Name: quantitative examination of antibiotic susceptibility of neisseria gonorrhoeae aggregates using atp-utilization commercial assays and live/dead staining
Uploaded: 2019-02-08T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining at Jo

Эта работа была поддержана грант от национального института здравоохранения д.х.н. и в.с. AI123340. Л-К.В, J.W., переменного тока, и е.н. были поддержаны в части/участие в программе «Первый год инноваций и исследований опыт», финансируемого университета штата Мэриленд. Спонсоры имел никакой роли в исследования дизайн, сбор данных и анализ, решение публиковать, или подготовка рукописи. Мы признаем UMD CBMG изображений ядра для всех экспериментов микроскопии.

1. Общее обслуживание штаммов GC
<ol><li>Полоска штаммы N. gonorrhoeae GCK агар с 1% Келлогг дополняет18 (Таблица 1, таблица 2) из морозильника запасов и инкубировать 37 ° C с 5% CO2 для 16-18 ч. Использование MS11 выражая фаза переменная опа (MS11Opa +), без опа (MS11ΔOpa), или усеченных Ло?...

<ol>
	<li>den Heijer, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+overview+of+urogenital,+anorectal+and+oropharyngeal+Neisseria+gonorrhoeae+testing+and+diagnoses+among+different+STI+care+providers:+a+cross-sectional+study.">A comprehensive overview of urogenital, anorectal and oropharyngeal Neisseria gonorrhoeae testing and diagnoses among different STI care providers: a cross-sectional study.</a> BMC Infectious Diseases. 17 (1), (2017).</li><li>Hein, K., Marks, A., Cohen, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymptomatic+gonorrhea:+prevalence+in+a+population+of+urban+adolescents.">Asymptomatic gonorrhea: prevalence in a population of urban adolescents.</a> The Journal of Pediatrics. 90 (4), 634-635 (1977).</li><li>Hananta, I. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gonorrhea+in+Indonesia:+High+Prevalence+of+Asymptomatic+Urogenital+Gonorrhea+but+No+Circulating+Extended+Spectrum+Cephalosporins-Resistant+Neisseria+gonorrhoeae+Strains+in+Jakarta,+Yogyakarta,+and+Denpasar,+Indonesia.">Gonorrhea in Indonesia: High Prevalence of Asymptomatic Urogenital Gonorrhea but No Circulating Extended Spectrum Cephalosporins-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strains in Jakarta, Yogyakarta, and Denpasar, Indonesia.</a> Sexually Transmitted Diseases. 43 (10), 608-616 (2016).</li><li>Chlamydia, W. H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlamydia+trachomatis,+Neisseria+gonorrhoeae,+syphilis+and+Trichomonas+vaginalis.+Methods+and+results+used+by+WHO+to+generate+2005+estimates.+World+Health+Organisation,+2011.+Prevalence+and+incidence+of+selected+sexually+transmitted+infections.">Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, syphilis and Trichomonas vaginalis. Methods and results used by WHO to generate 2005 estimates. World Health Organisation, 2011. Prevalence and incidence of selected sexually transmitted infections.</a> World Health Organisation. , (2011).</li><li>Mayor, M. T., Roett, M. A., Uduhiri, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+management+of+gonococcal+infections.">Diagnosis and management of gonococcal infections.</a> American Family Physician. 86 (10), 931-938 (2012).</li><li>Alirol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidrug-resistant+gonorrhea:+A+research+and+development+roadmap+to+discover+new+medicines.">Multidrug-resistant gonorrhea: A research and development roadmap to discover new medicines.</a> PLOS Medicine. 14 (7), (2017).</li><li>Workowski, K. A., Bolan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexually+transmitted+diseases+treatment+guidelines,+2015.">Sexually transmitted diseases treatment guidelines, 2015.</a> MMWR Recommendations and Reports. 64, 1-137 (2015).</li><li>Lahra, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+Recognition+of+Internationally+Disseminated+Ceftriaxone-Resistant+Neisseria+gonorrhoeae+Strain.">Cooperative Recognition of Internationally Disseminated Ceftriaxone-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strain.</a> Emerging Infectious Diseases. 24 (4), (2018).</li><li>Wi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+resistance+in+Neisseria+gonorrhoeae:+Global+surveillance+and+a+call+for+international+collaborative+action.">Antimicrobial resistance in Neisseria gonorrhoeae: Global surveillance and a call for international collaborative action.</a> PLOS Medicine. 14 (7), 1002344 (2017).</li><li>Singh, S., Singh, S. K., Chowdhury, I., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+Mechanism+of+Bacterial+Biofilms+Resistance+to+Antimicrobial+Agents.">Understanding the Mechanism of Bacterial Biofilms Resistance to Antimicrobial Agents.