Name: quantitative examination of antibiotic susceptibility of neisseria gonorrhoeae aggregates using atp-utilization commercial assays and live/dead staining
Uploaded: 2019-02-08T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining at Jo

Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra National Institute of Health D.C.S. og WS AI123340. L.-CW, JW, AC, og E.N. ble støttet i del/delta i "The første års innovasjon & forskning Experience" program finansiert av University of Maryland. Fond ikke hadde noen rolle i studien design, innsamling og analyse, beslutningen om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet. Vi erkjenner UMD CBMG Imaging kjernen for alle mikroskopi eksperimenter.

1. generelt vedlikehold av GC stammer
<ol><li>Strek N. gonorrhoeae stammer GCK Stim: agar med 1% Kellogg kosttilskudd18 (tabell 1, tabell 2) fra fryseren aksjer og ruge 37 ° C med 5% CO2 for 16-18 h. Bruk MS11 uttrykke fase variabel Opa (MS11Opa +), ingen Opa (MS11ΔOpa), eller en avkortet LOS (MS11ΔLgtE).</li>
	<li>Nøye velge pili negative (kolonien uten mørke kanten) eller positiv (kolonien med mørk kant) koloniene fra hver stamme basert på kolonien m...

<ol>
	<li>den Heijer, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+overview+of+urogenital,+anorectal+and+oropharyngeal+Neisseria+gonorrhoeae+testing+and+diagnoses+among+different+STI+care+providers:+a+cross-sectional+study.">A comprehensive overview of urogenital, anorectal and oropharyngeal Neisseria gonorrhoeae testing and diagnoses among different STI care providers: a cross-sectional study.</a> BMC Infectious Diseases. 17 (1), (2017).</li><li>Hein, K., Marks, A., Cohen, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymptomatic+gonorrhea:+prevalence+in+a+population+of+urban+adolescents.">Asymptomatic gonorrhea: prevalence in a population of urban adolescents.</a> The Journal of Pediatrics. 90 (4), 634-635 (1977).</li><li>Hananta, I. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gonorrhea+in+Indonesia:+High+Prevalence+of+Asymptomatic+Urogenital+Gonorrhea+but+No+Circulating+Extended+Spectrum+Cephalosporins-Resistant+Neisseria+gonorrhoeae+Strains+in+Jakarta,+Yogyakarta,+and+Denpasar,+Indonesia.">Gonorrhea in Indonesia: High Prevalence of Asymptomatic Urogenital Gonorrhea but No Circulating Extended Spectrum Cephalosporins-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strains in Jakarta, Yogyakarta, and Denpasar, Indonesia.</a> Sexually Transmitted Diseases. 43 (10), 608-616 (2016).</li><li>Chlamydia, W. H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlamydia+trachomatis,+Neisseria+gonorrhoeae,+syphilis+and+Trichomonas+vaginalis.+Methods+and+results+used+by+WHO+to+generate+2005+estimates.+World+Health+Organisation,+2011.+Prevalence+and+incidence+of+selected+sexually+transmitted+infections.">Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, syphilis and Trichomonas vaginalis. Methods and results used by WHO to generate 2005 estimates. World Health Organisation, 2011. Prevalence and incidence of selected sexually transmitted infections.</a> World Health Organisation. , (2011).</li><li>Mayor, M. T., Roett, M. A., Uduhiri, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+management+of+gonococcal+infections.">Diagnosis and management of gonococcal infections.</a> American Family Physician. 86 (10), 931-938 (2012).</li><li>Alirol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidrug-resistant+gonorrhea:+A+research+and+development+roadmap+to+discover+new+medicines.">Multidrug-resistant gonorrhea: A research and development roadmap to discover new medicines.</a> PLOS Medicine. 14 (7), (2017).</li><li>Workowski, K. A., Bolan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexually+transmitted+diseases+treatment+guidelines,+2015.">Sexually transmitted diseases treatment guidelines, 2015.</a> MMWR Recommendations and Reports. 64, 1-137 (2015).</li><li>Lahra, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+Recognition+of+Internationally+Disseminated+Ceftriaxone-Resistant+Neisseria+gonorrhoeae+Strain.">Cooperative Recognition of Internationally Disseminated Ceftriaxone-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strain.</a> Emerging Infectious Diseases. 24 (4), (2018).</li><li>Wi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+resistance+in+Neisseria+gonorrhoeae:+Global+surveillance+and+a+call+for+international+collaborative+action.">Antimicrobial resistance in Neisseria gonorrhoeae: Global surveillance and a call for international collaborative action.</a> PLOS Medicine. 14 (7), 1002344 (2017).