Name: quantitative examination of antibiotic susceptibility of neisseria gonorrhoeae aggregates using atp-utilization commercial assays and live/dead staining
Uploaded: 2019-02-08T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining at Jo

Detta arbete stöds av ett stipendium från National Institute of Health att D.C.S. och W.S. AI123340. L.-C.W., J.W., A.C., och E.N. stöddes i del/delta i ”The första årets Innovation & forskning Experience”-programmet finansieras av University of Maryland. Finansiärerna hade ingen roll i studie design, datainsamling och analys, beslut om att offentliggöra, eller beredning av manuskriptet. Vi erkänner UMD CBMG Imaging kärnan för alla mikroskopi experiment.

1. allmänt underhåll av GC stammar
<ol><li>Strimma N. gonorrhoeae stammar på GCK agar med 1% Kellogg kompletterar18 (tabell 1, tabell 2) från frys bestånd och inkubera 37 ° C med 5% CO2 för 16-18 h. användning MS11 uttrycker fas-variabel Opa (MS11Opa +), ingen Opa (MS11ΔOpa), eller en stympad LOS (MS11ΔLgtE).</li>
	<li>Försiktigt plocka pili negativa (koloni utan mörk kant) eller positiva (koloni med mörk kant) kolonier från varje stam baserat p...

