGI)6. La gonorrhée résistante aux antibiotiques est une crise de santé publique majeur et une augmentation de fardeau socio-économique7. Traitement régime changement d’un seul antibiotique à la bithérapie, qui combine l’azithromycine ou la doxycycline avec ceftriaxone8a entraîné une sensibilité réduite aux céphalosporines. L’échec accru de ceftriaxone et l’azithromycine9,10, en combinaison avec des infections asymptomatiques, met en évidence la nécessité de comprendre les échecs de traitement de la gonorrhée.
L’essai de la concentration minimale inhibitrice (CMI), y compris les tests de diffusion de dilution et disque agar, a été utilisé comme le test médical standard pour l’identification de la résistance à un antibiotique. Néanmoins, il est difficile de savoir si le critère de la MIC exprime l’antibiorésistance bactérienne in vivo. La formation de biofilms bactériens contribue à la survie de bactéries en présence de concentrations bactéricides d’antibiotique : l’essai de MIC est incapable de détecter cet effet11. Parce que le GC peut former des biofilms sur les surfaces muqueuses12, nous émettons l’hypothèse de cet antibiotique susceptibilité au sein des agrégats serait différente de celle observée dans les GC. En outre, des études ont montré que trois phase protéine associée à l’opacité de molécules de surface variable, Pili, (Opa) et lipooligosaccharides (LOS), qui régissent les interactions entre bactérie, conduire à différents agrégats de taille13, 14 , 15. la contribution de ces composants à la résistance aux antibiotique n’a pas été examinée faute de méthodes appropriées.
Actuellement, il y a plusieurs méthodes pour mesurer l’élimination du biofilm. La méthode quantitative plus largement utilisée est en mesurant les changements dans la biomasse à l’aide de violet de gentiane16de coloration. Toutefois, la méthode requiert la manipulation expérimentale importante, qui peut potentiellement générer des erreurs dans l’expérience répétitions17. La méthode de coloration de vivre/morts utilisée ici permet la visualisation des bactéries vivantes et mortes et leur distribution dans le biofilm. Cependant, la structure des biofilms peut poser comme une barrière physique qui réduit la pénétration de la teinture. Par conséquent, afin de quantifier les bactéries vivent/morts au sein d’un groupe, la coloration est limitée à petits biofilms ou son précurseur-microcolonies ou agrégations. Autres méthodes, y compris les essais de diffusion gélose dilution et disque, ne sont pas en mesure de mesurer les effets d’agrégation. Afin d’examiner la sensibilité GC au sein de l’agrégation après exposition aux antibiotique, une méthode idéale aurait besoin d’avoir les deux un test quantitatif qui permet de mesurer vivent des bactéries et visualiser leur distribution.
La procédure décrite ici combine une mesure de l’utilisation d’ATP et une coloration live/morts de dosage à quantitativement et examiner visuellement la susceptibilité de GC au sein des agrégats en présence d’antibiotiques.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:837px;" width="837">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">100x Kellogg&#39;s supplement</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Agar</td>
			<td style="width:229px;">United States Biological</td>
			<td style="width:119px;">A0930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">BacTiter Assay&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">G8232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Ceftriaxone</td>
			<td style="width:229px;">TCI</td>
			<td style="width:119px;">C2226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Difco GC medium base&#160;</td>
			<td style="width:229px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">228950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ferric nitrate, nonahydrate&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">254223-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td style="width:229px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP350-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine Crystalline Powder</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP379-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BacLight live/dead staining</td>
			<td style="width:229px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">L7012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MS11 Neisseria gonorrhoeae strain</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>kindly provided by Dr. Herman Schneider, Walter Reed Army Institute for Research</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:323px;">Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P290-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP329-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteose Peptone&#160;</td>
			<td style="width:229px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">211693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S671-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Soluble Starch</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S9765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thiamine pyrophosphate</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C8754-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Equipment</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Petri Dishes</td>
			<td style="width:229px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">25384-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">8-well coverslip-bottom chamber&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">155411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well tissue culture plates&#160;</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td style="width:119px;">3370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:323px;">Biosafety Cabinet (NU-425-600 Class II, A2 Laminar Flow Biohazard Hood)</td>
			<td style="width:229px;">Nuaire</td>
			<td style="width:119px;">32776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:323px;">CO2 Incubator</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">&#160;Model 3530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:323px;">Confocal microscope equipped with live imaging chamber</td>
			<td style="width:229px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">SP5X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning&#160; 96 Well Black Polystyrene Microplate&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Glomax Illuminator&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Pipette tips (0.1-10 &#181;L)</td>
			<td style="width:229px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-717-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipette tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:119px;">83007-382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Pipette tips (200 &#181;L)</td>
			<td style="width:229px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">53509-007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectrophotometer Ultrospec 2000 UV</td>
			<td style="width:229px;">Pharmacia Biotech</td>
			<td style="width:119px;">80-2106-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Sterile 15 ml conical tubes</td>
			<td style="width:229px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">21008-216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Sterile Microcentrifuge Tubes (1.7 mL)</td>
			<td style="width:229px;">Sorenson BioScience</td>
			<td style="width:119px;">16070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile polyester-tipped applicators</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:323px;">Sonicator</td>
			<td style="width:229px;">Kontes</td>
			<td style="width:119px;">Equivelent to 9110001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative examination of antibiotic susceptibility of neisseria gonorrhoeae aggregates using atp-utilization commercial assays and live/dead staining