</li><li>Singh, S., Singh, S. K., Chowdhury, I., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+Mechanism+of+Bacterial+Biofilms+Resistance+to+Antimicrobial+Agents.">Understanding the Mechanism of Bacterial Biofilms Resistance to Antimicrobial Agents.</a> Open Microbiology Journal. 11, 53-62 (2017).</li><li>Greiner, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+Formation+by+Neisseria+gonorrhoeae.">Biofilm Formation by Neisseria gonorrhoeae.</a> Infection and Immunity. 73 (4), 1964-1970 (2005).</li><li>Zollner, R., Oldewurtel, E. R., Kouzel, N., Maier, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+and+antigenic+variation+govern+competition+dynamics+through+positioning+in+bacterial+colonies.">Phase and antigenic variation govern competition dynamics through positioning in bacterial colonies.</a> Scientific Reports. 7 (1), (2017).</li><li>Stein, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Opacity+Proteins+Interferes+with+the+Transmigration+of+Neisseria+gonorrhoeae.+across+Polarized+Epithelial+Cells.">Expression of Opacity Proteins Interferes with the Transmigration of Neisseria gonorrhoeae. across Polarized Epithelial Cells.</a> PLoS One. 10 (8), 0134342 (2015).</li><li>LeVan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+a+derivative+of+Neisseria+gonorrhoeae+strain+MS11+devoid+of+all+opa+genes.">Construction and characterization of a derivative of Neisseria gonorrhoeae strain MS11 devoid of all opa genes.</a> Journal of Bacteriology. 194 (23), 6468-6478 (2012).</li><li>Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+and+analyzing+static+biofilms.">Growing and analyzing static biofilms.</a> Curr Protoc Microbiol. , (2005).</li><li>Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+multiple+methods+for+quantification+of+microbial+biofilms+grown+in+microtiter+plates.">Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates.</a> Journal of Microbiological Methods. 72 (2), 157-165 (2008).</li><li>White, L. A., Kellogg, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neisseria+Gonorrhoeae+Identification+in+Direct+Smears+by+a+Fluorescent+Antibody-Counterstain+Method.">Neisseria Gonorrhoeae Identification in Direct Smears by a Fluorescent Antibody-Counterstain Method.</a> Journal of Applied Microbiology. 13, 171-174 (1965).</li><li>Swanson, J., Kraus, S. J., Gotschlich, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+gonococcus+infection.+I.+Pili+and+zones+of+adhesion:+their+relation+to+gonococcal+growth+patterns.">Studies on gonococcus infection. I. Pili and zones of adhesion: their relation to gonococcal growth patterns.</a> Journal of Experimental Medicine. 134 (4), 886-906 (1971).</li><li>Herten, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+in+Vitro+Quantification+of+S.+aureus+Biofilms+on+Vascular+Graft+Surfaces.">Rapid in Vitro Quantification of S. aureus Biofilms on Vascular Graft Surfaces.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 2333 (2017).</li><li>Gracia, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+development+of+Staphylococcus+aureus+biofilms+using+slime-producing+variants+and+ATP-bioluminescence+for+automated+bacterial+quantification.">In vitro development of Staphylococcus aureus biofilms using slime-producing variants and ATP-bioluminescence for automated bacterial quantification.</a> Luminescence. 14 (1), 23-31 (1999).</li><li>Webb, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+development.">Cell death in Pseudomonas aeruginosa biofilm development.</a> Journal of Bacteriology. 185 (15), 4585-4592 (2003).</li><li>Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+biofilm+formation+in+an+8-well+chamber+slide.">In vitro biofilm formation in an 8-well chamber slide.</a> Journal of visualized experiments. (47), (2011).</li><li>Wang, L. C., Litwin, M., Sahiholnasab, Z., Song, W., Stein, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neisseria+gonorrhoeae+Aggregation+Reduces+Its+Ceftriaxone+Susceptibility.">Neisseria gonorrhoeae Aggregation Reduces Its Ceftriaxone Susceptibility.</a> Antibiotics (Basel). 7 (2), (2018).</li><li>Lebeaux, D., Ghigo, J. M., Beloin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm-related+infections:+bridging+the+gap+between+clinical+management+and+fundamental+aspects+of+recalcitrance+toward+antibiotics.">Biofilm-related infections: bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 510-543 (2014).</li><li>Hall-Stoodley, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+diagnostic+guidelines+for+biofilm-associated+infections.">Towards diagnostic guidelines for biofilm-associated infections.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 65 (2), 127-145 (2012).</li></ol>