<ol>
	<li>den Heijer, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+overview+of+urogenital,+anorectal+and+oropharyngeal+Neisseria+gonorrhoeae+testing+and+diagnoses+among+different+STI+care+providers:+a+cross-sectional+study.">A comprehensive overview of urogenital, anorectal and oropharyngeal Neisseria gonorrhoeae testing and diagnoses among different STI care providers: a cross-sectional study.</a> BMC Infectious Diseases. 17 (1), (2017).</li><li>Hein, K., Marks, A., Cohen, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymptomatic+gonorrhea:+prevalence+in+a+population+of+urban+adolescents.">Asymptomatic gonorrhea: prevalence in a population of urban adolescents.</a> The Journal of Pediatrics. 90 (4), 634-635 (1977).</li><li>Hananta, I. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gonorrhea+in+Indonesia:+High+Prevalence+of+Asymptomatic+Urogenital+Gonorrhea+but+No+Circulating+Extended+Spectrum+Cephalosporins-Resistant+Neisseria+gonorrhoeae+Strains+in+Jakarta,+Yogyakarta,+and+Denpasar,+Indonesia.">Gonorrhea in Indonesia: High Prevalence of Asymptomatic Urogenital Gonorrhea but No Circulating Extended Spectrum Cephalosporins-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strains in Jakarta, Yogyakarta, and Denpasar, Indonesia.</a> Sexually Transmitted Diseases. 43 (10), 608-616 (2016).</li><li>Chlamydia, W. H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlamydia+trachomatis,+Neisseria+gonorrhoeae,+syphilis+and+Trichomonas+vaginalis.+Methods+and+results+used+by+WHO+to+generate+2005+estimates.+World+Health+Organisation,+2011.+Prevalence+and+incidence+of+selected+sexually+transmitted+infections.">Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, syphilis and Trichomonas vaginalis. Methods and results used by WHO to generate 2005 estimates. World Health Organisation, 2011. Prevalence and incidence of selected sexually transmitted infections.</a> World Health Organisation. , (2011).</li><li>Mayor, M. T., Roett, M. A., Uduhiri, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+management+of+gonococcal+infections.">Diagnosis and management of gonococcal infections.</a> American Family Physician. 86 (10), 931-938 (2012).</li><li>Alirol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidrug-resistant+gonorrhea:+A+research+and+development+roadmap+to+discover+new+medicines.">Multidrug-resistant gonorrhea: A research and development roadmap to discover new medicines.</a> PLOS Medicine. 14 (7), (2017).</li><li>Workowski, K. A., Bolan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexually+transmitted+diseases+treatment+guidelines,+2015.">Sexually transmitted diseases treatment guidelines, 2015.</a> MMWR Recommendations and Reports. 64, 1-137 (2015).</li><li>Lahra, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+Recognition+of+Internationally+Disseminated+Ceftriaxone-Resistant+Neisseria+gonorrhoeae+Strain.">Cooperative Recognition of Internationally Disseminated Ceftriaxone-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strain.</a> Emerging Infectious Diseases. 24 (4), (2018).</li><li>Wi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+resistance+in+Neisseria+gonorrhoeae:+Global+surveillance+and+a+call+for+international+collaborative+action.">Antimicrobial resistance in Neisseria gonorrhoeae: Global surveillance and a call for international collaborative action.</a> PLOS Medicine. 14 (7), 1002344 (2017).</li><li>Singh, S., Singh, S. K., Chowdhury, I., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+Mechanism+of+Bacterial+Biofilms+Resistance+to+Antimicrobial+Agents.">Understanding the Mechanism of Bacterial Biofilms Resistance to Antimicrobial Agents.</a> Open Microbiology Journal. 11, 53-62 (2017).</li><li>Greiner, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+Formation+by+Neisseria+gonorrhoeae.">Biofilm Formation by Neisseria gonorrhoeae.</a> Infection and Immunity. 73 (4), 1964-1970 (2005).</li><li>Zollner, R., Oldewurtel, E. R., Kouzel, N., Maier, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+and+antigenic+variation+govern+competition+dynamics+through+positioning+in+bacterial+colonies.">Phase and antigenic variation govern competition dynamics through positioning in bacterial colonies.</a> Scientific Reports. 7 (1), (2017).</li><li>Stein, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Opacity+Proteins+Interferes+with+the+Transmigration+of+Neisseria+gonorrhoeae.+across+Polarized+Epithelial+Cells.">Expression of Opacity Proteins Interferes with the Transmigration of Neisseria gonorrhoeae. across Polarized Epithelial Cells.</a> PLoS One. 10 (8), 0134342 (2015).</li><li>LeVan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+a+derivative+of+Neisseria+gonorrhoeae+strain+MS11+devoid+of+all+opa+genes.">Construction and characterization of a derivative of Neisseria gonorrhoeae strain MS11 devoid of all opa genes.</a> Journal of Bacteriology. 194 (23), 6468-6478 (2012).</li><li>Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+and+analyzing+static+biofilms.">Growing and analyzing static biofilms.</a> Curr Protoc Microbiol. , (2005).</li><li>Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+multiple+methods+for+quantification+of+microbial+biofilms+grown+in+microtiter+plates.">Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates.</a> Journal of Microbiological Methods. 72 (2), 157-165 (2008).</li><li>White, L. A., Kellogg, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neisseria+Gonorrhoeae+Identification+in+Direct+Smears+by+a+Fluorescent+Antibody-Counterstain+Method.">Neisseria Gonorrhoeae Identification in Direct Smears by a Fluorescent Antibody-Counterstain Method.</a> Journal of Applied Microbiology. 13, 171-174 (1965).</li><li>Swanson, J., Kraus, S. J., Gotschlich, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+gonococcus+infection.+I.+Pili+and+zones+of+adhesion:+their+relation+to+gonococcal+growth+patterns.">Studies on gonococcus infection. I. Pili and zones of adhesion: their relation to gonococcal growth patterns.</a> Journal of Experimental Medicine. 134 (4), 886-906 (1971).</li><li>Herten, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+in+Vitro+Quantification+of+S.+aureus+Biofilms+on+Vascular+Graft+Surfaces.">Rapid in Vitro Quantification of S. aureus Biofilms on Vascular Graft Surfaces.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 2333 (2017).</li><li>Gracia, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+development+of+Staphylococcus+aureus+biofilms+using+slime-producing+variants+and+ATP-bioluminescence+for+automated+bacterial+quantification.">In vitro development of Staphylococcus aureus biofilms using slime-producing variants and ATP-bioluminescence for automated bacterial quantification.</a> Luminescence. 14 (1), 23-31 (1999).</li><li>Webb, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+development.">Cell death in Pseudomonas aeruginosa biofilm development.</a> Journal of Bacteriology. 185 (15), 4585-4592 (2003).</li><li>Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+biofilm+formation+in+an+8-well+chamber+slide.">In vitro biofilm formation in an 8-well chamber slide.</a> Journal of visualized experiments. (47), (2011).</li><li>Wang, L. C., Litwin, M., Sahiholnasab, Z., Song, W., Stein, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neisseria+gonorrhoeae+Aggregation+Reduces+Its+Ceftriaxone+Susceptibility.">Neisseria gonorrhoeae Aggregation Reduces Its Ceftriaxone Susceptibility.</a> Antibiotics (Basel). 7 (2), (2018).</li><li>Lebeaux, D., Ghigo, J. M., Beloin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm-related+infections:+bridging+the+gap+between+clinical+management+and+fundamental+aspects+of+recalcitrance+toward+antibiotics.">Biofilm-related infections: bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 510-543 (2014).</li><li>Hall-Stoodley, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+diagnostic+guidelines+for+biofilm-associated+infections.">Towards diagnostic guidelines for biofilm-associated infections.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 65 (2), 127-145 (2012).</li></ol>

