Name: quantitative examination of antibiotic susceptibility of neisseria gonorrhoeae aggregates using atp-utilization commercial assays and live/dead staining
Uploaded: 2019-02-08T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining at Jo

Este trabalho foi apoiado por uma concessão do Instituto Nacional de saúde para a Premier e W.S. AI123340. L.-CW, J.W., ar-condicionado, e E.N. foram apoiados em parte/participação no programa de "O primeiro ano inovação & pesquisa experiência" financiado pela Universidade de Maryland. Os financiadores não tinham qualquer papel no estudo design, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Reconhecemos o UMD CBMG Imaging Core para todos os experimentos de microscopia.

1. manutenção de cepas de GC
<ol><li>Raia de cepas de N. gonorrhoeae em ágar GCK com 1% Kellogg suplementos18 (tabela 1, tabela 2) dos estoques de congelador e incubar a 37 ° C com 5% de CO2 para 16-18 h. uso MS11 expressando Opa de fase variável (MS11Opa +), nenhuma Opa (MS11ΔOpa), ou um LOS truncado (MS11ΔLgtE).</li>
	<li>Escolha cuidadosamente pili negativo (colônia sem borda escura) ou positivo (colônia com borda escura) colónias de cada estirpe...

<ol>
	<li>den Heijer, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+overview+of+urogenital,+anorectal+and+oropharyngeal+Neisseria+gonorrhoeae+testing+and+diagnoses+among+different+STI+care+providers:+a+cross-sectional+study.">A comprehensive overview of urogenital, anorectal and oropharyngeal Neisseria gonorrhoeae testing and diagnoses among different STI care providers: a cross-sectional study.</a> BMC Infectious Diseases. 17 (1), (2017).</li><li>Hein, K., Marks, A., Cohen, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymptomatic+gonorrhea:+prevalence+in+a+population+of+urban+adolescents.">Asymptomatic gonorrhea: prevalence in a population of urban adolescents.</a> The Journal of Pediatrics. 90 (4), 634-635 (1977).</li><li>Hananta, I. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gonorrhea+in+Indonesia:+High+Prevalence+of+Asymptomatic+Urogenital+Gonorrhea+but+No+Circulating+Extended+Spectrum+Cephalosporins-Resistant+Neisseria+gonorrhoeae+Strains+in+Jakarta,+Yogyakarta,+and+Denpasar,+Indonesia.">Gonorrhea in Indonesia: High Prevalence of Asymptomatic Urogenital Gonorrhea but No Circulating Extended Spectrum Cephalosporins-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strains in Jakarta, Yogyakarta, and Denpasar, Indonesia.</a> Sexually Transmitted Diseases. 43 (10), 608-616 (2016).</li><li>Chlamydia, W. H. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Opacity+Proteins+Interferes+with+the+Transmigration+of+Neisseria+gonorrhoeae.+across+Polarized+Epithelial+Cells.">Expression of Opacity Proteins Interferes with the Transmigration of Neisseria gonorrhoeae. across Polarized Epithelial Cells.</a> PLoS One. 10 (8), 0134342 (2015).</li><li>LeVan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+a+derivative+of+Neisseria+gonorrhoeae+strain+MS11+devoid+of+all+opa+genes.">Construction and characterization of a derivative of Neisseria gonorrhoeae strain MS11 devoid of all opa genes.</a> Journal of Bacteriology. 194 (23), 6468-6478 (2012).</li><li>Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. 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Pili and zones of adhesion: their relation to gonococcal growth patterns.</a> Journal of Experimental Medicine. 134 (4), 886-906 (1971).</li><li>Herten, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+in+Vitro+Quantification+of+S.+aureus+Biofilms+on+Vascular+Graft+Surfaces.">Rapid in Vitro Quantification of S. aureus Biofilms on Vascular Graft Surfaces.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 2333 (2017).</li><li>Gracia, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+development+of+Staphylococcus+aureus+biofilms+using+slime-producing+variants+and+ATP-bioluminescence+for+automated+bacterial+quantification.">In vitro development of Staphylococcus aureus biofilms using slime-producing variants and ATP-bioluminescence for automated bacterial quantification.</a> Luminescence. 14 (1), 23-31 (1999).</li><li>Webb, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+development.">Cell death in Pseudomonas aeruginosa biofilm development.</a> Journal of Bacteriology. 185 (15), 4585-4592 (2003).</li><li>Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+biofilm+formation+in+an+8-well+chamber+slide.">In vitro biofilm formation in an 8-well chamber slide.</a> Journal of visualized experiments. (47), (2011).</li><li>Wang, L. C., Litwin, M., Sahiholnasab, Z., Song, W., Stein, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neisseria+gonorrhoeae+Aggregation+Reduces+Its+Ceftriaxone+Susceptibility.">Neisseria gonorrhoeae Aggregation Reduces Its Ceftriaxone Susceptibility.</a> Antibiotics (Basel). 7 (2), (2018).</li><li>Lebeaux, D., Ghigo, J. M., Beloin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm-related+infections:+bridging+the+gap+between+clinical+management+and+fundamental+aspects+of+recalcitrance+toward+antibiotics.">Biofilm-related infections: bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 510-543 (2014).</li><li>Hall-Stoodley, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+diagnostic+guidelines+for+biofilm-associated+infections.">Towards diagnostic guidelines for biofilm-associated infections.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 65 (2), 127-145 (2012).</li></ol>

