Name: quantitative examination of antibiotic susceptibility of neisseria gonorrhoeae aggregates using atp-utilization commercial assays and live/dead staining
Uploaded: 2019-02-08T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining at Jo

Este trabajo fue apoyado por una subvención del Instituto Nacional de salud para D.C.S. y W.S. AI123340. L.-C.W., J.W., A.C., y E.N. fueron apoyadas en parte o participar en el programa "La experiencia y de investigación primer año innovación" financiado por la Universidad de Maryland. Los fundadores no tenían ningún papel en el estudio de diseño, recopilación de datos y análisis, decisión de publicar o preparación del manuscrito. Reconocemos el UMD CBMG Imaging Core para todos los experimentos de microscopía.

1. general mantenimiento de cepas de GC
<ol><li>Raya de cepas de N. gonorrhoeae en el agar de GCK con 1% Kellogg suplementos18 (tabla 1, tabla 2) de las existencias de congelador e incubar a 37 ° C con 5% CO2 para 16-18 h. uso MS11 expresando fase variable Opa (MS11Opa +), no hay Opa (MS11ΔOpa), o a LOS truncada (MS11ΔLgtE).</li>
	<li>Cuidadosamente escoge pili negativo (Colonia sin borde oscuro) o positivo (Colonia con borde oscuro) colonias de cada cepa ...

<ol>
	<li>den Heijer, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+overview+of+urogenital,+anorectal+and+oropharyngeal+Neisseria+gonorrhoeae+testing+and+diagnoses+among+different+STI+care+providers:+a+cross-sectional+study.">A comprehensive overview of urogenital, anorectal and oropharyngeal Neisseria gonorrhoeae testing and diagnoses among different STI care providers: a cross-sectional study.</a> BMC Infectious Diseases. 17 (1), (2017).</li><li>Hein, K., Marks, A., Cohen, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymptomatic+gonorrhea:+prevalence+in+a+population+of+urban+adolescents.">Asymptomatic gonorrhea: prevalence in a population of urban adolescents.</a> The Journal of Pediatrics. 90 (4), 634-635 (1977).</li><li>Hananta, I. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gonorrhea+in+Indonesia:+High+Prevalence+of+Asymptomatic+Urogenital+Gonorrhea+but+No+Circulating+Extended+Spectrum+Cephalosporins-Resistant+Neisseria+gonorrhoeae+Strains+in+Jakarta,+Yogyakarta,+and+Denpasar,+Indonesia.">Gonorrhea in Indonesia: High Prevalence of Asymptomatic Urogenital Gonorrhea but No Circulating Extended Spectrum Cephalosporins-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strains in Jakarta, Yogyakarta, and Denpasar, Indonesia.</a> Sexually Transmitted Diseases. 43 (10), 608-616 (2016).</li><li>Chlamydia, W. H. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Opacity+Proteins+Interferes+with+the+Transmigration+of+Neisseria+gonorrhoeae.+across+Polarized+Epithelial+Cells.">Expression of Opacity Proteins Interferes with the Transmigration of Neisseria gonorrhoeae. across Polarized Epithelial Cells.</a> PLoS One. 10 (8), 0134342 (2015).</li><li>LeVan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+a+derivative+of+Neisseria+gonorrhoeae+strain+MS11+devoid+of+all+opa+genes.">Construction and characterization of a derivative of Neisseria gonorrhoeae strain MS11 devoid of all opa genes.</a> Journal of Bacteriology. 194 (23), 6468-6478 (2012).</li><li>Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. 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Pili and zones of adhesion: their relation to gonococcal growth patterns.</a> Journal of Experimental Medicine. 134 (4), 886-906 (1971).</li><li>Herten, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+in+Vitro+Quantification+of+S.+aureus+Biofilms+on+Vascular+Graft+Surfaces.">Rapid in Vitro Quantification of S. aureus Biofilms on Vascular Graft Surfaces.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 2333 (2017).</li><li>Gracia, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+development+of+Staphylococcus+aureus+biofilms+using+slime-producing+variants+and+ATP-bioluminescence+for+automated+bacterial+quantification.">In vitro development of Staphylococcus aureus biofilms using slime-producing variants and ATP-bioluminescence for automated bacterial quantification.</a> Luminescence. 14 (1), 23-31 (1999).</li><li>Webb, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+development.">Cell death in Pseudomonas aeruginosa biofilm development.</a> Journal of Bacteriology. 185 (15), 4585-4592 (2003).</li><li>Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+biofilm+formation+in+an+8-well+chamber+slide.">In vitro biofilm formation in an 8-well chamber slide.</a> Journal of visualized experiments. (47), (2011).</li><li>Wang, L. C., Litwin, M., Sahiholnasab, Z., Song, W., Stein, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neisseria+gonorrhoeae+Aggregation+Reduces+Its+Ceftriaxone+Susceptibility.">Neisseria gonorrhoeae Aggregation Reduces Its Ceftriaxone Susceptibility.</a> Antibiotics (Basel). 7 (2), (2018).</li><li>Lebeaux, D., Ghigo, J. M., Beloin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm-related+infections:+bridging+the+gap+between+clinical+management+and+fundamental+aspects+of+recalcitrance+toward+antibiotics.">Biofilm-related infections: bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 510-543 (2014).</li><li>Hall-Stoodley, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+diagnostic+guidelines+for+biofilm-associated+infections.">Towards diagnostic guidelines for biofilm-associated infections.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 65 (2), 127-145 (2012).</li></ol>