Bakterier kan bilda biofilmer under infektion av den mänskliga kroppen. Traditionella MIC tester kanske inte återspeglar den koncentration som behövs för att utrota bakterier i en biofilm. För att testa antimikrobiella effekter på en biofilm, kan metoder baserade på biofilm biomassa samt plätering CFUs vara felaktiga på grund av effekterna av biofilm struktur. Till exempel fungerar plätering metoden bara om biofilmen kan störas. Den CFU erhålls kan därför vara lägre än det faktiska antalet livskraftiga ba...

Gonorré är en gemensam sexuellt överförbara infektioner (STI)1. Neisseria gonorrhoeae (GC), en gramnegativa diplococcal bakterie, är vilka smittämnen av denna sjukdom. Symtomen vid genital infektion kan leda till smärta vid urinering, generaliserad genital smärta och urinrörets ansvarsfrihet. Infektionen är ofta asymtomatiska2,3,4,5, och Detta tillåter för utökade kolonisering. Dessa obehandlade infektioner är ett betydande hälsoproblem, eftersom de har potential att underlätta överföring av organismen och detta kan leda till komplikationer såsom inflammatoriska sjukdomar (PID) och spridas uretra infektion (DGI)6. Antibiotikaresistenta gonorré är en större folkhälsokris och en ökande socioekonomisk börda7. Minskad känslighet för cefalosporiner har resulterat i behandlingsregim förändring från en enda antibiotika till dubbla terapi, som kombinerar azitromycin eller doxycyklin med ceftriaxon8. Ceftriaxon och azitromycin9,10, i kombination med asymtomatiska infektioner, ökad misslyckande belyser behovet av förståelse gonorré behandling misslyckanden.
Den minsta hämmande koncentrationen (MIC) test, inklusive agar utspädning och skiva diffusion tester, har använts som standard medicinsk test för att identifiera motstånd mot ett antibiotikum. Det är dock oklart om MIC testet återspeglar bakteriell antibiotikaresistens invivo. Bildandet av bakteriell biofilm bidrar till överlevnaden av bakterier i närvaro av bactericidal koncentrationer av antibiotika: MIC testning är inte upptäcka denna effekt11. Eftersom GC kan bilda biofilmer på slemhinnorna12, vi hypotes att antibiotika känslighet inom aggregat skulle vara annorlunda än sett i enskilda GC. Dessutom, har studier visat att trefas variabel yta molekyler, Pili, opacitet-associerade protein (Opa), och lipooligosaccharides (LOS), som reglerar mellan bakterien interaktioner, leda till olika storlek aggregat13, 14 , 15. bidraget av dessa komponenter till antibiotikaresistens har inte undersökts på grund av avsaknaden av lämpliga metoder.
För närvarande finns det flera metoder att mäta biofilm utrotning. Den mest använda kvantitativa metoden är genom att mäta förändringar i biomassa med hjälp av kristallviolett färgning16. Metoden kräver dock betydande experimentella manipulation, som potentiellt kan generera fel i experimentet upprepas17. Den live/dead färgningsmetod som används här tillåter visualisering av levande och döda bakterier och deras fördelning inom biofilmen. Dock kan biofilm struktur posera som en fysisk barriär som minskar dye penetration. Därför, för att kvantifiera live/dead bakterier inom en grupp, färgningen är begränsad till små biofilmer eller dess föregångare-microcolonies eller aggregeringar. Andra metoder, inklusive agar utspädning och skiva diffusion testerna, är inte kunna mäta effekterna av aggregering. För att undersöka GC känslighet inom aggregering efter antibiotika exponering, en idealisk metod skulle måste för att ha både en kvantitativ analys som kan mäta levande bakterier och visualisera deras fördelning.
Proceduren som beskrivs här kombinerar en ATP-utnyttjande-mätning och en live/dead färgning assay att kvantitativt och visuellt undersöka GC känslighet inom aggregat i närvaro av antibiotika.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:837px;" width="837">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">100x Kellogg&#39;s supplement</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Agar</td>
			<td style="width:229px;">United States Biological</td>
			<td style="width:119px;">A0930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">BacTiter Assay&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">G8232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Ceftriaxone</td>
			<td style="width:229px;">TCI</td>
			<td style="width:119px;">C2226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Difco GC medium base&#160;</td>
			<td style="width:229px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">228950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ferric nitrate, nonahydrate&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">254223-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td style="width:229px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP350-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine Crystalline Powder</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP379-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BacLight live/dead staining</td>
			<td style="width:229px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">L7012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MS11 Neisseria gonorrhoeae strain</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>kindly provided by Dr. Herman Schneider, Walter Reed Army Institute for Research</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:323px;">Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P290-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP329-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteose Peptone&#160;</td>
			<td style="width:229px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">211693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S671-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Soluble Starch</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S9765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thiamine pyrophosphate</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C8754-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Equipment</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Petri Dishes</td>
			<td style="width:229px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">25384-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">8-well coverslip-bottom chamber&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">155411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well tissue culture plates&#160;</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td style="width:119px;">3370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:323px;">Biosafety Cabinet (NU-425-600 Class II, A2 Laminar Flow Biohazard Hood)</td>
			<td style="width:229px;">Nuaire</td>
			<td style="width:119px;">32776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:323px;">CO2 Incubator</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">&#160;Model 3530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:323px;">Confocal microscope equipped with live imaging chamber</td>
			<td style="width:229px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">SP5X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning&#160; 96 Well Black Polystyrene Microplate&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Glomax Illuminator&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Pipette tips (0.1-10 &#181;L)</td>
			<td style="width:229px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-717-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipette tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:119px;">83007-382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Pipette tips (200 &#181;L)</td>
			<td style="width:229px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">53509-007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectrophotometer Ultrospec 2000 UV</td>
			<td style="width:229px;">Pharmacia Biotech</td>
			<td style="width:119px;">80-2106-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Sterile 15 ml conical tubes</td>
			<td style="width:229px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">21008-216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Sterile Microcentrifuge Tubes (1.7 mL)</td>
			<td style="width:229px;">Sorenson BioScience</td>
			<td style="width:119px;">16070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile polyester-tipped applicators</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:323px;">Sonicator</td>
			<td style="width:229px;">Kontes</td>
			<td style="width:119px;">Equivelent to 9110001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative examination of antibiotic susceptibility of neisseria gonorrhoeae aggregates using atp-utilization commercial assays and live/dead staining