Bakterier kan danne biofilm under infeksjon av menneskekroppen. Tradisjonelle mikrofon test gjenspeiler ikke konsentrasjonen trengs å utrydde bakterier i en biofilm. For å teste poesi aksent effekter på en biofilm, kan metoder basert på biofilm biomasse samt plating CFUs være feil på grunn av virkningen av biofilm struktur. For eksempel fungerer metoden plating bare hvis biofilm kan bli avbrutt. Derfor være CFU fått lavere enn det faktiske antallet levedyktig bakterier. Visualisere slaktede og levende bakterier i...

Gonoré er en felles seksuelt overførbare infeksjoner (STI)1. Neisseria gonorrhoeae (GC), en Gram-negative diplococcal bakterie, er den utløsende agenten for denne sykdommen. Symptomer på genital infeksjon kan føre smerte under vannlating, generalisert genital smerte og urethral utslipp. Infeksjonen er ofte asymptomatisk2,3,4,5, og dette gir utvidet kolonisering. Disse ubehandlet infeksjoner er en stor helse bekymring, som de har potensial til å lette overføringen av organismen, og dette kan føre til komplikasjoner som bekken inflammatorisk sykdom (PID) og spres gonococcal infeksjon (DGI)6. Antibiotika-resistente gonoré er en stor offentlig helse-krise og en økende sosioøkonomiske byrden7. Mindre mottakelighet for cefalosporiner har ført til behandling diett endring fra en enkelt antibiotika til dobbel terapi, som kombinerer azithromycin eller doxycycline med ceftriaxone8. Økt svikt av ceftriaxone og azithromycin9,10, i kombinasjon med asymptomatisk infeksjoner, fremhever behovet for å forstå gonoré behandling feil.
Minimum inhibitoriske konsentrasjon (MIC) test, herunder agar fortynning og platen diffusjon tester, har vært brukt som standard medisinsk testen for å identifisere motstand mot et antibiotikum. Likevel er det uklart om MIC testen gjenspeiler bakteriell antibiotikaresistens i vivo. Dannelsen av bakteriell biofilm bidrar til overlevelse av bakterier i nærvær av bakteriedrepende konsentrasjoner av antibiotika: MIC testing er finner denne effekten11. Fordi GC kan danner biofilm på slimhinnene overflater12, vi hypothesize at antibiotika mottakelighet innen aggregater ville være forskjellig fra det sett i enkelte GC. I tillegg har studier vist at trefase variabel overflaten molekyler, Pili, tetthet-assosiert protein (Opa), og lipooligosaccharides (LOS), som regulerer mellom bakterie interaksjoner, føre til ulike størrelser aggregater13, 14 , 15. bidrag av disse komponentene til antibiotikaresistens har ikke blitt undersøkt skyldes mangel på skikkelig metoder.
For tiden finnes det flere metoder å måle biofilm utrydding. Den mest brukte kvantitative metoden er ved å måle endringer i biomasse bruker crystal violet flekker16. Metoden krever imidlertid betydelig eksperimentelle manipulasjon, som kan potensielt generere feil i forsøket gjentas17. Live/døde flekker metoden brukt her lar visualisering av levende og døde bakterier og distribusjonen innen biofilm. Biofilm strukturen kan imidlertid utgjøre en fysisk barriere som reduserer fargestoff penetrasjon. Derfor for å kvantifisere live/døde bakterier i en gruppe, er den flekker begrenset til små biofilm eller forløper-microcolonies eller samlinger. Andre metoder, inkludert agar fortynning og platen diffusjon testene, kan ikke måle effekten av aggregering. Undersøke GC mottakelighet i aggregering etter antibiotika eksponering, en ideell metode ville nød for å ha begge en kvantitativ analyse som kan måle bor bakterier og visualisere distribusjonen.
Fremgangsmåten som er beskrevet her kombinerer en ATP-utnyttelse måler og en live/døde flekker analysen til kvantitativt og visuelt undersøke GC mottakelighet innen aggregater i nærvær av antibiotika.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:837px;" width="837">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">100x Kellogg&#39;s supplement</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Agar</td>
			<td style="width:229px;">United States Biological</td>
			<td style="width:119px;">A0930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">BacTiter Assay&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">G8232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Ceftriaxone</td>
			<td style="width:229px;">TCI</td>
			<td style="width:119px;">C2226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Difco GC medium base&#160;</td>
			<td style="width:229px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">228950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ferric nitrate, nonahydrate&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">254223-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td style="width:229px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP350-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine Crystalline Powder</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP379-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BacLight live/dead staining</td>
			<td style="width:229px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">L7012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MS11 Neisseria gonorrhoeae strain</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>kindly provided by Dr. Herman Schneider, Walter Reed Army Institute for Research</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:323px;">Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P290-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP329-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteose Peptone&#160;</td>
			<td style="width:229px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">211693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S671-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Soluble Starch</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S9765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thiamine pyrophosphate</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C8754-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Equipment</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Petri Dishes</td>
			<td style="width:229px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">25384-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">8-well coverslip-bottom chamber&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">155411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well tissue culture plates&#160;</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td style="width:119px;">3370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:323px;">Biosafety Cabinet (NU-425-600 Class II, A2 Laminar Flow Biohazard Hood)</td>
			<td style="width:229px;">Nuaire</td>
			<td style="width:119px;">32776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:323px;">CO2 Incubator</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">&#160;Model 3530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:323px;">Confocal microscope equipped with live imaging chamber</td>
			<td style="width:229px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">SP5X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning&#160; 96 Well Black Polystyrene Microplate&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Glomax Illuminator&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Pipette tips (0.1-10 &#181;L)</td>
			<td style="width:229px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-717-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipette tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:119px;">83007-382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Pipette tips (200 &#181;L)</td>
			<td style="width:229px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">53509-007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectrophotometer Ultrospec 2000 UV</td>
			<td style="width:229px;">Pharmacia Biotech</td>
			<td style="width:119px;">80-2106-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Sterile 15 ml conical tubes</td>
			<td style="width:229px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">21008-216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Sterile Microcentrifuge Tubes (1.7 mL)</td>
			<td style="width:229px;">Sorenson BioScience</td>
			<td style="width:119px;">16070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile polyester-tipped applicators</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:323px;">Sonicator</td>
			<td style="width:229px;">Kontes</td>
			<td style="width:119px;">Equivelent to 9110001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative examination of antibiotic susceptibility of neisseria gonorrhoeae aggregates using atp-utilization commercial assays and live/dead staining