Las bacterias pueden formar biofilms durante la infección del ser humano. Prueba de MIC tradicionales puede no reflejar la concentración necesaria para erradicar las bacterias de la biopelícula. Para probar efectos antimicrobianos en un biofilm, métodos basados en la biomasa de biofilm como unidades formadoras de colonias de la galjanoplastia pueden ser erróneos debido al impacto de la estructura del biofilm. Por ejemplo, el método de placas sólo funciona si el biofilm puede ser interrumpido. Por lo tanto, la UFC ...

La gonorrea es que una común de transmisión sexual de infecciones (ITS)1. Neisseria gonorrhoeae (GC), una bacteria gram negativa de la diplococcal, es el agente causal de esta enfermedad. Los síntomas de la infección genital pueden resultar en dolor durante la micción, generalizado dolor genital y secreción uretral. La infección suele ser asintomática2,3,4,5, y esto permite la colonización extendida. Estas infecciones no tratadas son un problema de salud importante, ya que tienen el potencial para facilitar la transmisión del organismo y esto puede llevar a complicaciones como enfermedad pélvica inflamatoria (EPI) y diseminada infección gonocócica (DGI)6. Gonorrea resistente a los antibióticos es una crisis de salud pública importante y un aumento de la carga socioeconómica7. Reducida susceptibilidad a las cefalosporinas ha producido cambio de régimen de tratamiento de un antibiótico único a la terapia dual, que combina la azitromicina o doxiciclina con ceftriaxona8. El mayor fracaso de ceftriaxona y azitromicina9,10, en combinación con infecciones asintomáticas, destaca la necesidad de entender los fracasos de tratamiento de la gonorrea.
La prueba de la concentración mínima inhibitoria (CMI), incluyendo agar dilución y disco pruebas de difusión, se ha utilizado como la prueba médica estándar para la identificación de resistencia a un antibiótico. Sin embargo, no está claro si la prueba MIC refleja resistencia antibiótica bacteriana in vivo. La formación de biofilms bacterianos contribuye a la supervivencia de las bacterias en presencia de concentraciones bactericidas de antibiótico: la prueba de MIC es incapaz de detectar este efecto11. Porque la GC puede formar biofilms en superficies de la mucosa12, presumimos que antibiótico susceptibilidad dentro de agregados sería distinta al visto en GC individual. Además, los estudios han demostrado que las moléculas de superficie variable, Pili, opacidad asociada a proteina (Opa) de tres fases, y lipooligosaccharides (LOS), que regulan las interacciones entre bacterias, conducen a diferentes agregados tamaño13, 14 , 15. la contribución de estos componentes para resistencia a los antibióticos no ha sido examinada por la falta de métodos adecuados.
Actualmente, existen varios métodos para medir la eliminación del biofilm. El método cuantitativo más utilizado es mediante la medición de los cambios en la biomasa usando cristal violeta16la coloración. Sin embargo, el método requiere manipulación experimental importante, que potencialmente puede generar errores en el experimento se repite17. El método de coloración en vivo/muerto aquí permite la visualización de bacterias vivas y muertas y su distribución dentro de la biopelícula. Sin embargo, la estructura del biofilm puede plantear como una barrera física que reduce la penetración del tinte. Por lo tanto, para cuantificar las bacterias muertas o vivir dentro de un grupo, la tinción se limita a pequeñas biofilms o su precursor microcolonias o agregaciones. Otros métodos, incluyendo los agar dilución y disco pruebas de difusión, no son capaces de medir los efectos de la agregación. Para examinar la susceptibilidad de la GC dentro de la agregación después de la exposición a antibióticos, un método ideal necesitan tener tanto un ensayo que puede medir viven bacterias y visualizar su distribución.
El procedimiento descrito aquí combina una medida de la utilización del ATP y un vivo/muerto tinción análisis cuantitativo a y examinar visualmente la susceptibilidad de la GC dentro de agregados en presencia de antibióticos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:837px;" width="837">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">100x Kellogg&#39;s supplement</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Agar</td>
			<td style="width:229px;">United States Biological</td>
			<td style="width:119px;">A0930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">BacTiter Assay&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">G8232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Ceftriaxone</td>
			<td style="width:229px;">TCI</td>
			<td style="width:119px;">C2226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Difco GC medium base&#160;</td>
			<td style="width:229px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">228950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ferric nitrate, nonahydrate&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">254223-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td style="width:229px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP350-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine Crystalline Powder</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP379-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BacLight live/dead staining</td>
			<td style="width:229px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">L7012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MS11 Neisseria gonorrhoeae strain</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>kindly provided by Dr. Herman Schneider, Walter Reed Army Institute for Research</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:323px;">Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P290-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP329-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteose Peptone&#160;</td>
			<td style="width:229px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">211693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S671-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Soluble Starch</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S9765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thiamine pyrophosphate</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C8754-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Equipment</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Petri Dishes</td>
			<td style="width:229px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">25384-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">8-well coverslip-bottom chamber&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">155411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well tissue culture plates&#160;</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td style="width:119px;">3370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:323px;">Biosafety Cabinet (NU-425-600 Class II, A2 Laminar Flow Biohazard Hood)</td>
			<td style="width:229px;">Nuaire</td>
			<td style="width:119px;">32776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:323px;">CO2 Incubator</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">&#160;Model 3530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:323px;">Confocal microscope equipped with live imaging chamber</td>
			<td style="width:229px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">SP5X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning&#160; 96 Well Black Polystyrene Microplate&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Glomax Illuminator&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Pipette tips (0.1-10 &#181;L)</td>
			<td style="width:229px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-717-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipette tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:119px;">83007-382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Pipette tips (200 &#181;L)</td>
			<td style="width:229px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">53509-007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectrophotometer Ultrospec 2000 UV</td>
			<td style="width:229px;">Pharmacia Biotech</td>
			<td style="width:119px;">80-2106-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Sterile 15 ml conical tubes</td>
			<td style="width:229px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">21008-216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Sterile Microcentrifuge Tubes (1.7 mL)</td>
			<td style="width:229px;">Sorenson BioScience</td>
			<td style="width:119px;">16070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile polyester-tipped applicators</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:323px;">Sonicator</td>
			<td style="width:229px;">Kontes</td>
			<td style="width:119px;">Equivelent to 9110001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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quantitative examination of antibiotic susceptibility of neisseria gonorrhoeae aggregates using atp-utilization commercial assays and live/dead staining