Uppkomsten av antibiotikaresistenta Neisseria gonorrhoeae (GC) är en världsomspännande hälsorisk och belyser behovet av att identifiera individer som misslyckas behandling. Denna gramnegativa bakterie orsakar gonorré uteslutande hos människor. Under infektion är det kunna bilda aggregat eller biofilmer. Det minsta hämmande koncentrationen (MIC) testet används för att fastställa känslighet för antibiotika och fastställa lämplig behandling. Mekanismen av utrotning i vivo och dess relation till laboratorieresultat är dock inte kända. En metod som undersöker hur GC aggregering påverkar Antibiotikakänslighet och visar förhållandet mellan sammanlagda storlek och Antibiotikakänslighet utvecklades. När GC samlade, de är mer motståndskraftiga mot antibiotika dödande, överlevande med bakterier i stadens ceftriaxon behandling bättre än de i periferin. Data visar att N. gonorrhoeae aggregation kan minska dess känslighet för ceftriaxon, vilket inte speglas med standard agar plattan-baserade MIC metoder. Den metod som används i denna studie gör att forskare att testa bakteriell känslighet under kliniskt relevanta förhållanden.

Två metoder var anställda: ett ATP utilization test och en live/dead färgning assay. Resultaten kan antingen tillsammans eller individuellt används för att undersöka bakteriell överlevnad inom aggregat efter antibiotikabehandling. ATP utilization analysen har visat att mäta exakt livskraftiga bakterier i S. aureus biofilmer20,21. Här, användes MS11Opa + Pil + stam för att undersöka rollen som GC aggregation i ...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining at Jo

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

En enkel mätning av ATP-analysen och live/dead färgning metod användes för att kvantifiera och visualisera Neisseria gonorrhoeae överlevnad efter behandling med ceftriaxon. Detta protokoll kan utvidgas till att undersöka de antimikrobiella effekterna av alla antibiotika och kan användas för att definiera den minsta hämmande koncentrationen av antibiotika i bakteriell biofilm.