L’émergence de résistants aux antibiotiques Neisseria gonorrhoeae (GC) est une menace pour la santé dans le monde entier et souligne la nécessité d’identifier les personnes qui ne respectent pas de traitement. Cette bactérie Gram-négative provoque la gonorrhée exclusivement chez l’homme. Au cours de l’infection, il est apte à former des agrégats ou des biofilms. L’essai de la concentration minimale inhibitrice (CMI) est utilisé pour déterminer la susceptibilité aux antibiotiques et de définir un traitement approprié. Toutefois, le mécanisme de l’éradication in vivo et sa relation avec les résultats de laboratoire ne sont pas connus. A développé une méthode qui examine comment l’agrégation GC affecte la sensibilité aux antibiotique et montre la relation entre la taille des granulats et sensibilité aux antibiotique. Lors de l’agrégat de GC, ils sont plus résistants aux antibiotiques mise à mort, avec des bactéries dans le centre survivant ceftriaxone traitement mieux que ceux de la périphérie. Les données indiquent que l’agrégation de N. gonorrhoeae peut réduire sa sensibilité à la ceftriaxone, qui se traduit pas en utilisant les méthodes MIC standard agar axée sur la plaque. La méthode utilisée dans cette étude permettra aux chercheurs de tester la sensibilité bactérienne conditions cliniquement pertinentes.

Deux méthodes ont été employées : un essai d’utilisation ATP et un test de coloration de vivre/morts. Les résultats peuvent être combinés ou utilisés individuellement pour examiner la survie bactérienne au sein des agrégats après un traitement antibiotique. Le test d’utilisation ATP a été démontré pour mesurer des bactéries viables avec précision dans le S. aureus biofilms20,21. Ici, MS11Opa + Lip + ...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining at Jo

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

Un simple test ATP-instruments de mesure et vivre/morts méthode de coloration ont été utilisés pour quantifier et visualiser les Neisseria gonorrhoeae survie après traitement par ceftriaxone. Ce protocole peut être étendu pour examiner les effets antimicrobiens de n’importe quel antibiotique et peut être utilisé pour définir la concentration minimale inhibitrice d’antibiotiques dans les biofilms bactériens.

Examen quantitatif de la sensibilité aux antibiotiques d’essais commerciaux de Neisseria gonorrhoeae utilisation d’ATP à l’aide de granulats et de Live/Dead coloration

The emergence of antibiotic resistant Neisseria gonorrhoeae (GC) is a worldwide health threat and highlights the need to identify individuals who fail ...