La aparición de resistencia a antibióticos Neisseria gonorrhoeae (GC) es una amenaza para la salud en todo el mundo y destaca la necesidad de identificar a las personas que no tratamiento. Esta bacteria gram negativa causa gonorrea exclusivamente en los seres humanos. Durante la infección, son capaces de formar agregados o biofilms. La prueba de la concentración mínima inhibitoria (CMI) se utiliza para determinar la susceptibilidad a los antibióticos y para definir el tratamiento adecuado. Sin embargo, se desconoce el mecanismo de la erradicación en vivo y su relación con resultados de laboratorio. Se desarrolló un método que examina cómo la agregación GC afecta la sensibilidad a los antibióticos y muestra la relación entre el tamaño total y sensibilidad a los antibióticos. Cuando agregado de GC, son más resistentes a los antibióticos matanza, con las bacterias en el centro de sobrevivir ceftriaxona tratamiento mejor que los de la periferia. Los datos indican que la agregación de N. gonorrhoeae puede reducir su susceptibilidad a la ceftriaxona, que no se ve reflejado mediante los métodos de micro basados en placa de agar estándar. El método utilizado en este estudio permitirá a los investigadores probar susceptibilidad bacteriana bajo condiciones clínicamente relevantes.

Dos métodos fueron empleados: un análisis de utilización de ATP y una prueba de tinción vivo/muerto. Los resultados pueden combinar o utilizar individualmente para estudiaron la supervivencia bacteriana en agregados después del tratamiento antibiótico. Ha demostrado el análisis de utilización de ATP para medir exactamente viables bacterias en biofilms de S. aureus 20,21. Aquí, MS11Opa + Pil + cepa fue utilizado p...