</a> Open Microbiology Journal. 11, 53-62 (2017).</li><li>Greiner, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+Formation+by+Neisseria+gonorrhoeae.">Biofilm Formation by Neisseria gonorrhoeae.</a> Infection and Immunity. 73 (4), 1964-1970 (2005).</li><li>Zollner, R., Oldewurtel, E. R., Kouzel, N., Maier, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+and+antigenic+variation+govern+competition+dynamics+through+positioning+in+bacterial+colonies.">Phase and antigenic variation govern competition dynamics through positioning in bacterial colonies.</a> Scientific Reports. 7 (1), (2017).</li><li>Stein, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Opacity+Proteins+Interferes+with+the+Transmigration+of+Neisseria+gonorrhoeae.+across+Polarized+Epithelial+Cells.">Expression of Opacity Proteins Interferes with the Transmigration of Neisseria gonorrhoeae. across Polarized Epithelial Cells.</a> PLoS One. 10 (8), 0134342 (2015).</li><li>LeVan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+a+derivative+of+Neisseria+gonorrhoeae+strain+MS11+devoid+of+all+opa+genes.">Construction and characterization of a derivative of Neisseria gonorrhoeae strain MS11 devoid of all opa genes.</a> Journal of Bacteriology. 194 (23), 6468-6478 (2012).</li><li>Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+and+analyzing+static+biofilms.">Growing and analyzing static biofilms.</a> Curr Protoc Microbiol. , (2005).</li><li>Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+multiple+methods+for+quantification+of+microbial+biofilms+grown+in+microtiter+plates.">Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates.</a> Journal of Microbiological Methods. 72 (2), 157-165 (2008).</li><li>White, L. A., Kellogg, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neisseria+Gonorrhoeae+Identification+in+Direct+Smears+by+a+Fluorescent+Antibody-Counterstain+Method.">Neisseria Gonorrhoeae Identification in Direct Smears by a Fluorescent Antibody-Counterstain Method.</a> Journal of Applied Microbiology. 13, 171-174 (1965).</li><li>Swanson, J., Kraus, S. J., Gotschlich, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+gonococcus+infection.+I.+Pili+and+zones+of+adhesion:+their+relation+to+gonococcal+growth+patterns.">Studies on gonococcus infection. I. Pili and zones of adhesion: their relation to gonococcal growth patterns.</a> Journal of Experimental Medicine. 134 (4), 886-906 (1971).</li><li>Herten, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+in+Vitro+Quantification+of+S.+aureus+Biofilms+on+Vascular+Graft+Surfaces.">Rapid in Vitro Quantification of S. aureus Biofilms on Vascular Graft Surfaces.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 2333 (2017).</li><li>Gracia, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+development+of+Staphylococcus+aureus+biofilms+using+slime-producing+variants+and+ATP-bioluminescence+for+automated+bacterial+quantification.">In vitro development of Staphylococcus aureus biofilms using slime-producing variants and ATP-bioluminescence for automated bacterial quantification.</a> Luminescence. 14 (1), 23-31 (1999).</li><li>Webb, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+development.">Cell death in Pseudomonas aeruginosa biofilm development.</a> Journal of Bacteriology. 185 (15), 4585-4592 (2003).</li><li>Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+biofilm+formation+in+an+8-well+chamber+slide.">In vitro biofilm formation in an 8-well chamber slide.</a> Journal of visualized experiments. (47), (2011).</li><li>Wang, L. C., Litwin, M., Sahiholnasab, Z., Song, W., Stein, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neisseria+gonorrhoeae+Aggregation+Reduces+Its+Ceftriaxone+Susceptibility.">Neisseria gonorrhoeae Aggregation Reduces Its Ceftriaxone Susceptibility.</a> Antibiotics (Basel). 7 (2), (2018).</li><li>Lebeaux, D., Ghigo, J. M., Beloin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm-related+infections:+bridging+the+gap+between+clinical+management+and+fundamental+aspects+of+recalcitrance+toward+antibiotics.">Biofilm-related infections: bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 510-543 (2014).</li><li>Hall-Stoodley, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+diagnostic+guidelines+for+biofilm-associated+infections.">Towards diagnostic guidelines for biofilm-associated infections.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 65 (2), 127-145 (2012).</li></ol>