Fremveksten av antibiotika resistente Neisseria gonorrhoeae (GC) er en verdensomspennende helserisiko og understreker behovet for å identifisere personer som ikke behandling. Denne Gram-negative bakterie forårsaker gonoré utelukkende hos mennesker. Under infeksjon er det kjøpedyktig skjemaet aggregater og/eller biofilm. Minimum inhibitoriske konsentrasjon (MIC) testen brukes for å bestemme mottakelighet for antibiotika og definere riktig behandling. Men mekanismen for utryddelsen i vivo og dens forhold til laboratorium resultatene er ikke kjent. En metode som undersøker hvordan GC aggregering påvirker antibiotika mottakelighet og viser forholdet mellom samlede størrelsen og antibiotika mottakelighet ble utviklet. Når GC samlet, de er mer motstandsdyktig mot antibiotika drapet, gjenlevende med bakterier i midten ceftriaxone behandling bedre enn i periferien. Dataene viser at N. gonorrhoeae aggregering kan redusere sin mottakelighet for ceftriaxone, noe som ikke gjenspeiles bruke standard agar plate-baserte MIC metoder. Metoden som brukes i denne studien vil tillate forskere å teste bakteriell mottakelighet under klinisk relevante forhold.

To metoder var ansatt: en ATP utnyttelse analyse og en live/døde flekker analysen. Resultatet kan enten være kombinert eller individuelt brukes for å undersøke bakteriell overlevelse i aggregat etter antibiotikabehandling. ATP utnyttelse analysen har vist å måle nøyaktig levedyktig bakterier i S. aureus biofilm20,21. Her ble MS11Opa + Pil + belastningen brukt til å undersøke rollen av GC aggregering i antibiotika...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining at Jo

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

En enkel ATP-måling analysen og live/døde flekker metoden ble brukt for å kvantifisere og visualisere Neisseria gonorrhoeae overlevelse etter behandling med ceftriaxone. Denne protokollen kan utvides for å undersøke de antimikrobielle effektene av noen antibiotika, og kan brukes til å definere den minimale inhibitoriske konsentrasjonen av antibiotika i bakteriell biofilm.