Kvantitativ undersökning av antibiotikakänsligheten hos Neisseria gonorrhoeae aggregat använder ATP-utnyttjande kommersiella analyser och Live/Dead färgning

The emergence of antibiotic resistant Neisseria gonorrhoeae (GC) is a worldwide health threat and highlights the need to identify individuals who fail ...

Denna teknik gör det möjligt för oss att mäta antibiotika känslighet under mer kliniskt relevanta förhållanden. Tekniken gör det också möjligt för oss att bestämma den sanna antibiotikakoncentrationen som kan döda bakterier i ballast. Denna teknik kan tillämpas för att bestämma den koncentration som behövs för att eliminera GC aggregat.Metoden kan också tillämpas för att mäta antimikrobiell mottaglighet för alla bakterier som kan bilda aggregat. Var noggrann uppmärksamhet på lysis stegen för att säkerställa att lysen är klar. Annars ATP mätanalys kommer att underskatta antalet livskraftiga bakterier.Visualisering av denna metod kommer att tillåta andra forskare att följa och replikera detta experiment med konsekvens. Börja med strimmor Neisseria gonorré, eller GC stammar, på GCK agar kompletteras med 1%Kellogg för en 16 till 18-timmars inkubation vid 37 grader Celsius och 5%koldioxid. Nästa morgon, använd ett ljusmikroskop för att noggrant välja pili-negativa kolonier utan mörka kanter eller pili-positiva kolonier med mörka kanter från varje platta, och strimma de plockade kolonierna på nya GCK-plattor för en 16 till 18-timmarskultur vid 37 grader Celsius och 5%koldioxid.Nästa morgon, använd en steril applikator för att samla GC kolonier från varje platta och resuspend varje kompress i varm buljong kompletteras med 4,2%natriumbikarbonat och 1%Kellogg lösning. Mät den optiska densiteten vid 650 nanometer, eller OD650, för att bestämma koncentrationen av de upphängda bakterierna och justera GC-koncentrationen till ungefär en gång 10 till de åtta kolonibildande enheterna per milliliter. Därefter lägger du till 99 mikroliter av GC-suspensionen i enskilda brunnar av en 96-brunnsplatta och låter bakterierna samlas vid 37 grader Celsius och 5%koldioxid i sex timmar.I slutet av inkubationen, tillsätt en mikroliter av seriellt utspädd ceftriaxon till varje brunn lämnar några brunnar obehandlade att fungera som kontroller och returnera plattan till inkubatorn i ytterligare 24 timmar. Nästa dag, sonicate suspensionen i varje brunn tre gånger på 144 watt och 20 kilohertz i fem sekunder per ultraljudsbehandling och lägga till 100 mikroliter av kommersiellt tillgängliga ATP utnyttjande glöd reagens till varje brunn. Överför försiktigt 150 mikroliter av blandning från varje brunn in i enskilda brunnar av en ny 96-väl svart mikroplatta och mäta absorbansen för varje brunn vid 560 nanometer på en tallriksläsare.Beräkna sedan överlevnadsgraden genom förhållandet mellan det avläsning som erhålls efter seriell antibiotikabehandling och avläsningen från de obehandlade brunnarna. För visualisering av levande / döda GC aggregat, använd en steril applikator för att samla in GC från natten odlade plattor och resuspend GC i förkrigade GCP medium kompletteras med 1%Kellogg. Mät OD650 genom spektrofotometri och justera koncentrationen till ungefär en gånger 10 till de sju kolonibildande enheterna per milliliter.Därefter lägger du till 198 mikroliter av GC-suspension i åtta-brunns-coverslip-bottenkammare och inkubera kamrarna i 37 grader Celsius och 5%koldioxid i sex timmar. Vid slutet av inkubationen, behandla bakterierna med två mikroliter av ceftriaxon per aggregering skick och återföra kamrarna till inkubatorn för lämplig experimentell inkubationstid. I slutet av inkubationen, tillsätt 0,6 mikroliter av levande / död färgningslösning i varje brunn och returnera kamrarna till inkubatorn i ytterligare 20 minuter.Använd sedan ett konfokalmikroskop för att få bilder i Z-serien. För mätning av storleken på GC-aggregaten öppnar du den första bilden i ImageJ och väljer frihandslinjer för att ringa in området för varje aggregering i bilden. Klicka på analysera och mäta.Storleken på aggregaten kommer att anges under areakolumnen. För kvantifiering av fluorescens intensitet förhållandet mellan levande till döda färgning i varje aggregat, klicka på analysera och ställa in mätningar och kontrollera den integrerade densiteten i popup fönstret. Klicka på OK och klicka på bild, färg och kanaler verktyg.Välj färg och kanal en som fluorescens för döda bakterier färgning. Välj frihandslinjer för att ringa in området för varje aggregering och klicka på Analysera och mät för att erhålla fluorescensintensitetsförhållandet för varje aggregat i kolumnen integrerad densitet. Välj kanal två för fluorescensen för den levande bakteriefärgningen och mät fluorescensintensiteten i varje aggregat som just visats.Dela sedan upp livefluorescensintensitetsdata efter de döda fluorescensintensitetsdatan för att få live till död fluorescensintensitetsförhållande. I detta representativa experiment behandlades icke aggregerade pili positiva, aggregerade pili positiva eller aggregerade och störda pili positiva bakterier med serieutspädningar av ceftriaxon före mätning av deras ATP-nivåer. Preaggregerad GC påvisade en signifikant högre överlevnad än icke-aggregerade eller aggregeringsstörtande GC vid behandling med lika stora koncentrationer av ceftriaxon eller högre.Pili-positiva stammar som bildar större aggregat uppvisade de högsta ATP nivåerna efter ceftriaxone behandling jämfört med de muterade stammarna. Oavsett stam testas, levande/döda färgning innan antibiotikabehandling visade döda bakterier till stor del ligger vid de yttre skikten av kulturen, medan levande GC identifierades främst inom kärnan i ceftriaxone-behandlade aggregat. Som väntat bildade pili-positiva bakterier de största aggregaten, medan pili-negativa kulturer utgjorde den minsta.Särskilt var pili-positiva aggregat fortfarande vid liv i sina kärnlager efter antibiotikabehandling, medan GC i de små, lösa mutantaggregaten var döda. Baserat på storleken och överlevnaden av GC, en korrelation graf kan ritas för att undersöka förhållandet mellan aggregering storlek och antibiotika överlevnad av bakterierna. Ultraljudsbehandling är viktigt för att se till att ATP från varje enskild bakterie frigörs inom de tätt bundna aggregat.Annars kommer mätningarna inte att vara konsekventa. Det är viktigt att platta bakterierna efter att de aggregerar och behandlas med antibiotika för att mäta både livskraftiga och de replikeringsdugliga bakterierna. Tekniken mäter bakterier aggregering inflytande på antibiotika känslighet tillåter forskare att utveckla bättre läkemedel för behandling av sjukdomar.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