Cette technique nous permet de mesurer la susceptibilité aux antibiotiques dans des conditions plus cliniquement pertinentes. La technique nous permet également de déterminer la véritable concentration d’antibiotiques qui peut tuer les bactéries dans les agrégats. Cette technique peut être appliquée pour déterminer la concentration nécessaire à l’élimination des agrégats GC.La méthode peut également être appliquée à la mesure de la susceptibilité antimicrobienne de toutes les bactéries capables de former des agrégats. Portez une attention particulière aux étapes de la lyse pour vous assurer que la lyse est terminée. Sinon, l’analyse de mesure ATP sous-estimera le nombre de bactéries viables.La visualisation de cette méthode permettra à d’autres chercheurs de suivre et de reproduire cette expérience avec cohérence. Commencez par stries Neisseria gonorrhoeae, ou souches GC, sur gck agar complété avec 1%Kellogg pour une incubation de 16 à 18 heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Le lendemain matin, utilisez un microscope léger pour sélectionner soigneusement les colonies pili-négatives sans bords foncés ou colonies pili-positives avec des bords foncés de chaque plaque, et stries les colonies cueillies sur de nouvelles plaques GCK pour une culture de 16 à 18 heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.Le lendemain matin, utilisez un applicateur stérile pour recueillir les colonies de GC de chaque assiette et résuspendez chaque écouvillon dans du bouillon chaud complété par 4,2 % de bicarbonate de sodium et 1 % de solution Kellogg. Mesurer la densité optique à 650 nanomètres, ou OD650, pour déterminer la concentration des bactéries en suspension et ajuster la concentration de GC à environ une fois 10 à huit unités de formation de colonie par millilitre. Ensuite, ajouter 99 microlitres de la suspension GC dans les puits individuels d’une plaque de 96 puits et permettre aux bactéries de s’agréger à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant six heures.À la fin de l’incubation, ajouter un microlitre de ceftriaxone dilué en série à chaque puits en laissant certains puits non traités pour servir de commandes et remettre la plaque à l’incubateur pendant encore 24 heures. Le lendemain, soniquer la suspension dans chaque puits trois fois à 144 watts et 20 kilohertz pendant cinq secondes par sonication et ajouter 100 microlitres de réavenant d’utilisation ATP disponible dans le commerce à chaque puits. Transférez soigneusement 150 microlitres de mélange de chaque puits dans les puits individuels d’une nouvelle microplaque noire de 96 puits et mesurez l’absorption de chaque puits à 560 nanomètres sur un lecteur de plaque.Ensuite, calculer le taux de survie par le rapport de la lecture obtenue après le traitement antibiotique en série à la lecture des puits non traités. Pour la visualisation des agrégats gc vivants/morts, utilisez un applicateur stérile pour recueillir GC à partir des plaques de culture de nuit et réutiliser le GC dans le milieu GCP préchauffé complété par 1% Kellogg. Mesurez l’OD650 par spectrophotométrie et ajustez la concentration à environ une fois 10 pour les sept unités de formation de colonies par millilitre.Ensuite, ajoutez 198 microlitres de suspension GC dans des chambres à fond de couverture de huit puits et incubez les chambres à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant six heures. À la fin de l’incubation, traiter les bactéries avec deux microlitres de ceftriaxone par condition d’agrégation et retourner les chambres à l’incubateur pour la période d’incubation expérimentale appropriée. À la fin de l’incubation, ajouter 0,6 microlitres de solution de coloration vivante/morte dans chaque puits et remettre les chambres à l’incubateur pendant 20 minutes supplémentaires.Ensuite, utilisez un microscope confocal pour obtenir des images de la série Z. Pour mesurer la taille des agrégats GC, ouvrez la première image dans ImageJ et sélectionnez des lignes à main levée pour entourer la zone de chaque agrégation dans l’image. Cliquez sur analyser et mesurer.La taille des agrégats sera indiquée sous la colonne de zone. Pour quantifier le rapport d’intensité de fluorescence de la coloration vivante à morte dans chaque agrégat, cliquez sur analyser et définir les mesures et vérifiez la densité intégrée dans la fenêtre popup. Cliquez sur OK et cliquez sur l’image, la couleur et l’outil canaux.Sélectionnez la couleur et canal nt un comme fluorescence pour la coloration des bactéries mortes. Sélectionnez des lignes à main levée pour encercler la zone de chaque agrégation et cliquez sur analyser et mesurer pour obtenir le rapport d’intensité de fluorescence pour chaque agrégat dans la colonne de densité intégrée. Sélectionnez le canal deux pour la fluorescence pour la coloration bactérienne vivante et mesurez l’intensité de fluorescence dans chaque agrégat comme nous venons de le démontrer.Divisez ensuite les données d’intensité de fluorescence vivante par les données d’intensité de fluorescence morte pour obtenir le rapport d’intensité de fluorescence vivant à mort. Dans cette expérience représentative, les bactéries positives non ventilées de pili positives, agrégées ou agrégées et perturbées de pili positives ont été traitées avec des dilutions périodiques de ceftriaxone avant la mesure de leurs niveaux d’ATP. Le GC préagré a démontré une survie significativement plus élevée que le GC non agrégé ou agrémenté lorsqu’il est traité avec des concentrations égales de ceftriaxone ou plus.Les souches pili-positives qui forment de plus gros agrégats présentaient les niveaux d’ATP les plus élevés après le traitement à la ceftriaxone par rapport aux souches mutantes. Indépendamment de la souche testée, les taches vivantes/mortes avant le traitement antibiotique ont révélé des bactéries mortes en grande partie situées aux couches externes de la culture, tandis que les GC vivants ont été identifiés principalement dans le noyau des agrégats traités à la ceftriaxone. Comme prévu, les bactéries pili-positives formaient les plus gros agrégats, tandis que les cultures pili-négatives formaient les plus petites.Notamment, les agrégats pili-positifs étaient encore vivants dans leurs couches fondamentales après traitement antibiotique, tandis que le GC dans les petits agrégats mutants lâches étaient morts. Basé sur la taille et la survie du GC, un graphique de corrélation peut être tracé pour examiner la relation entre la taille d’agrégation et la survie antibiotique des bactéries. La sonication est importante pour s’assurer que l’ATP de chaque bactérie individuelle est libéré dans les agrégats étroitement liés.Dans le cas contraire, les mesures ne seront pas cohérentes. Il est important de plaquer les bactéries après qu’elles se sont agrégées et sont traitées avec des antibiotiques pour mesurer à la fois la bactérie viable et la bactérie capable de réplication. La technique mesure l’influence de l’agrégation des bactéries sur la susceptibilité aux antibiotiques permettant aux chercheurs de développer de meilleurs médicaments pour le traitement des maladies.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