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Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

Un simple análisis de la medición de ATP y live/dead tinción fueron utilizados para cuantificar y visualizar Neisseria gonorrhoeae supervivencia después del tratamiento con ceftriaxona. Este protocolo puede ser extendido para examinar los efectos antimicrobianos de cualquier antibiótico y puede usarse para definir la concentración inhibitoria mínima de antibióticos en biopelículas bacterianas.

Examen cuantitativo de susceptibilidad antibiótica de Neisseria gonorrhoeae utilización del ATP utilizando agregados comerciales ensayos y manchas de vivos/muertos

The emergence of antibiotic resistant Neisseria gonorrhoeae (GC) is a worldwide health threat and highlights the need to identify individuals who fail ...

Esta técnica nos permite medir la susceptibilidad a los antibióticos en condiciones clínicamente relevantes. La técnica también nos permite determinar la verdadera concentración de antibióticos que puede matar bacterias en áridos. Esta técnica se puede aplicar para determinar la concentración necesaria para eliminar los agregados GC.El método también se puede aplicar para medir la susceptibilidad antimicrobiana de cualquier bacteria que sea capaz de formar agregados. Preste atención a los pasos de la lelisis para asegurarse de que la lelisis está completa. De lo contrario, el ensayo de medición de ATP subestimará el número de bacterias viables.La visualización de este método permitirá a otros investigadores seguir y replicar este experimento con consistencia. Comience por rayar Neisseria gonorrhoeae, o cepas de GC, en el agar GCK complementado con 1%Kellogg para una incubación de 16 a 18 horas a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono. A la mañana siguiente, utilice un microscopio de luz para seleccionar cuidadosamente colonias pili-negativas sin bordes oscuros o colonias pili-positivas con bordes oscuros de cada plato, y rayar las colonias recogidas en nuevas placas GCK para un cultivo de 16 a 18 horas a 37 grados Celsius y 5% dióxido de carbono.A la mañana siguiente, utilice un aplicador estéril para recoger colonias de GC de cada plato y resuspender cada hisopo en caldo caliente complementado con 4.2%sodio bicarbonato y 1%Kellogg solución. Mida la densidad óptica a 650 nanómetros, o OD650, para determinar la concentración de las bacterias suspendidas y ajustar la concentración de GC a aproximadamente una por 10 a las ocho unidades formadoras de colonias por mililitro. A continuación, agregue 99 microlitros de la suspensión GC en pozos individuales de una placa de 96 pozos y permita que las bacterias se acumule a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono durante seis horas.Al final de la incubación, añadir un microlitro de ceftriaxona diluida en serie a cada pozo dejando algunos pozos sin tratar para servir como controles y devolver la placa a la incubadora durante otras 24 horas. Al día siguiente, sonicar la suspensión en cada pozo tres veces a 144 vatios y 20 kilohercios durante cinco segundos por sonicación y añadir 100 microlitros de reactivo de brillo de utilización de ATP disponible comercialmente a cada pozo. Transfiera cuidadosamente 150 microlitros de mezcla de cada pozo a pozos individuales de una nueva microplaca negra de 96 pocillos y mida la absorbancia de cada pozo a 560 nanómetros en un lector de placas.A continuación, calcular la tasa de supervivencia por la proporción de la lectura obtenida después del tratamiento antibiótico en serie a la lectura de los pozos no tratados. Para la visualización de los agregados GC vivos/muertos, utilice un aplicador estéril para recoger GC de las placas cultivadas durante la noche y resuspender el GC en medio GCP precalificado complementado con 1%Kellogg. Mida el OD650 por espectrofotometría y ajuste la concentración a aproximadamente una vez 10 a las siete unidades formadoras de colonias por mililitro.A continuación, añada 198 microlitros de suspensión GC en cámaras de ocho pozos de fondo de tapapso e incubar las cámaras a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante seis horas. Al final de la incubación, tratar las bacterias con dos microlitros de ceftriaxona por condición de agregación y devolver las cámaras a la incubadora para el período de incubación experimental adecuado. Al final de la incubación, añadir 0,6 microlitros de solución de tinción viva/muerta en cada pocóy que las cámaras vuelvan a la incubadora durante 20 minutos adicionales.A continuación, utilice un microscopio confocal para obtener imágenes de la serie z. Para medir el tamaño de los agregados GC, abra la primera imagen en ImageJ y seleccione líneas a mano alzada para rodear el área de cada agregación de la imagen. Haga clic en analizar y medir.El tamaño de los agregados se indicará en la columna de área. Para cuantificar la relación de intensidad de fluorescencia de la mancha viva a muerta en cada agregado, haga clic en analizar y establecer mediciones y compruebe la densidad integrada en la ventana emergente. Haga clic en Aceptar y haga clic en la herramienta imagen, color y canales.Seleccione el color y el canal uno como la fluorescencia para la tinción de bacterias muertas. Seleccione líneas a mano alzada para rodear el área de cada agregación y haga clic en analizar y medir para obtener la relación de intensidad de fluorescencia para cada agregado en la columna de densidad integrada. Seleccione el canal dos para la fluorescencia para la tinción bacteriana viva y mida la intensidad de la fluorescencia en cada agregado como acaba de demostrar.A continuación, divida los datos de intensidad de fluorescencia en vivo por los datos de intensidad de fluorescencia muertos para obtener la relación de intensidad de fluorescencia viva a muerta. En este experimento representativo, las bacterias pili positivas no agregadas, positivas o agregadas y alteradas pili positivas fueron tratadas con diluciones en serie de ceftriaxona antes de la medición de sus niveles de ATP. El GC preagregado demostró una supervivencia significativamente mayor que la GC no agregada o la agregación interrumpida cuando se trata con concentraciones iguales de ceftriaxona o superior.Las cepas Pili-positivas que forman agregados más grandes mostraron los niveles más altos de ATP después del tratamiento con ceftriaxona en comparación con las cepas mutantes. Independientemente de la cepa probada, la tinción viva/muerta antes de que el tratamiento con antibióticos revelara bacterias muertas ubicadas en gran medida en las capas externas del cultivo, mientras que la GC viva se identificó principalmente dentro del núcleo de los agregados tratados con ceftriaxona. Como era de esperar, las bacterias pili-positivas formaron los agregados más grandes, mientras que los cultivos pili-negativos formaron los más pequeños.En particular, los agregados pili-positivos todavía estaban vivos en sus capas principales después del tratamiento con antibióticos, mientras que GC en los pequeños agregados mutantes sueltos estaban muertos. Basado en el tamaño y la supervivencia del GC, se puede trazar un gráfico de correlación para examinar la relación entre el tamaño de agregación y la supervivencia de los antibióticos de las bacterias. La sonicación es importante para asegurarse de que el ATP de cada bacteria individual se libera dentro de los agregados estrechamente unidos.De lo contrario, las mediciones no serán coherentes. Es importante planchar las bacterias después de que se agregan y son tratadas con antibióticos para medir tanto las bacterias viables como las capaces de replicación. La técnica mide la influencia de la agregación de bacterias en la susceptibilidad a los antibióticos permitiendo a los investigadores desarrollar mejores fármacos para el tratamiento de enfermedades.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