As bactérias podem formar biofilmes durante a infecção do organismo humano. Teste de MIC tradicional pode não refletir a concentração necessária para erradicar as bactérias em um biofilme. Para testar os efeitos de agentes antimicrobianos em um biofilme, métodos baseados em biomassa de biofilme, bem como do chapeamento CFUs podem ser errôneos devido ao impacto da estrutura do biofilme. Por exemplo, o método de chapeamento só funciona se o biofilme pode ser interrompido. Daí, o UFC obtida pode ser menor que o...

Gonorreia é que um comum sexualmente transmissíveis infecção (STI)1. Neisseria gonorrhoeae (GC), uma bactéria Gram-negativa de diplococcal, é o agente causador da doença. Sintomas de infecção genital podem resultar em dor durante a micção, dor genital generalizada e descarga uretral. Infecção é frequentemente assintomática2,3,4,5, e isto permite a colonização estendida. Estas infecções não tratadas são uma preocupação de saúde importantes, como eles têm o potencial para facilitar a transmissão do organismo e isto pode levar a complicações como doença inflamatória pélvica (DIP) e disseminado de Infecção gonocócica (DGI)6. Resistentes aos antibióticos gonorreia é uma crise de saúde pública e um crescente fardo socioeconômico7. Suscetibilidade reduzida às cefalosporinas, resultou em mudança de regime de tratamento de um único antibiótico a terapia dupla, que combina a azitromicina ou doxiciclina com ceftriaxone8. O maior fracasso de ceftriaxona e azitromicina9,10, em combinação com infecções assintomáticas, destaca a necessidade de compreender as falhas do tratamento de gonorreia.
O teste de concentração inibitória mínima (CIM), incluindo o ágar diluição e disco difusão testes, tem sido usado como o exame médico padrão para a identificação de resistência a um antibiótico. No entanto, não está claro se o MIC teste reflete a resistência antibiótica bacteriana in vivo. A formação de biofilmes bacterianos contribui para a sobrevivência de bactérias na presença de concentrações bactericidas de antibiótico: testando o MIC é incapaz de detectar este efeito11. Porque o GC pode formar biofilmes sobre superfícies mucosas12, nós hypothesize que antibiótico suscetibilidade dentro agregados seria diferente daquele visto no GC individual. Além disso, estudos têm mostrado que trifásico moléculas de superfície variável, Pili, associada a opacidade da proteína (Opa), e lipooligosaccharides (LOS), que regulam interações inter bactérias, conduzir a diferentes agregados tamanho13, 14 , 15. a contribuição destes componentes de resistência aos antibióticos não tem sido examinada devido à falta de métodos apropriados.
Atualmente, existem vários métodos para medir a erradicação do biofilme. O método quantitativo mais amplamente utilizado é medindo as mudanças na biomassa usando cristal violeta mancha16. No entanto, o método requer manipulação experimental significativa, que potencialmente pode gerar erros no experimento repetições17. O método de coloração ao vivo/morto usado aqui permite a visualização de bactérias vivas e mortas e sua distribuição dentro do biofilme. No entanto, a estrutura do biofilme pode posar como uma barreira física que reduz a penetração do corante. Portanto, para quantificar as bactérias ao vivo/morto dentro de um grupo, a coloração é limitada a pequenas biofilmes seu precursor-microcolonies ou agregações. Outros métodos, incluindo os testes de difusão diluição e disco de ágar, não são capazes de medir os efeitos de agregação. Para examinar a susceptibilidade de GC dentro de agregação após a exposição aos antibióticos, um método ideal seria preciso ter ambos um ensaio quantitativo que pode medir vivem bactérias e visualizar sua distribuição.
O procedimento descrito aqui combina uma medição de utilização de ATP e ao vivo/morto coloração do ensaio para quantitativamente e examinar visualmente a susceptibilidade de GC dentro agregados na presença de antibióticos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:837px;" width="837">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">100x Kellogg&#39;s supplement</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Agar</td>
			<td style="width:229px;">United States Biological</td>
			<td style="width:119px;">A0930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">BacTiter Assay&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">G8232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Ceftriaxone</td>
			<td style="width:229px;">TCI</td>
			<td style="width:119px;">C2226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Difco GC medium base&#160;</td>
			<td style="width:229px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">228950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ferric nitrate, nonahydrate&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">254223-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td style="width:229px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP350-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine Crystalline Powder</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP379-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BacLight live/dead staining</td>
			<td style="width:229px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">L7012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MS11 Neisseria gonorrhoeae strain</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>kindly provided by Dr. Herman Schneider, Walter Reed Army Institute for Research</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:323px;">Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P290-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP329-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteose Peptone&#160;</td>
			<td style="width:229px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">211693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S671-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Soluble Starch</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S9765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thiamine pyrophosphate</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C8754-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Equipment</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Petri Dishes</td>
			<td style="width:229px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">25384-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">8-well coverslip-bottom chamber&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">155411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well tissue culture plates&#160;</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td style="width:119px;">3370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:323px;">Biosafety Cabinet (NU-425-600 Class II, A2 Laminar Flow Biohazard Hood)</td>
			<td style="width:229px;">Nuaire</td>
			<td style="width:119px;">32776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:323px;">CO2 Incubator</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">&#160;Model 3530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:323px;">Confocal microscope equipped with live imaging chamber</td>
			<td style="width:229px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">SP5X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning&#160; 96 Well Black Polystyrene Microplate&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Glomax Illuminator&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Pipette tips (0.1-10 &#181;L)</td>
			<td style="width:229px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-717-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipette tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:119px;">83007-382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Pipette tips (200 &#181;L)</td>
			<td style="width:229px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">53509-007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectrophotometer Ultrospec 2000 UV</td>
			<td style="width:229px;">Pharmacia Biotech</td>
			<td style="width:119px;">80-2106-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Sterile 15 ml conical tubes</td>
			<td style="width:229px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">21008-216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Sterile Microcentrifuge Tubes (1.7 mL)</td>
			<td style="width:229px;">Sorenson BioScience</td>
			<td style="width:119px;">16070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile polyester-tipped applicators</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:323px;">Sonicator</td>
			<td style="width:229px;">Kontes</td>
			<td style="width:119px;">Equivelent to 9110001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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quantitative examination of antibiotic susceptibility of neisseria gonorrhoeae aggregates using atp-utilization commercial assays and live/dead staining