Kvantitativ undersøkelse av antibiotika mottakelighet av Neisseria gonorrhoeae aggregater bruker ATP-utnyttelse kommersielle analyser og Live/Dead flekker

The emergence of antibiotic resistant Neisseria gonorrhoeae (GC) is a worldwide health threat and highlights the need to identify individuals who fail ...

Denne teknikken tillater oss å måle antibiotikafølsomhet under mer klinisk relevante forhold. Teknikken tillater oss også å bestemme den sanne antibiotikakonsentrasjonen som kan drepe bakterier i aggregater. Denne teknikken kan brukes til å bestemme konsentrasjonen som trengs for å eliminere GC aggregater.Metoden kan også brukes til å måle antimikrobiell følsomhet for bakterier som er i stand til å danne aggregater. Vær forsiktig oppmerksom på lysis trinnene for å sikre lysis er fullført. Ellers vil ATP-måleanalysen undervurdere antall levedyktige bakterier.Visualisering av denne metoden vil tillate andre forskere å følge og replikere dette eksperimentet med konsistens. Begynn med å stripe Neisseria gonoré, eller GC stammer, på GCK agar supplert med 1% Kellogg for en 16 til 18-timers inkubasjon ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid. Neste morgen, bruk et lett mikroskop for å nøye velge pili-negative kolonier uten mørke kanter eller pili-positive kolonier med mørke kanter fra hver tallerken, og strek de plukkede koloniene på nye GCK-plater for en 16 til 18-timers kultur ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid.Neste morgen, bruk en steril applikator for å samle GC kolonier fra hver plate og gjenbruke hver vattpinne i varm kjøttkraft supplert med 4,2% natrium bikarbonat og 1% Kellogg løsning. Mål den optiske tettheten ved 650 nanometer, eller OD650, for å bestemme konsentrasjonen av de suspenderte bakteriene og justere GC-konsentrasjonen til omtrent en gang 10 til de åtte kolonidannende enhetene per milliliter. Deretter legger du til 99 mikroliter av GC-suspensjonen i individuelle brønner av en 96-brønnsplate og lar bakteriene aggregere ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid i seks timer.På slutten av inkubasjonen, tilsett en mikroliter seriefortynnet ceftriaxone til hver brønn som lar noen brønner være ubehandlet for å tjene som kontroller og returnere platen til inkubatoren i ytterligere 24 timer. Neste dag sonikerer du suspensjonen i hver brønn tre ganger ved 144 watt og 20 kilohertz i fem sekunder per sonikering og legger til 100 mikroliter av kommersielt tilgjengelig ATP-utnyttelsesglødreagens til hver brønn. Overfør forsiktig 150 mikroliter blanding fra hver brønn til individuelle brønner av en ny 96-brønns svart mikroplate og mål absorpsjonen av hver brønn på 560 nanometer på en plateleser.Deretter beregner overlevelsesraten etter forholdet mellom avlesningen oppnådd etter seriell antibiotikabehandling til lesing fra de ubehandlede brønnene. For visualisering av live / død GC aggregater, bruk en steril applikator for å samle GC fra natten kultiverte plater og resuspend GC i prewarmed GCP medium supplert med 1% Kellogg. Mål OD650 med spektrofotometri og juster konsentrasjonen til omtrent en ganger 10 til de syv kolonidannende enhetene per milliliter.Deretter legger du til 198 mikroliter GC-suspensjon i åtte-brønns dekksbunnskamre og inkubere kamrene ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid i seks timer. På slutten av inkubasjonen, behandle bakteriene med to mikroliter ceftriaxone per aggregering tilstand og returnere kamrene til inkubatoren for riktig eksperimentell inkubasjonsperiode. På slutten av inkubasjonen legger du til 0,6 mikroliter levende / døde fargingsløsning i hver brønn og returnerer kamrene til inkubatoren i ytterligere 20 minutter.Deretter bruker du et konfokalt mikroskop for å få z-seriebilder. For måling av størrelsen på GC-aggregatene åpner du det første bildet i ImageJ og velger frihåndslinjer for å sirkle rundt området for hver aggregering i bildet. Klikk analyser og mål.Størrelsen på aggregatene angis under områdekolonnen. For kvantifisering av fluorescensintensitetsforholdet mellom levende til døde flekker i hvert aggregert, klikk analyser og sett målinger og kontroller den integrerte tettheten i popup-vinduet. Klikk OK, og klikk bilde-, farge- og kanalverktøyet.Velg farge og kanal en som fluorescens for døde bakterier flekker. Velg frihåndslinjer for å sirkle området for hver aggregering, og klikk analyser og mål for å oppnå fluorescensintensitetsforholdet for hvert aggregat i kolonnen med integrert tetthet. Velg kanal to for fluorescens for live bakteriell farging og måle fluorescens intensiteten i hver aggregert som nettopp demonstrert.Del deretter intensitetsdataene for lysstoffer med de døde fluorescensintensitetsdataene for å oppnå intensitetsforholdet for levende til død fluorescens. I dette representative eksperimentet ble ikke-aggregert pili positiv, aggregert pili positiv eller aggregert og forstyrret pili positive bakterier behandlet med seriell fortynning av ceftriaxone før måling av deres ATP nivåer. Forhåndsinnsamlert GC viste en signifikant høyere overlevelse enn ikke-aggregert eller aggregering forstyrret GC når behandlet med like konsentrasjoner av ceftriaxon eller høyere.Pili-positive stammer som danner større aggregater viste de høyeste ATP-nivåene etter ceftriaxonebehandling sammenlignet med muterte stammer. Uavhengig av belastning testet, levende / død farging før antibiotikabehandling avslørte døde bakterier i stor grad plassert på de ytre lagene av kulturen, mens live GC ble identifisert hovedsakelig innenfor kjernen av ceftriaxone-behandlet aggregater. Som forventet dannet pili-positive bakterier de største aggregatene, mens pili-negative kulturer dannet de minste.Spesielt var pili-positive aggregater fortsatt i live i sine kjernelag etter antibiotikabehandling, mens GC i de små, løse mutantaggregatene var døde. Basert på størrelsen og overlevelsen til GC, kan en korrelasjonsgraf plottes for å undersøke forholdet mellom aggregeringsstørrelsen og antibiotikaoverlevelsen til bakteriene. Sonikering er viktig for å sikre at ATP fra hver enkelt bakterie frigjøres innenfor de tett bundne aggregatene.Ellers vil målingene ikke være konsistente. Det er viktig å plate bakteriene etter at de aggregeres og behandles med antibiotika for å måle både levedyktige og replikeringsdyrne bakterier. Teknikken måler bakterieaggregasjon innflytelse på antibiotika mottakelighet slik at forskere kan utvikle bedre legemidler for behandling av sykdommer.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