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El examen de los telómeros G-Estructura en voladizo Trypanosoma brucei

The telomere G-overhang structure has been identified in many eukaryotes including yeast, vertebrates, and Trypanosoma brucei. It serves as the substrate ...

Investigación

Inmunología e Infección

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &alpha;-actinin by Confocal Imaging

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human ÃƒÅ½Ã‚Â±-actinin by Confocal Imaging

La visualización y cuantificación de interacciones intracelulares de Neisseria meningitidis Humanos y α-actinina de imagen confocal

The Opc protein of Neisseria meningitidis (Nm, meningococcus) is a surface-expressed integral outer membrane protein, which can act as an adhesin and an ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

El análisis cuantitativo de todos Influenza Tipo A Hemaglutininas viral y neuraminidasas el uso de anticuerpos Universal en simples ensayos Slot Blot

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

El examen de selección tímica positivo y negativo por citometría de flujo

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign  antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the  T cell ...

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Preparación de una Cultura de pellets de sangre para Rapid bacteriana Identificación y Prueba de Susceptibilidad a los antibióticos

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Los ensayos cualitativos y cuantitativos para la detección y caracterización de proteínas de antimicrobianos

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Orientación de Biofilm Asociadas<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Uso de Ensayo de susceptibilidad a fármacos Basado resazurina

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority ...

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

El examen de los fenotipos de acogida en<em&gt; Gambusia affinis</em&gt; Tratamiento antibiótico Siguiendo

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host ...

Quantitative Polymerase Chain Reaction-based Analyses of Murine Intestinal Microbiota After Oral Antibiotic Treatment

Cuantitativa de polimerasa análisis reacción-basado cadena de la Microbiota Intestinal murino después del tratamiento antibiótico Oral

The gut microbiota has a central influence on human health. Microbial dysbiosis is associated with many common immunopathologies such as inflammatory ...

Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform

Desreplicación de antibióticos utilizando la plataforma de resistencia a antibióticos

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this ...