O surgimento de resistentes aos antibióticos Neisseria gonorrhoeae (GC) é uma ameaça para a saúde no mundo e destaca a necessidade de identificar as pessoas que não o tratamento. Esta bactéria Gram-negativa causa a gonorreia exclusivamente em seres humanos. Durante a infecção, é capaz de agregados de forma e/ou biofilmes. O teste de concentração inibitória mínima (CIM) é usado para determinar a susceptibilidade aos antibióticos e definir o tratamento adequado. No entanto, o mecanismo de erradicação em vivo e sua relação com os resultados de laboratório não são conhecidos. Foi desenvolvido um método que examina como GC agregação afeta a susceptibilidade aos antibióticos e mostra a relação entre tamanho de agregação e suscetibilidade aos antibióticos. Quando agregado de GC, são mais resistentes ao antibiótico matar, com bactérias no centro sobrevivendo ceftriaxona tratamento melhor do que aqueles na periferia. Os dados indicam que a agregação de N. gonorrhoeae pode reduzir sua susceptibilidade à Ceftriaxona, que não é reflectida usando os métodos MIC de baseados em placa de ágar padrão. O método utilizado neste estudo permitirá aos pesquisadores testar susceptibilidade bacteriana em condições clinicamente relevantes.

Foram utilizados dois métodos: um ensaio de utilização do ATP e um ensaio de coloração ao vivo/morto. Os resultados podem ser combinados ou usados individualmente pela análise de sobrevivência bacteriana dentro agregados após tratamento com antibióticos. O ensaio de utilização de ATP foi mostrado para medir com precisão viáveis bactérias S. aureus biofilmes20,21. Aqui, MS11Opa + Pil + estirpe foi usado para ...