Бактерии могут образовывать биоплёнки во время инфекции человеческого тела. Традиционные MIC тестирования может не отражать концентрации, необходимые для искоренения бактерий в биопленки. Чтобы проверить влияние антибиотиков на биопленки, методы, основанные на биопленки биомассы, а т?...

Гонорея является общим половым путем инфекции (STI)1. Neisseria gonorrhoeae (GC), грамотрицательные бактерии diplococcal, является возбудителем этого заболевания. Симптомы инфекции половых органов может привести к боли во время мочеиспускания, обобщенные половых боль и мочеиспускательного канала разряда. Инфекция часто бессимптомной2,3,,45, и это позволяет для расширенной колонизации. Эти необработанные инфекций являются основных проблем системы здравоохранения, поскольку они имеют потенциал для облегчения передачи организма, и это может привести к осложнениям, например, воспалительные заболевания тазовых органов (PID) и распространены гонококковая инфекция (DGI)6. Устойчивых к антибиотикам гонорея — кризис общественного здравоохранения и растущее социально-экономическое бремя7. Уменьшенной восприимчивости к цефалоспорины привело к изменению режима лечения от одного антибиотика для двойной терапии, которая сочетает в себе доксициклина или азитромицина с Цефтриаксон8. Увеличение неудача Цефтриаксон и азитромицин9,10, в сочетании с бессимптомной инфекции, подчеркивает необходимость понимания неудач лечения гонореи.
Минимальная концентрация тормозной (MIC) теста, включая агар разрежения и диск диффузии испытаний, был использован как стандартный медицинский тест для определения устойчивости к антибиотикам. Тем не менее неясно, если тест MIC отражает бактерий к антибиотикам в естественных условиях. Формирование бактериальные биопленки способствует выживания бактерий в присутствии бактерицидные концентрации антибиотика: MIC тестирования не удается обнаружить этот эффект11. Потому что GC может формировать биоплёнки слизистой поверхности12, мы предполагаем, что антибиотика чувствительности в пределах агрегатов будет отличаться от что видел в отдельных GC. Кроме того исследования показали, что трехфазные переменной поверхности молекул, пили, непрозрачность связанные белком (Opa), и lipooligosaccharides (Лос), которые регулируют взаимодействие между бактерия, привести к различным размером агрегатов13, 14 , 15. вклад этих компонентов к антибиотикам не были рассмотрены из-за отсутствия надлежащих методов.
В настоящее время существует несколько методов для измерения искоренение биопленки. Наиболее широко используемый количественных методом является измерение изменений в биомассе, используя фиолетовый кристалл, окрашивание16. Однако этот метод требует значительных экспериментальных манипуляций, который потенциально может генерировать ошибки в эксперимент повторяется17. Метод окрашивания жить/мертвые, используемый здесь позволяет визуализации живых и мертвых бактерий и их распределения в рамках биопленки. Однако структура биопленки может представлять как физический барьер, который уменьшает проникновение красителя. Таким образом для количественной оценки жить/Мертвые бактерии внутри группы, окрашивание ограничивается малых биоплёнки или его предшественником microcolonies или агрегатов. Другие методы, включая тесты диффузии агар разрежения и диск, не способны измерить воздействие агрегации. Для изучения GC восприимчивость внутри агрегата после антибиотикотерапии экспозиции, идеальный метод будет необходимо иметь оба количественных assay который может измерить живут бактерии и визуализировать их распределения.
Процедуру, описанную здесь сочетает АТФ использование измерения и жить/мертвые пятнать количественно assay для и визуально изучить вызовы GC восприимчивость в агрегаты присутствии антибиотики.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:837px;" width="837">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">100x Kellogg&#39;s supplement</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Agar</td>
			<td style="width:229px;">United States Biological</td>
			<td style="width:119px;">A0930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">BacTiter Assay&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">G8232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Ceftriaxone</td>
			<td style="width:229px;">TCI</td>
			<td style="width:119px;">C2226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Difco GC medium base&#160;</td>
			<td style="width:229px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">228950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ferric nitrate, nonahydrate&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">254223-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td style="width:229px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP350-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine Crystalline Powder</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP379-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BacLight live/dead staining</td>
			<td style="width:229px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">L7012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MS11 Neisseria gonorrhoeae strain</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>kindly provided by Dr. Herman Schneider, Walter Reed Army Institute for Research</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:323px;">Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P290-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP329-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteose Peptone&#160;</td>
			<td style="width:229px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">211693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S671-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Soluble Starch</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S9765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thiamine pyrophosphate</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C8754-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Equipment</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Petri Dishes</td>
			<td style="width:229px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">25384-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">8-well coverslip-bottom chamber&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">155411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well tissue culture plates&#160;</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td style="width:119px;">3370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:323px;">Biosafety Cabinet (NU-425-600 Class II, A2 Laminar Flow Biohazard Hood)</td>
			<td style="width:229px;">Nuaire</td>
			<td style="width:119px;">32776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:323px;">CO2 Incubator</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">&#160;Model 3530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:323px;">Confocal microscope equipped with live imaging chamber</td>
			<td style="width:229px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">SP5X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning&#160; 96 Well Black Polystyrene Microplate&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Glomax Illuminator&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Pipette tips (0.1-10 &#181;L)</td>
			<td style="width:229px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-717-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipette tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:119px;">83007-382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Pipette tips (200 &#181;L)</td>
			<td style="width:229px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">53509-007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectrophotometer Ultrospec 2000 UV</td>
			<td style="width:229px;">Pharmacia Biotech</td>
			<td style="width:119px;">80-2106-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Sterile 15 ml conical tubes</td>
			<td style="width:229px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">21008-216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Sterile Microcentrifuge Tubes (1.7 mL)</td>
			<td style="width:229px;">Sorenson BioScience</td>
			<td style="width:119px;">16070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile polyester-tipped applicators</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:323px;">Sonicator</td>
			<td style="width:229px;">Kontes</td>
			<td style="width:119px;">Equivelent to 9110001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative examination of antibiotic susceptibility of neisseria gonorrhoeae aggregates using atp-utilization commercial assays and live/dead staining