L&#39;examen des télomères G-structure en porte à faux Trypanosoma brucei</em

The telomere G-overhang structure has been identified in many eukaryotes including yeast, vertebrates, and Trypanosoma brucei. It serves as the substrate ...

Recherche

Immunologie et infection

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &alpha;-actinin by Confocal Imaging

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human ÃƒÅ½Ã‚Â±-actinin by Confocal Imaging

Visualisation et quantification des interactions intracellulaires des Neisseria meningitidis Et l&#39;homme α-actinine par imagerie confocale

The Opc protein of Neisseria meningitidis (Nm, meningococcus) is a surface-expressed integral outer membrane protein, which can act as an adhesin and an ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Analyses quantitatives de tous influenza de type A hémagglutinines virales et les neuraminidases utilisant des anticorps Universal en simples essais slot blot

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

L&#39;examen de sélection positive et négative thymique par cytométrie en flux

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign  antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the  T cell ...

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Préparation d&#39;une hémoculture Pellet pour Rapid bactérienne identification et les tests de sensibilité aux antibiotiques

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Les analyses qualitatives et quantitatives pour la détection et la caractérisation des antimicrobiens en protéines

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Ciblage biofilm Associated<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Utilisation de résazurine Basé Essai de sensibilité aux médicaments

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority ...

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

Examen des phénotypes d&#39;accueil en<em&gt; affinis de Gambusia</em&gt; Après le traitement aux antibiotiques

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host ...

Quantitative Polymerase Chain Reaction-based Analyses of Murine Intestinal Microbiota After Oral Antibiotic Treatment

Analyses de polymérase quantitative axée sur la réaction en chaîne de murin microbiote Intestinal après un traitement antibiotique par voie orale

The gut microbiota has a central influence on human health. Microbial dysbiosis is associated with many common immunopathologies such as inflammatory ...

Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform

Déplication d'antibiotiques à l'aide de la plate-forme de résistance aux antibiotiques

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this ...