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Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

Um simples ensaio de medição da ATP e método de coloração ao vivo/morto foram usados para quantificar e Visualizar Neisseria gonorrhoeae sobrevivência após o tratamento com ceftriaxona. Este protocolo pode ser estendido para examinar os efeitos antimicrobianos de qualquer antibiótico e pode ser usado para definir a concentração inibitória mínima dos antibióticos em biofilmes bacterianos.

Exame quantitativos de susceptibilidade antibiótica de Neisseria gonorrhoeae agregados usando ATP-utilização comercial ensaios e coloração Live/mortos

The emergence of antibiotic resistant Neisseria gonorrhoeae (GC) is a worldwide health threat and highlights the need to identify individuals who fail ...

Esta técnica nos permite medir a suscetibilidade de antibióticos em condições mais clinicamente relevantes. A técnica também nos permite determinar a verdadeira concentração de antibióticos que podem matar bactérias em agregados. Esta técnica pode ser aplicada para determinar a concentração necessária para eliminar agregados de GC.O método também pode ser aplicado à medição da suscetibilidade antimicrobiana de qualquer bactéria capaz de formar agregados. Preste atenção às etapas de lise para garantir que a lise esteja completa. Caso contrário, o ensaio de medição ATP subestimará o número de bactérias viáveis.A visualização desse método permitirá que outros pesquisadores sigam e repliquem este experimento com consistência. Comece por estilhaços de Neisseria gonorrhoeae, ou cepas GC, em ágar GCK suplementado com 1%Kellogg para uma incubação de 16 a 18 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Na manhã seguinte, use um microscópio leve para selecionar cuidadosamente colônias pili-negativas sem bordas escuras ou colônias pili-positivas com bordas escuras de cada placa, e coloque as colônias escolhidas em novas placas GCK para uma cultura de 16 a 18 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.Na manhã seguinte, use um aplicador estéril para coletar colônias de GC de cada placa e resuspensar cada cotonete em caldo quente complementado com 4,2% de bicarbonato de sódio e 1% solução Kellogg. Meça a densidade óptica em 650 nanômetros, ou OD650, para determinar a concentração das bactérias suspensas e ajuste a concentração de GC para cerca de uma vez 10 para as oito unidades formadoras de colônias por mililitro. Em seguida, adicione 99 microliters da suspensão gc em poços individuais de uma placa de 96 poços e permita que as bactérias se agreguem a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por seis horas.No final da incubação, adicione um microliter de ceftriaxona diluída em série a cada poço deixando alguns poços não tratados para servir como controles e devolver a placa à incubadora por mais 24 horas. No dia seguinte, sonicar a suspensão em cada poço três vezes a 144 watts e 20 kilohertz por cinco segundos por sônica e adicionar 100 microliters de reagente de brilho de utilização ATP comercialmente disponível a cada poço. Transfira cuidadosamente 150 microliters de mistura de cada poço em poços individuais de uma nova microplaca preta de 96 poços e meça a absorção de cada poço a 560 nanômetros em um leitor de placas.Em seguida, calcule a taxa de sobrevivência pela razão da leitura obtida após o tratamento de antibióticos em série para a leitura dos poços não tratados. Para visualização dos agregados gc vivos/mortos, use um aplicador estéril para coletar GC das placas cultivadas durante a noite e resuspensar o GC em meio GCP pré-armado complementado com 1%Kellogg. Meça o OD650 por espectrofotometria e ajuste a concentração para aproximadamente uma vez 10 para as sete unidades formadoras de colônias por mililitro.Em seguida, adicione 198 microliters de suspensão GC em câmaras de oito poços e incuba as câmaras a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por seis horas. Ao final da incubação, trate as bactérias com dois microlitadores de ceftriaxona por condição de agregação e devolva as câmaras à incubadora para o período de incubação experimental adequado. Ao final da incubação, adicione 0,6 microliters de solução de coloração viva/morta em cada poço e devolva as câmaras à incubadora por mais 20 minutos.Em seguida, use um microscópio confocal para obter imagens da série Z. Para medir o tamanho dos agregados gc, abra a primeira imagem no ImageJ e selecione linhas à mão livre para circular a área de cada agregação na imagem. Clique em analisar e medir.O tamanho dos agregados será indicado sob a coluna da área. Para quantificar a razão de intensidade de fluorescência da coloração viva para a morta em cada agregado, clique em analisar e definir medições e verifique a densidade integrada na janela popup. Clique em OK e clique na ferramenta imagem, cor e canais.Selecione a cor e o canal um como a fluorescência para coloração de bactérias mortas. Selecione linhas à mão livre para circular a área de cada agregação e clique em analisar e medir para obter a razão de intensidade de fluorescência para cada agregado na coluna de densidade integrada. Selecione o canal dois para a fluorescência para a coloração bacteriana viva e meça a intensidade da fluorescência em cada agregado como apenas demonstrado.Em seguida, divida os dados de intensidade de fluorescência viva pelos dados de intensidade de fluorescência morta para obter a razão de intensidade de fluorescência viva para morta. Neste experimento representativo, pili não agregado positivo, acumulado pili positivo ou agregado e interrompido pili positivo bactérias foram tratados com diluições seriais de ceftriaxona antes da medição de seus níveis DE ATP. GC pré-agregado demonstrou uma sobrevida significativamente maior do que o GC não agregado ou de agregação interrompido gc quando tratado com concentrações iguais de ceftriaxona ou superior.Cepas pili-positivas que formam agregados maiores apresentaram os mais altos níveis de ATP após o tratamento ceftriaxona em comparação com as cepas mutantes. Independentemente da cepa testada, a coloração viva/morta antes do tratamento com antibióticos revelou bactérias mortas em grande parte localizadas nas camadas externas da cultura, enquanto a GC viva foi identificada principalmente dentro do núcleo de agregados tratados com ceftriaxona. Como esperado, as bactérias pili-positivas formaram os maiores agregados, enquanto as culturas pili-negativas formaram-se as menores.Notavelmente, os agregados pili-positivos ainda estavam vivos em suas camadas principais após o tratamento com antibióticos, enquanto gc nos pequenos agregados mutantes soltos estavam mortos. Com base no tamanho e sobrevivência do GC, um gráfico de correlação pode ser traçado para examinar a relação entre o tamanho da agregação e a sobrevivência de antibióticos das bactérias. A sonicação é importante para garantir que a ATP de cada bactéria individual seja liberada dentro dos agregados firmemente vinculados.Caso contrário, as medidas não serão consistentes. É importante emplacar as bactérias após o agresso e são tratadas com antibióticos para medir tanto as bactérias viáveis quanto as capazes de replicação. A técnica mede a influência da agregação de bactérias na suscetibilidade a antibióticos, permitindo que os pesquisadores desenvolvam melhores medicamentos para o tratamento de doenças.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