Появление устойчивых к антибиотикам Neisseria gonorrhoeae (GC) представляет собой угрозу для здоровья во всем мире и подчеркивается необходимость выявления лиц, которые не лечение. Это грамотрицательные бактерии вызывает гонорею исключительно в организме человека. Во время инфекции она способна формы агрегатов и/или биопленки. Минимальная концентрация тормозной (MIC) тест используется для определения чувствительности к антибиотикам и определить соответствующее лечение. Однако механизм ликвидации в естественных условиях и его связь с лабораторных результатов не известны. Был разработан метод, который проверяет как GC агрегации влияет на чувствительности к антибиотикам и показывает связь между совокупный размер и чувствительности к антибиотикам. Когда GC агрегат, они более устойчивы к антибиотикам убийства, с бактериями в центре выжившие Цефтриаксон лечения лучше, чем те, на периферии. Эти данные указывают, что N. gonorrhoeae агрегирование может уменьшить свою подверженность цефтриаксон, который не отражается Стандартный агар пластины-методов на основе MIC. Метод, используемый в данном исследовании позволит исследователям для тестирования бактериальных Восприимчивость клинически соответствующих условиях.

Использовались два метода: assay использования СПС и жить/мертвые окрашивание assay. Результаты можно либо объединить, или индивидуально используется для изучения бактериальных выживания в рамках агрегатов после лечения антибиотиками. Было показано, что СПС использовани...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining at Jo

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

Простой АТФ измерительные пробирного и/мертвые окрашивания метода были использованы для количественной оценки и визуализировать Neisseria gonorrhoeae выживание после лечения с Цефтриаксон. Этот протокол может быть расширен для изучения антимикробного воздействия любой антибиотик и может использоваться для определения минимальной ингибирующее концентрацию антибиотиков в бактериальные биопленки.