Undersökning av Telomer G-överhäng Struktur i Trypanosoma brucei</em

The telomere G-overhang structure has been identified in many eukaryotes including yeast, vertebrates, and Trypanosoma brucei. It serves as the substrate ...

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &alpha;-actinin by Confocal Imaging

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human ÃƒÅ½Ã‚Â±-actinin by Confocal Imaging

Visualisering och kvantifiering av intracellulära interaktioner av Neisseria meningitidis Och mänskliga α-actinin av Confocal Imaging

The Opc protein of Neisseria meningitidis (Nm, meningococcus) is a surface-expressed integral outer membrane protein, which can act as an adhesin and an ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Kvantitativa analyser av alla influensa typ A Viral Hemagglutinins och neuroaminidaser använda Universal antikroppar i enkla mätmetoder Slot Blot

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

Undersökning av thymus Positiv och negativ selektion genom flödescytometri

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign  antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the  T cell ...

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Framställning av en Blood Culture Pellet för Rapid Bacterial Identifiering och Antibiotikum resistensbestämning

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Kvalitativa och kvantitativa analyser för att upptäcka och karakterisering av protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Inriktnings Biofilm Associated<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Använda Resazurin baserade läkemedlet-känslighet analys

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority ...

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

Undersökning av värd Fenotyper i<em&gt; Gambusia affinis</em&gt; Efter antibiotikabehandling

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host ...

Quantitative Polymerase Chain Reaction-based Analyses of Murine Intestinal Microbiota After Oral Antibiotic Treatment

Kvantitativa Polymerase Chain Reaction-baserade analyser av murina tarmens bakterieflora efter Oral antibiotikabehandling

The gut microbiota has a central influence on human health. Microbial dysbiosis is associated with many common immunopathologies such as inflammatory ...

Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform

Antibiotikum Dereplication med hjälp av antibiotikaresistens plattform

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this ...