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Exame da estrutura G-Telomere saliência na Trypanosoma brucei</em

The telomere G-overhang structure has been identified in many eukaryotes including yeast, vertebrates, and Trypanosoma brucei. It serves as the substrate ...

Imunologia e Infecção

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &alpha;-actinin by Confocal Imaging

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human ÃƒÅ½Ã‚Â±-actinin by Confocal Imaging

Visualização e Quantificação de Interações intracelulares de Neisseria meningitidis Humanos e α-actinina por Imagem Confocal

The Opc protein of Neisseria meningitidis (Nm, meningococcus) is a surface-expressed integral outer membrane protein, which can act as an adhesin and an ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Análise quantitativa de todos Influenza Tipo A Hemaglutininas Virais e neuraminidases usando anticorpos Universal em Ensaios Blot simples slot

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

Exame de seleção positiva e negativa Tímico por citometria de fluxo

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign  antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the  T cell ...

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Preparação de uma Cultura Pellet sangue para rápida identificação bacteriana e Antibiótico Teste à Susceptibilidade

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Qualitativos e quantitativos Os ensaios para a detecção e caracterização de antimicrobianos Proteína

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Segmentação de biofilme Associated<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Usando resazurina Baseado Ensaio Drogas susceptibilidade

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority ...

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

Exame de fenótipos de acolhimento em<em&gt; Gambusia affinis</em&gt; Após o tratamento antibiótico

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host ...

Quantitative Polymerase Chain Reaction-based Analyses of Murine Intestinal Microbiota After Oral Antibiotic Treatment

Polimerase quantitativos baseados na reação em cadeia análises de murino Microbiota Intestinal após o tratamento antibiótico Oral

The gut microbiota has a central influence on human health. Microbial dysbiosis is associated with many common immunopathologies such as inflammatory ...

Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform

Desreferência antibiótica usando a plataforma de resistência a antibióticos

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this ...