Количественные экспертизы по чувствительности к антибиотикам Neisseria gonorrhoeae агрегатов с помощью АТФ использования коммерческих анализов и Live/мертвые пятнать

The emergence of antibiotic resistant Neisseria gonorrhoeae (GC) is a worldwide health threat and highlights the need to identify individuals who fail ...

Этот метод позволяет измерять восприимчивость к антибиотикам в более клинически значимых условиях. Техника также позволяет нам определить истинную концентрацию антибиотиков, которые могут убивать бактерии в совокупности. Этот метод может быть применен для определения концентрации, необходимой для устранения агрегатов GC.Метод также может быть применен для измерения противомикробной восприимчивости любых бактерий, способных образовывать агрегаты. Обратите пристальное внимание на этапы лиза, чтобы обеспечить полноту лиза. В противном случае АТФ измерения анализа будет недооценивать количество жизнеспособных бактерий.Визуализация этого метода позволит другим исследователям следовать и повторить этот эксперимент с последовательностью. Начните с полос Neisseria гонореи, или GC штаммов, на GCK агар дополняется 1%Kellogg для 16 до 18-часовой инкубации при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа. На следующее утро, используйте световой микроскоп, чтобы тщательно выбрать пили-отрицательных колоний без темных краев или пили-положительных колоний с темными краями от каждой пластины, и полоса взял колоний на новые пластины GCK для 16 до 18-часовой культуры при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа.На следующее утро используйте стерильный аппликатор для сбора колоний GC с каждой пластины и повторно поместью каждого тампона в теплом бульоне, дополненном 4,2% бикарбоната натрия и 1% раствора Kellogg. Измерьте оптическую плотность на 650 нанометров, или OD650, чтобы определить концентрацию подвесных бактерий и настроить концентрацию GC примерно в один раз от 10 до восьми единиц колонии, образующих единицы на миллилитр. Далее добавьте 99 микролитров подвески GC в отдельные скважины пластины 96 скважин и позвольте бактериям агрегировать при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислом газе в течение шести часов.В конце инкубации добавьте один микролитер серийно разбавленного цефтриаксона в каждую скважину, оставляя некоторые скважины необработанными, чтобы служить в качестве элементов управления, и верните пластину в инкубатор еще на 24 часа. На следующий день, sonicate подвески в каждом хорошо три раза на 144 Вт и 20 килогерц в течение пяти секунд на sonication и добавить 100 микролитров коммерчески доступных АТФ использования свечения реагент для каждой хорошо. Тщательно перенесите 150 микролитров смеси из каждой скважины в отдельные скважины нового 96-ну черного микроплоцита и измерьте абсорбаность каждой скважины на 560 нанометров на считыватель пластин.Затем вычислите выживаемость по соотношению показаний, полученных после серийного лечения антибиотиками, к показанию из необработанных скважин. Для визуализации живых / мертвых агрегатов GC, используйте стерильный аппликатор для сбора GC из ночных культурных пластин и повторного использования GC в довоенной среде GCP дополнен 1%Kellogg. Измерьте OD650 по спектрофотометрии и отрегулируйте концентрацию примерно в один раз 10 до семи колонийообразующих единиц на миллилитр.Затем добавьте 198 микролитров подвески GC в восьми-хорошо крышки нижних камер и инкубировать камеры при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислого газа в течение шести часов. В конце инкубации обработать бактерии двумя микролитров цефтриаксона на состояние агрегации и вернуть камеры в инкубатор для соответствующего экспериментального инкубационный период. В конце инкубации добавьте в каждую колодец 0,6 микролитров раствора живого/мертвого окрашивания и верните камеры в инкубатор еще на 20 минут.Затем используйте конфокальный микроскоп для получения изображений серии z. Для измерения размера агрегатов GC откройте первое изображение в ImageJ и выберите линии от руки, чтобы объедить область каждой агрегации изображения. Нажмите проанализировать и измерить.Размер агрегатов будет указан под столбцей области. Для количественной оценки соотношения интенсивности флуоресценции живого и мертвого окрашивания в каждом агрегате щелкните проанализируйте и установите измерения и проверьте интегрированную плотность всплывающих окон. Нажмите OK и нажмите изображение, цвет и каналы инструмент.Выберите цвет и канал один, как флуоресценция для окрашивания мертвых бактерий. Выберите линии от руки, чтобы объедить область каждой агрегации и щелкните анализ и измерение, чтобы получить соотношение интенсивности флуоресценции для каждого агрегата в интегрированной колонке плотности. Выберите второй канал для флуоресценции для живого бактериального окрашивания и измерить интенсивность флуоресценции в каждом агрегате, как только что продемонстрировано.Затем разделите живые данные о интенсивности флуоресценции на данные о мертвой флуоресценции, чтобы получить живое и мертвое соотношение интенсивности флуоресценции. В этом репрезентативном эксперименте, nonaggregated pili положительный, агрегированный pili положительный или агрегированный и нарушенный pili положительные бактерии были обработаны с серийными разбавлениями ceftriaxone перед измерением их уровней АТФ. Преагрегированный GC продемонстрировал значительно более высокую выживаемость, чем неагрегированные или агрегации нарушенных GC при лечении с равными концентрациями цефтриаксона или выше.Пили-положительные штаммы, которые образуют большие агрегаты выставлены самые высокие уровни АТФ после лечения цефтриаксона по сравнению с мутантными штаммами. Независимо от штамма испытания, живые / мертвые окрашивания до лечения антибиотиками показали мертвых бактерий в значительной степени расположены на внешних слоях культуры, в то время как живые GC были определены в основном в рамках ядра цефтриаксона обработанных агрегатов. Как и ожидалось, пили-положительные бактерии образуют самые большие агрегаты, в то время как пили-отрицательные культуры образуются самые маленькие.Примечательно, что пили-положительные агрегаты были еще живы в своих основных слоях после лечения антибиотиками, в то время как GC в небольших, свободных мутантных агрегатах были мертвы. Основываясь на размере и выживании ГК, график корреляции может быть построен для изучения взаимосвязи между размером агрегации и выживаемости антибиотиков бактерий. Sonication имеет важное значение для убедившись, что АТФ из каждой отдельной бактерии высвобождается в тесно связанных агрегатов.В противном случае измерения не будут последовательными. Важно, чтобы пластины бактерий после их агрегирования и лечат антибиотиками для измерения как жизнеспособных и репликации способных бактерий. Методика измеряет влияние агрегации бактерий на восприимчивость к антибиотикам, позволяя исследователям разрабатывать более лучшие препараты для лечения заболеваний.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