The telomere G-overhang structure has been identified in many eukaryotes including yeast, vertebrates, and Trypanosoma brucei. It serves as the substrate ...

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &alpha;-actinin by Confocal Imaging

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human ÃƒÅ½Ã‚Â±-actinin by Confocal Imaging

The Opc protein of Neisseria meningitidis (Nm, meningococcus) is a surface-expressed integral outer membrane protein, which can act as an adhesin and an ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

Undersøkelse av thymus Positiv og negativ seleksjon av flowcytometri

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign  antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the  T cell ...

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Utarbeidelse av en blodkultur Pellet for Rapid Bakteriell Identifisering og antibiotika resistenstesting

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Kvalitative og kvantitative analyser for påvisning og karakterisering av Protein antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Targeting Biofilm Associated<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Bruke Resazurin Basert Narkotika mottakelighet analyse

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority ...

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

Undersøkelse av Host fenotyper i<em&gt; Gambusia affinis</em&gt; Etter antibiotikabehandling

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host ...

Quantitative Polymerase Chain Reaction-based Analyses of Murine Intestinal Microbiota After Oral Antibiotic Treatment

Kvantitativ Polymerase kjedereaksjon-baserte analyser av Murine tarmen bakterieflora etter muntlig antibiotika behandling

The gut microbiota has a central influence on human health. Microbial dysbiosis is associated with many common immunopathologies such as inflammatory ...

Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform

Antibiotika Dereplication bruke antibiotikaresistens plattform

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this ...