Рассмотрение теломер G-навес структуры в Trypanosoma brucei</em

The telomere G-overhang structure has been identified in many eukaryotes including yeast, vertebrates, and Trypanosoma brucei. It serves as the substrate ...

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &alpha;-actinin by Confocal Imaging

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human ÃƒÅ½Ã‚Â±-actinin by Confocal Imaging

Визуализация и количественной оценки внутриклеточного Взаимодействия Neisseria meningitidis И правам α-актинина по конфокальной микроскопии

The Opc protein of Neisseria meningitidis (Nm, meningococcus) is a surface-expressed integral outer membrane protein, which can act as an adhesin and an ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Количественный анализ всех гриппа типа Вирусный Hemagglutinins и нейраминидазы использованием универсального антител в простом Анализы Blot Слот

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

Экспертиза тимуса позитивной и негативной селекции с помощью проточной цитометрии

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign  antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the  T cell ...

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Подготовка крови культуры Пелле для быстрого идентификации бактерий и чувствительности к антибиотикам

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Качественный и количественный анализы для обнаружения и определения характеристик белка Противомикробные

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Ориентация биопленки Associated<em&gt; Стафилококк</em&gt; Использование ресазурин На основе лекарственной чувствительности анализа

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority ...

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

Исследование хост фенотипы в<em&gt; Gambusia аШшз</em&gt; После Лечение антибиотиками

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host ...

Quantitative Polymerase Chain Reaction-based Analyses of Murine Intestinal Microbiota After Oral Antibiotic Treatment

Количественные полимеразной цепной реакции на основе анализ мышиных кишечной микробиоты после устные лечения антибиотиками

The gut microbiota has a central influence on human health. Microbial dysbiosis is associated with many common immunopathologies such as inflammatory ...

Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform

Антибиотическая дерепликация с использованием платформы устойчивости к антибиотикам

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this ...